Revista Mexicana de Ciencias Farmacéuticas

ISSN: 1870-0195
rmcf@[Link]
Asociación Farmacéutica Mexicana, A.C.
México

Aoki M., Kazuko; Encarnación-Dimayuga, Rosalba; Cortés A., Alma Rosa

Evaluación toxicológica de productos naturales usando microtécnicas
Revista Mexicana de Ciencias Farmacéuticas, vol. 36, núm. 1, enero-marzo, 2005, pp. 11-17
Asociación Farmacéutica Mexicana, A.C.
Distrito Federal, México

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Trabajo científico

Evaluación toxicológica
de productos naturales usando microtécnicas
Toxicological evaluation of natural products using microtechnics
Kazuko Aoki M.1, Rosalba Encarnación-Dimayuga2, Alma Rosa Cortés A1.
1
Departamento de Sistemas Biológicos, Universidad Autónoma Metropolitana- Xochimilco
2
Departamento de Agronomía, Universidad Autónoma de Baja California Sur

RESUMEN: dado que la toxicidad de las plantas medicinales usadas en la medicina tradicional necesita ser estudiada, se deter-
minaron los efectos tóxicos de diferentes extractos obtenidos de cuatro productos naturales de Baja California Sur (México):
Lepechinia hastata (Lamiaceae), Haplopappus sonorensis (Asteraceae), Lophocereus schottii (Cactaceae) y un animal marino
Lophogorgia rigida (Gorgonaceae), por medio de microtécnicas, usando 2 microorganismos invertebrados: Daphnia magna
(crustáceo) y Panagrellus redivivus (nemátodo). Los resultados se compararon con la toxicidad determinada en ratones CFW,
concluyendo que los micro-bioensayos pueden servir para explorar el grado de afectación o toxicidad de las muestras, o como
una prueba adicional a las realizadas con los métodos clásicos, ya que los resultados analizados muestran que existe cierto
grado de correlación entre la toxicidad determinada usando microtécnicas con respecto a la determinada en ratones CFW.

ABSTRACT: considering that the toxicity of many medicinal plants used in the traditional medicine needs to be studied in a
cheap and quick way, the toxic effect of different extracts from four natural products from Baja California Sur (Mexico): Le-
pechinia hastata (Lamiaceae), Haplopappus sonorensis (Asteraceae), Lophocereus schottii (Cactaceae) and the marine animal
Lophogorgia rigida (Gorgonaceae) were tested by two microtechnics bioassay using two microorganisms, the crustacean
Daphnia magna and the nematode Panagrellus redivivus, which toxicity were compared with in CFW mouse. These bioassays
help in prescreening studies and as additional test, seeing that it perceives some correlation of the toxic effect obtained using
invertebrates and mammals.

Palabras clave: Microtécnicas, evaluación toxicológica, Daphnia Key words: Microtechnics, toxicological evaluation, Daphnia magna,
magna, Panagrellus redivivus, ratones, extractos orgánicos, productos Panagrellus redivivus, mice, organic extracts, natural products.
naturales.

Introducción
Correspondencia:
Durante siglos, los humanos nos hemos auxiliado de la natu-
Alma Rosa Cortés A.
raleza para satisfacer las necesidades básicas como: vestimenta,
Departamento de Sistemas Biológicos,
uso de fertilizantes, condimentos, fragancias, alimentación y
Universidad Autónoma Metropolitana- Xochimilco,
medicamentos. Las plantas han constituido la base para el de-
Calzada del Hueso 1100, Col. Villa Quietud,
sarrollo de la medicina tradicional aplicada desde hace miles de
CP 04960, México, D.F.
años en países como México.
Teléfono: 5483-7213 Fax: 54837237
Correo electrónico: cortesar@[Link]
El uso de plantas y de ciertos animales marinos en la práctica
popular para la cura de enfermedades en Baja California Sur ha
sido extensamente documentada y publicada en el año1992 por
Fecha de recepción: 16 de diciembre de 2003
Encarnación1, y han jugado un papel importante en el Sistema
Fecha de aceptación: 27 de junio de 2004
de Atención de la Salud. Recientemente, su uso ha ido incre-

11
Volumen 36 • No. 1 • enero - marzo 2005

mentándose tanto en los países en proceso de desarrollo como remedio contra infecciones vaginales (no urinarias) contiene
en aquellos desarrollados, por lo que ha surgido el interés y la como compuesto mayoritarios carnosol, β-hidroxi-carnosol y
urgencia por determinar tanto su eficacia real como su seguridad metabolitos de estructura diterpenoide con una potente activi-
e inocuidad cuando son aplicados en la medicina tradicional de dad antimicrobiana,10-12 además de ácido ursólico cuya actividad
diferentes comunidades, por lo tanto, es importante llevar a cabo antiinflamatoria ha sido reportada;13 L. schottii, conocida como
el estudio toxicológico de estos recursos. senita o garambullo es empleado comúnmente para la diabetes,
úlceras, llagas, malestares estomacales1 y fue seleccionada por
Estudios publicados en décadas recientes, sugieren que un contener compuestos bioactivos como una tetrahidroisoquinolina
primer rastreo toxicológico pudiera llevarse a cabo con pruebas denominada lofocina que presenta actividad anticancerígena;14-16
de toxicidad agudas empleando invertebrados2, lo cual puede ser y el coral marino L. rigida, fuente de una potente neurotoxina,
útil como un estudio preliminar en la evaluación de la toxicidad la lofotoxina, que tiene la propiedad de bloquear la trasmisión
de nuevos y diferentes químicos en mamíferos. La mayor ven- neuromuscular.17, 18
taja de aplicar estos bioensayos prelimares está relacionada con
la reducción del número de mamíferos que normalmente son
requeridos en la determinación de la toxicidad aguda empleando
ratas o ratones, además de ser, por lo mismo, económico.
Material y métodos
Por lo tanto, con base en lo antes expuesto es recomendable Plantas
considerar el uso de invertebrados como Daphnia magna2-5 y
micro-lombrices como Panagrellus redivivus 6,7 en pruebas preli- Se utilizaron 3 plantas medicinales de uso popular o común en la
minares de toxicidad para posteriormente realizar los bioensayos medicina tradicional de Baja California Sur: Haplopappus sonorensis
finales de toxicidad con un número menor de mamíferos. (Asteraceae), Lepechinia hastata (Lamiaceae) y Lophocereus schottii
(Cactaceae). H. sonorensis fue colectada en Cabo Pulmo, B.C.S., L.
El uso de estos micrométodos toxicológicos con invertebrados hastata en la Sierra de la Laguna, B.C.S. y L. schottii en La Ventana,
representaría una reducción significativa en costo, tiempo, espacio B.C.S. Las plantas fueron clasificadas e identificadas por el M.
y número de mamíferos como se mencionó anteriormente, por en C. Jorge Agúndez Espinosa del Laboratorio Fanerogámico de
lo tanto, debería de implementarse también para propósitos de la Universidad Autónoma de Baja California Sur (UABCS) y sus
regulación de medicamentos. respectivas muestras de referencia se encuentran depositadas en
el Herbario Nacional del Instituto de Biología de la UNAM y en
Considerando que en algunos estados de la República Mexi- el Herbario Fanerogámico de la UABCS.
cana, como Baja California Sur (B.C.S.), se siguen utilizando
tanto plantas como ciertos organismos marinos en la medicina Animales
tradicional, nos propusimos en este trabajo evaluar la toxicidad de
algunas plantas medicinales: Haplopappus sonorensis, Lepechinia El coral blando Lophogorgia rigida (Gorgonaceae) fue colectado
hastata, Lophocereus schottii y un organismo marino Lophogorgia en Cabo Pulmo, B.C.S. e identificado por Martín Sánchez del
rigida utilizando el crustáceo Daphnia magna, el nemátodo Pa- Departamento de Biología Marina de la misma Universidad, de
nagrellus rigida y ratones CFW. acuerdo a Verril.18, 19

Las especies anteriores fueron seleccionadas debido a que Su muestra de referencia se encuentra depositado en el La-
son plantas popularmente empleadas en la medicina tradicional boratorio de Farmacognosia del Departamento de Agronomía,
de B.C.S.,1 que al someterse a pruebas de selección para evaluar UABCS, México.
su efecto farmacológico, mostraron actividad antimicrobiana y
citotóxica,8-11 por lo que es necesario determinar sus rangos de Preparación de los extractos
toxicidad para poder dar una mejor orientación sobre su empleo.
Además, de ampliar el estudio de estos recursos que ha aportado Dirigido hacia la búsqueda de los extractos conteniendo
interesantes resultados tanto farmacológicos como fitoquímicos diferentes componentes, se realizó la extracción de las
publicados recientemente. plantas con disolventes de distinta polaridad, comenzando
las extracciones sucesivas con éter de petróleo que además
H. sonorensis es una planta medicinal cuyo té preparado de ser un solvente que ayuda a desgrasar y extraer algunos
con sus ramas hervida en agua, es tomado para la fiebre, es- compuestos de naturaleza lipídica, favorece el que en las
pasmo, escalofríos, postemillas, tos, gripa y de la cual se han subsecuentes extracciones, con cloruro de metileno, etanol
reportado la presencia de varias flavonas con actividad anti- o cloroformo, se facilite la obtención de compuestos de
micobacteriana;8, 9 L. hastata, es utilizada popularmente como diferente naturaleza.

12
 La planta H. sonorensis (46T) fue sometida a extracción exhaus- El porcentaje de animales que alcanzó la etapa adulta (ma-
tiva con éter de petróleo, CH2Cl2 y EtOH en un aparato Soxhlet, duración) y los que se mantuvieron en las diferentes etapas del
los extractos se identificaron como 46TF etéreo (Hs1), CH2Cl2 crecimiento, se determinaron por medición al microscopio, de la
(Hs2) y EtOH (Hs3) respectivamente. El extracto crudo de esta longitud de los sobrevivientes6, 7 y se clasificaron por el tamaño
planta, designado como 46TE EtOH (Hs4) se obtuvo macerando de los nemátodos en cada población experimental.
10 gramos de material seco con 100 mL x 2 de EtOH.
Ratones
L. hastata (65T) también fue exhaustivamente extraída en
Soxhlet con éter de petróleo (Lh1), CHCl3 (Lh2) y EtOH (Lh3), Para los estudios toxicológicos preliminares en mamíferos se
se filtraron y los solventes se evaporaron a presión reducida, obte- usaron ratones, cepa CFW, hembras de 20 a 25 gramos de peso
niéndose los respectivos extractos denominados 65TF. L. schottii corporal que fueron mantenidos en condiciones ambientales con-
(443T), fue extraída por maceración con EtOH (10 g/100mLx2 troladas a 18-22 °C con ciclos de luz/oscuridad de 12/12 horas y
y el extracto crudo obtenido se identificó como 443T EtOH 5 cambios de aire por hora, alimentadas con dieta balanceada es-
(Ls1) y finalmente, L. rigida (WF991) fue sometida a extracción tándar Lab Diet 5P14 para roedor (Purina México S.A. de C.V.)
sucesiva por maceración con CH2Cl2 y EtOH, dando los extractos y agua ad libitum. Se formaron 10 grupos de 9 ratones cada uno,
respectivos: WF991F CH2Cl2 (Lr1) y WF991F EtOH (Lr2), 3 animales de cada grupo recibieron, por vía oral, dosis de 500,
los cuales se concentraron posteriormente en rotavapor a 40 °C, 793 y 1000 mg/kg de los extractos disueltos en agua conteniendo
obteniéndose el material libre de solvente. 10% de dimetilsulfóxido (DMSO), en un volumen de 200 µL y
se mantuvieron en observación durante 7 días, durante los cuales
Animales de experimentación se registraron diariamente su aspecto físico, comportamiento y
y evaluación toxicológica número de muertes. Los animales testigo recibieron únicamente
la misma cantidad del vehículo.21 Estas pruebas se llevaron a cabo
El crustáceo, Daphnia magna se usó como organismo de prue- por duplicado y en algunos casos por triplicado.
ba para investigar la toxicidad aguda. El medio de incubación
utilizado para estos experimentos fue agua reconstituida con Los animales fueron proporcionados por el bioterio local.
una dureza de 160 mg/L a 180 mg/L de CaCO3, pH entre 7.5 Los procedimientos para el manejo y sacrificio de los animales
a 8.5, temperatura 20 °C ± 2 °C, fotoperiodo 16 horas luz - 8 cumplieron con los requisitos establecidos en la norma oficial
horas oscuridad, a una concentración de oxígeno mayor NOM-062-ZOO-1999.
de 3 mg/L 2, 5, 20. Todos los animales usados para esta serie de
experimentos fueron neonatos de hasta 24 horas de nacidos, los Análisis estadístico
cuales se incubaron usando 5 diferentes diluciones de los extrac-
tos, 6.25, 12.5, 25, 50 y 100% de la concentración seleccionada Los resultados de mortalidad de D. magna, están expresados
para cada muestra según su actividad. Se calcularon los valores en términos de la concentración letal media, que mata el 50%
de CL50 a las 24 y 48 horas. de los organismos (DL50), dichas concentraciones se calcularon
mediante regresión logística en el programa SPSS v. 10.0.
El otro animal de experimentación utilizado para este estudio
fue un nemátodo silvestre, Panagrellus redivivus, cultivado en el El grado de afectación a los ratones se expresa con la mediana
laboratorio en condiciones estándares sobre un medio de harina de una escala subjetiva gradual de 0 a 10, donde el 0 representa
de trigo y mantenido en placas de petri en medio M9-Y, alimen- no-alteración y el 10 alteraciones notorias como la depresión
tados cada 4-5 días con una suspensión de levadura. severa y la muerte.

Los extractos probados se disolvieron previamente en una La asociación de los resultados en roedores e invertebrados se
cantidad mínima de dimetilsulfóxido y posteriormente en el realizó mediante el coeficiente de correlación de Spearman. Se
medio M9-Y (1:100). consideraron como significativos valores de p menores a 0.05.

Para las pruebas de toxicidad se seleccionaron los nemáto-

dos en la segunda etapa juvenil ( J2) en el medio M9-Y. Para la
evaluación del efecto letal, los animales se dejaron crecer en un
Resultados y discusión
medio conteniendo 250 µg de extracto/mL, durante 96 horas a
Como se muestra en la tabla 1, el extracto etanólico de L. scottii
22 °C, después de la cual se cuantificó el número de sobrevivien-
(Ls1) fue el más nocivo para Daphnia magna, con un valor de
tes en cada caso. Para el efecto subletal, se contó el número de
CL50= 9.1(µ/mL a las 48 horas, seguida por los extractos de éter
nemátodos que se mantuvieron en las etapas segunda y tercera
de petróleo de H. sonorensis (Hs1) con una CL50= 33.9 (µg/mL
juvenil ( J2 o J3) del crecimiento.

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y de L. hastata (Lh1) con una CL50= 78.7 (µg/mL a las 48 concentración letal (CL50) obtenida para L. scottii usando D.
horas. Sin embargo, según el rango de toxicidad en D. magna magna (que fue el más afectado) es comparable a los valores
publicada en el año 2000 por Guilhermino y col.2, ninguno reportados por dichos autores para fenol (CL50= 9.1 (µg/mL)
de los extractos probados en este estudio puede considerarse y ácido acético (CL50= 10.8 (µg/mL), mientras que para sus-
tóxico, ya que los valores de CL50 obtenidos, se encuentran tancias consideradas realmente tóxicas como el paratión, la
muy por encima de los considerados tóxicos, por ejemplo: la CL50 es de 0.0022 µg/mL.

Tabla 1. Toxicidad de los extractos en Daphnia magna

Muestra CL50 (µg/mL) a las 24 horas CL50 (µg/mL) a las 48 horas

H. sonorensis (Hs1) 167.5 33.9*

H. sonorensis (Hs2)+ 242.6 103.2
H. sonorensis (Hs3)+ --- 602.7*
H. sonorensis (Hs4)+ 600.9 98.1
L. hastata (Lh1) 178.3 78.7*
L. hastata (Lh2) --- 169.0*
L. hastata (Lh3) --- ------
L. schottii (Ls1) 342.9 9.1
L. rigida (Lr1) --- 585.0*
L. rigida (Lr2) --- 112.0*
n = 60 ó +30 por dosis
--- sin efecto a dosis de hasta 1000 µg/mL
* correlación significativa con el grado de afectación de ratones

En la tabla 2 se muestran los resultados de los efectos tóxicos del nemátodo en un 16% en estado juvenil J2 y con el que sobrevi-
de los extractos probados sobre el nemátodo Panagrellus redivi- vieron únicamente el 56%. Finalmente, la fracción clorofórmica
vus. En esta prueba, los extractos más nocivos resultaron ser: el de L. hastata (Lh2) inhibió la maduración de un 28% de nemá-
extracto etanólico de L. rigida (Lr2) que inhibió la maduración todos juveniles y permitió una sobrevivencia del 97%.

Tabla 2. Toxicidad de los estractos en Panagrellus redivivus, a concentración única de 250 µg/mL

Muestra Maduración (%) Sobrevivencia (%)

H. sonorensis (Hs1) 81.2 98

H. sonorensis (Hs2) 75.8* 100
H. sonorensis (Hs3) 80.9* 100
H. sonorensis (Hs4) 75.0* 100
L. hastata (Lh1)++ 60.2 97
L. hastata (Lh2)+ 28.1* 97
L. hastata (Lh3) 48.2* 96
L. schottii (Ls1) 96.0 100
L. rigida (Lr1) 94.7* 100
L. rigida (Lr2) 16.4* 56
n = 100, +200, ++300
* correlación significativa con el grado de afectación de ratones

14
 Respecto al estudio en ratones, algunos de los extractos Por otro lado, para P. redivivus, el extracto etanólico de L. rigida
probados a las dosis administradas de 500 y 793 mg/kg, fueron (Lr2) fue la muestra que mostró mayor efecto sobre su creci-
ligeramente nocivos, ya que, en las primeras 24 y 48 horas de miento y sobrevivencia como puede observarse en la tabla 2.
administrados los siguientes extractos: éter de petróleo de H. Los resultados obtenidos con este nemátodo sugieren que tanto
sonorensis (Hs1), éter de petróleo y de cloroformo de L. hastata la inhibición de su crecimiento como su mortalidad pueden
(Lh1 y Lh2) y los extractos etanólicos de L. scottii y L. rigida deberse a efectos sobre su material genético, como lo demues-
(Ls1 y Lr2, respectivamente), les causaron una severa depresión tran Samailoff y col.,6, 7 lo que apoya el uso de esta técnica para
de la cual llegaron a recuperarse completamente al final del identificar mutágenos y realizar ensayos posteriores específicos
experimento. Sin embargo, a la dosis máxima probada de 1000 al respecto.
mg/kg de peso corporal, se murieron algunos animales, en un
porcentaje máximo del 20%. Debido a que no fue posible admi- Finalmente, se puede advertir la necesidad por parte de los
nistrar dosis mayores por la baja solubilidad de los extractos, no investigadores de encontrar métodos más baratos, simples y rá-
se determinaron los valores de DL50 y el grado de afectación de pidos para la evaluación farmacológica y toxicológica de nuevos
los ratones se midió subjetivamente en una escala gradual de 0 fármacos y compuestos químicos23-27 así como de productos
a 10; donde el aumento en la escala representa un aumento en naturales de uso medicinal.28-30
el daño físico observado en los animales, incluyendo la muerte
de los que recibieron la dosis máxima (figura 1).
Conclusiones
El uso de animales invertebrados para la determinación preli-
minar de la toxicidad tanto de los extractos de fuentes naturales
como de productos sintéticos, ofrece varias ventajas:

Se ha demostrado que se reduce significativamente el costo,

tiempo y espacio requerido para la experimentación.

En varios casos existe una correlación significativa entre las

pruebas toxicológicas en invertebrados y en mamíferos.

Lo anterior, debería de tomarse como un signo indicador de

un posible efecto en mamíferos que hay que considerar para rea-
lizar un estudio toxicológico completo, aumentando dosis, tiempo
de exposición, experimentos con administración múltiple, etc.
Figura 1. Grado subjetivo de afectación (usando una escala
de 0 al 10) que sufren los ratones por administración oral de Además, la utilización de diferentes animales invertebrados
las diferentes muestras estudiadas. Los resultados muestran para los estudios toxicológicos, puede ayudar a dilucidar posibles
la respuesta global de las tres dosis empleadas para cada mecanismos de acción, como lo observado con P. redivivus, que
extracto en al menos 18 animales. parece afectar el material genético, en cuyo caso, se podrían pla-
near experimentos para evaluar efectos teratogénicos.
Al comparar los resultados mostrados en las tablas 1 y 2 con
el grado de afectación observado en los ratones (Figura 1), se ve
que las muestras que fueron nocivas para los invertebrados: Ls1, Referencias Bibliográficas
Hs1 y Lh1 para Daphnia magna y Lr2 y Lh2 para Panagrellus
redivivus, resultaron ser los mismos que afectaron en mayor 1. Encarnación D.R. 1992. Medicina Tradicional y Popular de
grado a los mamíferos. Se encontró que existe una correlación Baja California Sur, Secretaría de Educación Pública y Artes
significativa en algunas de las muestras, las marcadas con asterisco Gráficas, UABCS, México, p.122.
en las tablas 1 y 2, con lo observado en los ratones; el coeficiente
de correlación de Spearman fue de -0.82 (p = 0.023) y de -0.73 2. Guilhermino L., Diamantino T., Silva M.C. y Soares
(p = 0.031) para D. magna y P. redivivus, respectivamente. La A.M. 2000. Acute toxicity test with Daphnia magna:
correlación mostrada con sólo algunas de las muestras concuerda an alternative to mammals in the prescreening of che-
con varias publicaciones que reportan la asociación únicamente mical toxicity? Ecotoxicology and Environmental Safety,
para grupos específicos de compuestos.2, 22 46:357-362.

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Mexicana de Ciencias Farmacéuticas, 29:10-12.
Agradecimientos
Los autores agradecen a CONACyT-SIMAC (Ref. 20000-
29. García-Mateos R., Soto H.M, Martínez y V.M. 2000.
106006) por el apoyo brindado para la realización de esta inves-
Toxicidad de los extractos de las semillas de Erithryna ame-
tigación, a las Biol. Sara Ramírez, Isabel Romero e I.B.Q. Jesús
ricana. Ciencia Ergosum, 7:133-137.
Iván Murillo por la asistencia técnica.

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