Medición de expresión génica y producción de ácidos grasos y Astaxantina

en Haematococcus pluvialis bajo condiciones de estrés.

Sthephany Lorena Rios Alcántara

Marian Elena Vargas Cruz

Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca

Bogotá D.C.
2010
Medición de expresión génica y producción de ácidos grasos y Astaxantina
en Haematococcus pluvialis bajo condiciones de estrés.

Sthephany Lorena Rios Alcántara

Marian Elena Vargas Cruz

Trabajo de investigación para optar por el titulo de profesional en

bacteriología

Asesor
Judith Camacho

Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca

Bogotá D.C.
2015
PROBLEMA:

Con el desarrollo económico los combustibles fósiles que proceden de la biomasa

producida hace millones de años se agotaran debido a su característica no
renovable. El petróleo crudo, el carbón y el gas natural tienen un tiempo de uso de
solo 45.7 y 62.8 años. Por lo tanto hay una necesidad urgente de encontrar una
nueva energía alternativa. Desde biocombustible renovable, ecológico, seguro y
amigable con el medio ambiente con condiciones biodegradables. Esta finalidad
se ha convertido en un foco importante de nuestra investigación.

Se cree que las microalgas son una solución potencial para este problema como
sustituto del origen químico a biológico, por eso es de gran importancia la
detección de especies y la optimización de las condiciones de cultivo.
Haematococcus pluvialis; una microalga fuente de subproductos como ácidos
grasos viables para la producción de biocombustible; y productor carotenoide
astaxantina roja bajo condiciones de estrés resulta ser un buen candidato como
sustituto y productor biológico de biocombustibles renovables, además acumula
grandes cantidades que hace que sea interesante su utilización. Sin embargo, las
condiciones de estrés y la ruta de biosíntesis dada por la expresión de genes no
ha sido plenamente identificada.

Por estas razones la pregunta de investigación que se espera resolver con este
proyecto se enfoca en si ¿Es posible realizar la medición de expresión génica y
producción de ácidos grasos y Astaxantina en Haematococcus pluvialis bajo
condiciones estrés?
JUSTIFICACIÓN:

El desarrollo económico, el crecimiento constante de la población, la

industrialización y el mayor uso de combustibles fósiles, están aumentando día a
día. Generando una crisis mundial de energía, aumentando el calentamiento
global por la producción de gases de efecto de invernadero e intensificándose la
escasez de combustibles fósiles. Lo que ha impulsado a la búsqueda de fuentes
alternativas de energía renovable y sostenible con el medio ambiente. Las
materias primas de origen biológico generan un menor impacto ambiental que las
de origen químico, así mismo deben tener un alto contenido de ácidos grasos para
ser elegidas en la producción de biocombustibles, por lo tanto, se ha centrado el
interés en la biomasa de algas como materia prima alternativa para la producción
de combustibles de origen biológico; siendo renovable, ecológico, seguro, con
múltiples aplicaciones, así como biodegradable.

La astaxantina (3, 3'-dihidroxi-β, β-caroteno -4,4'-diona) es un carotenoide

xantofila, un pigmento soluble en grasa de color rojo, usada como colorante de
alimentos, como una fuente de pigmento en salmón, trucha y camarones,
asimismo empleada como suplemento dietético en seres humanos y animales, en
productos nutricionales y farmacéuticos por sus efectos antioxidantes; siendo un
agente contra el cáncer, estimulando la inmunización, previniendo la diabetes, las
enfermedades cardiovasculares y trastornos neurodegenerativos.

H. pluvialis es una microalga verde de agua dulce, unicelular, con un valor

comercialmente prometedor, debido a su capacidad de síntesis de grandes
cantidades de astaxantina y acumulación de ácidos grasos como subproductos
bajo diversas condiciones de estrés. El papel fisiológico de estos productos en
H. pluvialis en respuesta al estrés oxidativo, es principalmente la protección de la
célula.

Por ende, tomaremos a H. pluviales como modelo de estudio, para la medición de

la producción de astaxantina y ácidos grasos bajo dos factores de estrés, que son
la irradiación de luz y la deficiencia de nitrógeno, correlacionando los resultados
con la medición de expresión génica asociada a la obtención de estos
subproductos.

OBJETIVO GENERAL:

Determinar la producción y expresión génica de astaxantina y ácidos grasos en

H. pluvialis, bajo condiciones de estrés.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

 Determinar la producción de astaxantina en H. pluvialis al ser sometido a

deficiencia de nitrógeno y alta irradiación de luz.
 Determinar la producción de ácidos grasos en H. pluvialis al ser sometido a
deficiencia de nitrógeno y alta irradiación de luz.
 Determinar la expresión de genes relacionados con la producción de
astaxantina en H. pluvialis, al ser sometido a deficiencia de nitrógeno y alta
irradiación de luz.
 Determinar la expresión de genes relacionados con la producción de ácidos
grasos en H. pluvialis, al ser sometido a deficiencia de nitrógeno y alta
irradiación de luz.
 Evaluar el cambio morfológico durante las condiciones de estrés ensayadas
en el cultivo.
ANTECEDENTES:

Las microalgas son microorganismos de gran interés industrial por tener la

capacidad de acumular compuestos bioactivos de interés biotecnológico como los
carotenoides, estos pigmentos tienen un papel importante en el desarrollo de las
microalgas, en la fotosíntesis (captación de luz) y estabilidad de la membrana
dando protección al daño fotodinámico, promoviendo la adaptación ambiental (1).

H. pluvialis es una microalga verde unicelular caracterizada por ser una de las
mejores fuentes de carotenoides y ha sido ampliamente reconocida por su
capacidad de acumular significativas cantidades de axtasantina (2) cuando se
expone a condiciones de estrés como aumento sustancial de la intensidad de luz,
privación de nutrientes específicos, tales como nitrógeno o fósforo, etc. Lo que se
sugiere que la acumulación de grandes cantidades de astaxantina es una
estrategia de supervivencia a condiciones adversas ambientales (3). Este
carotenoide es de gran interés industrial gracias a los efectos beneficiosos que da
a la salud de los organismos humanos y animales por lo que se evidencia una
fuerte demanda de este como ingrediente para formulaciones cosméticas,
medicas y suplementos dietéticos, además es utilizada como alimento para la
acuicultura (4). Asimismo, debido a sus fuertes propiedades antioxidantes, la
astaxantina en de gran importancia por su capacidad de proteger contra la foto
oxidación de la luz UV, el envejecimiento y la degeneración relacionada con el
cáncer, la edad, además de aumentar la respuesta inmune y la función
hepática(5).

Parris Kidd (2006) (6) hace una revisión de los antecedentes encontrados sobre
los beneficios clínicos de la astaxantina, afirmando que es capaz de bloquear los
radicales libres y otros antioxidantes debido a la naturaleza polar de su membrana
celular; genera una protección al estrés oxidativo, la inflamación y frena el declive
funcional relacionado con la edad. Su uso como suplemento dietético trae varios
beneficios demostrados en varios estudios dentro de los cuales se encuentran: la
mejora a las funciones cognitivas, reducción de triglicéridos, aumento del nivel del
colesterol HDL, mejora la agudeza visual, mejora el rendimiento reproductivo en
los hombres. En células cultivadas protege la mitocondria de los radicales de
oxígeno endógenos y mejora su eficiencia en la producción de energía.

Robert G. Fassett y Jeff S. Coombes hacen una revisión sobre el valor terapéutico
de la astaxantina en la enfermedad cardiovascular ateroesclerótica, actuando en el
estrés oxidativo y la inflamación de la enfermedad gracias a su valor antioxidante y
y su poder en la preservación de membrana. Resumen los estudios realizados
con modelos animales para evaluar estos efectos de la astaxantina en diferentes
patologías cardiovaculares, observándose por ejemplo reducción de la incidencia
de trombosis secundaria en perros con trombo oclusivo en arteria carótida,
reducción de tamaño de infarto de miocardio en ratas Sprague-Dawley, en
humanos muestran reducción de la oxidación del colesterol LDL, mejora la
reologia o fluidez de la sangre, entre otros.

Los factores de crecimiento de H. pluvialis, y la acumulación de Astaxantina en

condiciones de laboratorio son de gran importancia, sin embargo no es de fácil
cultivo y para obtener pigmentos en cantidades apreciables presenta dificultades
debido a su complejo ciclo de vida lo que debilita el deseo de una amplia
producción de astaxantina a partir de la microalga. Sin embargo Ana Cifuentes, et.
al. (2003). Reporto las condiciones para apoyar el crecimiento vegetativo y la
posterior carotenogénesis; tomo el cloruro de amonio como fuente óptima de
crecimiento dando un estado saludable de las células móviles en el cultivo pero la
fuerte acidificación del medio exigía un ajuste de pH constante lo que invalida esta
fuente de nitrógeno debido a consideraciones prácticas. Por otro lado la mejor
fuente de nitrógeno y la acumulación de carotenoides está dado por los nitratos ya
que el amonio y la urea inhiben ligeramente la carotenogénesis. Los niveles de
irradiación también son otro factor a considerar en el crecimiento, la cepa Steptoe
prefiere un nivel de irradiación relativamente baja, (40 a 50 µEm-2 s-1), esto
quedo demostrado en cultivos con nitrato en el que el cultivo alcanzo densidades
celulares máximas. Además la privación de nitrógeno ha sido una condición eficaz
para aumentar la acumulación de Astaxantina, sin embargo en este estudio la
carotenogenesis inducida bajo esta condición de estrés fue severamente inhibida
por la presencia de amonio; sin embargo este factor carotenogénico inductivo
produjo una fuerte disminución en el número de células, por lo que se sugiere que
las condiciones de inducción a la carotenogénesis debe ocurrir cuando las células
están enquistadas (2).

Baobei Wang, et. Al. Proponen para el cultivo de [Link] y la inducción de

biosíntesis de astaxantina y ácidos grasos, el uso de células en fase Palmella
(cepa SAG 34 / 1b) que se encuentran en reposo vegetativo, en lugar de las de
fase móvil (cepa CCAP 34/12), ya que estas últimas son las más utilizadas pero
en ellas se ve comprometida la productividad de la biomasa y de los
bioproductos, debido a la susceptibilidad de las células móviles al estrés
especialmente en alta irradiancia. Por lo que aclararon los mecanismos y cambios
fisiológicos y bioquímicos generados en estas dos formas celulares de H. pluvialis
para enfrentar al estrés de alta irradiancia; al mismo tiempo, por medio de un
método basado en espectrometria de masas para la cuantificación de
glicerolipidos obtuvieron más información sobre los cambios a nivel molecular en
los ácidos grasos producidos al enfrentarse al estrés. Al someter a alta irradiancia
las dos cepas de células de H. pluvialis en los diferentes estados, células móviles
y Palmella, revelaron que las proteínas PSII, D1, PsbO y varios glicerolípidos de
membrana, en especial los lípidos de membrana del cloroplasto disminuyeron en
las células móviles, mientras que en las células Palmella se desarrollaron múltiples
mecanismos de protección manteniendo las proteínas PSII, D1, PsbO y los lípidos
de membrana relativamente estables.

Moira Nunes, et. al. (2013). También evaluó la respuesta de las células
[Link] en el proceso de la inducción a la carotenogénesis con la cepa
Axenico que se mantuvo bajo una intensidad de luz de 50 µmol m-2 s-1 con
fotoperiodos de 12 horas a 23°C de temperatura con el fin de darle las condiciones
óptimas de crecimiento hasta alcanzar la fase de crecimiento para llevar a cabo el
experimento de respuesta al estrés nutricional y de luz, los factores de inducción a
la caretogénesis están dadas por el aumento de luminosidad (350 µmol m-2 s-1)
y la introducción de 4% CO2, dando como resultado el aumento en la
concentración de células, sin embargo la reproducción se detiene cuando el factor
nitrato se convirtió en un factor limitante induciendo un cambio morfológico
(perdida de flagelos) comenzando el enquistamiento y la aparición de color rojizo,
además se aumento el tamaño celular, es decir la acumulación de la biomasa
final. La materia seca se determinó por filtración de membranas, donde se hizo
el cálculo después de secar el filtro en un horno a 60°C durante 3 horas y la
concentración de Astaxantina se determino por cromatografía liquida de alta
resolución, con lo que se pudo determinar que estos factores de estrés aumentan
la astaxantina y la materia seca final en fase de crecimiento exponencial (7).

Yunho Gwak Emplearon un enfoque lipídico para analizar cuantitativamente las

especies moleculares de membrana triagliceridos TAG y glicerolipidos en H.
pluvialis, además utilizan la tecnología de secuenciación de ARN (ARN-ss) que
produce una biblioteca de ADNc alineándose a un genoma de referencia o
utilizando una secuencia desconocida del genoma de un organismo dado
proporcionando un mapa de transcripción del mismo a gran escala. Generaron
este análisis en las fases de célula móvil y aplanospora revelando sus
características genómicas y metabólicas, descifrando así la biosíntesis de
astaxantina y ácidos grasos.

Esta síntesis de Astaxantina está regulada por la expresión transcripcional de

ocho genes (IPI -1, IPI -2, PSY, PDS, LYC, CRT RB, BKT y CR TO) bajo
condiciones de estrés. Zhengquan Gao, et. al. (2013). Evaluó la acumulación de
Astaxantina y su relación con la expresión de genes carotenoides, bajo
condiciones exógenas de Epirasinolida, usando PCR en tiempo real y microscopia
espectrofotométrica. Esta acumulación exógena de los EBR aumenta la capacidad
de resistencia al estrés mediante la estimulación de producción Astaxantina de
manera eficiente de acuerdo a su concentración, ERB50 (50 mg/L) fue más eficaz
para inducir Astaxantina que EBR 25 (25 mg/L), sin embargo el primero dio lugar
a mas células muertas y albinas, además a mayor exposición se observan efectos
secundarios significativos como el detenimiento del crecimiento celular y perdida
de pigmento, por lo que se sugiere la cosecha de las algas en el momento
adecuado. También se determino que tanto ipi-1 y psy regulan la biosíntesis de
Astaxantina en el nivel post-transcripcional ya que se expresaron en el momento
en el que se da la acumulación de Astaxantina inicial y PDS, LYC, CRT RB, BKT Y
CR TO actúan a nivel transcripcional, conjuntamente se sugirió que ipi-2 controla
la síntesis de Astaxantina tanto a nivel transcripcional y post transcripcional. Las
fitohormonas relacionadas con el estrés pueden inducir la acumulación de
Astaxantina eficiente, sin embargo los perfiles de regulación son diferentes (8).

Raman Vidhyavathi, et. al. (2008). Comparan los cambios obtenidos del perfil de
pigmento (astaxantina) y el perfil de genes carotenogénicos en H. pluvialis al ser
sometido a agotamiento de nutrientes, combinado con una alta intensidad de luz,
acetato de sodio (SA) y cloruro de sodio (NaCl). Los genes para la biositesis de
astaxantina, BKT y CHY se encontraron expresados incluso en las células
vegetativas flageladas, expresándose durante el estrés y encontrándose otros
genes carotenogénicos, PSY, PDS y LCY. La adición de NaCl individualmente,
reduce el contenido total de carotenoides y astaxantina, además retrasa la
expresión de los genes carotenogénicos. Sin embargo la adición de SA / NaCl
conjuntamente, mejoraron el contenido de astaxantina y muestra la máxima
expresión de los genes carotenogénicos. La biomasa de las algas se estimó
después de secar a 60°C, el pigmento se analizó recogiendo una alícuota del
cultivo y se secó por congelación. El crecimiento se midió contando el número de
células utilizando un hemocitómetro. Se extrajo el RNA, y se analizó por PCR (9).

Anping Lei, et. al. (2012) Clonaron los principales genes de síntesis de ácidos
grasos (FA) en H. pluvialis; BC: carboxilasa de biotina; ACP: la proteína portadora
de acilo; MCTK: malonil-CoA: transacilasa ACP; KAS: 3-ketoacyl- ACP sintasa;
FATA: Acil-ACP tioesterasa; SAD: estearoil-ACP desaturasa; FAD: ω-3
desaturasa de ácido graso. Se exploraron sus patrones de expresión en diferentes
tratamientos que inducían estrés como la alta salinidad, aumento /disminución de
temperatura y agotamiento de nitrógeno, utilizando RT-PCR. El contenido de FA y
la composición se analizó mediante GC-MS (Cromatografía-espectrometría de
masas de gas). Su estudio tuvo la finalidad de “identificar el gen clave de síntesis y
acumulación de ácidos grasos, para así evaluarlos como candidatos para la
ingeniería metabólica aumentando la producción y mejorando la calidad del
biocombustible” (10) Según sus resultados proponen que los genes clave que se
ven involucrados en la síntesis de FA en [Link] pueden incluir ACP, KAS, y
FATA (10).

Zhengquan Gao, et. al. (2012) Investigaron en [Link] los patrones de

expresión de genes carotenogénicos y la acumulación de astaxantina inducida
por un tratamiento con ácido jasmónico (JA), relacionan esta sustancia como un
regulador eficaz para estimular la producción de astaxantina, fundamentándolo
con la existencia de regiones que contienen ácido jasmónico en algunos genes
clave implicados en la biosíntesis de astaxantina; siendo además una molécula de
rápida señalización en plantas en momentos de estrés, desencadenando
respuestas de defensa. El tratamiento se hizo con 1,25 × 105 células en dos
grupos, el primero se trato con 25 mg/L de JA y el segundo con 50 mg/L de JA,
cosechándose las células en un transcurso de 18 días. El número de células se
contó microscópicamente utilizando hemocitómetro, por medio de microscopía
óptica se analizó morfología, color, biomasa y pigmento de H. pluvialis, se aisló el
ARN y se analizó por medio de RT-PCR. Los resultados mostraron que la
inducción de JA 25 mg/L tuvo un mayor efecto en la expresión transcripcional de
PDS , CRT RB y LYC (> 10 veces que sin JA) que en IPI -1, IPI -2, PSY , BKT 2 y
CR TO. Y en los tratamientos con JA 50 mg/L hubo un mayor impacto en la
expresión transcripcional del IPI 1, IPI 2, PSY , CRT RB y CR TO que en PDS ,
LYC y BKT 2. Confirmando en primer lugar, que los genes carotenogénicos
exhiben diferentes perfiles de expresión cuando se exponen a ácido jasmónico y
en segundo lugar que la acumulación de astaxantina se indujo eficazmente por
ácido jasmónico siendo probable que sea debido a la regulación de los genes
carotenogénicos(11).

Aaron M. Barlow, et. Al. Utilizan una nueva herramienta para el estudio in vivo de
la distribución de carotenoides en [Link] llamada CARS: Coherent Anti-Stokes
Raman Scattering, obteniendo imágenes en tres dimensiones, sin utilizar ningún
mecanismo invasivo como las coloraciones. Demuestran que se pueden obtener
imágenes de la distribución de astaxantina y ácidos grasos, así como el contenido
de clorofila intracelular.

MARCO TEÓRICO:

Las microalgas son microorganismos fotosintéticos, pueden crecer de manera

autotrófica o heterotrófica, están presentes en ambientes terrestres, en todos los
cuerpos de agua como lagos, mares y ríos, son capaces de crecer bajo
condiciones extremas de temperatura, irradiación , ph y salinidad (14); son
altamente eficientes en la utilización de energía solar y de nutrientes inorgánicos
como dióxido de carbono, nitrógeno y fosforo para la síntesis de metabolitos
valiosos y generación de biomasa. Estos metabolitos secundarios los sintetizan de
forma específica, por ejemplo pigmentos, vitaminas, lípidos, etc. siendo
bioproductos aplicables en industrias cosméticas, alimenticias y farmacéuticas. La
biomasa se considera un grupo de productos energéticos y materias primas de
tipo renovable que se originan a partir de materia orgánica formada por vía
biológica (15).

H. pluvialis es una microalga de agua dulce, es un alga verde, este término se

asigna al grupo de algas relacionadas con plantas terrestres, se considera el
grupo más evolucionado entre las algas, se encuentran en los mares y en aguas
continentales e incluye a los grupos de algas Charophyta y Chlorophyta, a este
último phylum corresponde [Link]. Su clase es Cloroficea y su orden
volvacales, además la temperatura de crecimiento es de 25°C y su ciclo de luz -
oscuridad esta dado por 12hrs/ luz - 12 [Link] Ha sido aislada a partir de
cortezas secas, piedras, aguas de charcas de lluvia. (15)(16)

Es unicelular, con células ovoides, activamente móviles por sus flagelos apicales.
Se incluye en Chlorophyta por poseer clorofila a y b, por formar estados flagelados
de esporas o gametos y por almacenar como principal producto de reserva el
almidón (α1,4 – glucano) en sus plastos (16). Dentro de sus partes se encuentra el
protoplasto que se encuentra internamente separado de la pared celular y que se
conecta por delgados hilos que pueden ser simples o ramificados, en su mayoría
son ovoides o elipsoides, y presentan dos flagelos apicales e iguales que penetran
la pared celular de celulosa. Los cloroplastos en forma de copa, en ocasiones
tubulares con uno o varios pirenoides y un estigma de gran tamaño, tienen un
núcleo central en el lumen del cloroplasto, presentan varias vacuolas contráctiles.

Su ciclo vital presenta polimorfismo celular, cambiando de una forma a otra

dependiendo de los factores del cultivo. Se distinguen claramente tres formas: la
primera se denomina célula vegetativa móvil, es ovalada, flagelada y verde; la
segunda se denomina palmella es esférica, sin flagelos, de color verde; y la
tercera se denomina aplanóspora de forma esférica, sin flagelos de color rojo.
(figura 1) (17).

En la fase de célula vegetativa móvil es donde se evidencia un crecimiento activo,

tiene una matriz extracelular gelatinosa que rodea la membrana plasmática
aislándola del medio ambiente siendo muy lábil, poseen dos flagelos de una
misma longitud y salen de un extremo anterior, contienen un único cloroplasto con
varios pirenoides, en este estado las células persisten, y poseen clorofila a y b y
carotenoides primarios como B-caroteno, luteína, violaxantina, neoxantina y
zeaxantina, estas formas vegetativas móviles se encuentran en condiciones
óptimas del cultivo; cuando se alejan de este estado óptimo las células comienzan
a perder sus flagelos y aparecen las células no móviles palmellas, generando una
pared gruesa, acumulando material de reserva como almidón o dividiéndose
rápidamente en células pequeñas sin flagelos, las otras características
estructurales son similares a la célula vegetativa pero no hay estigma ni vacuolas
contráctiles. Cuando las condiciones ambientales llegan a ser supremamente
adversas las células sufren cambios morfológicos, fisiológicos y en las
características fotosintéticas resultando entonces la formación de grandes
aplanósporas rojas resistentes a las condiciones ambientales extremas, se forma
una vaina trilaminar resistente a la acetólisis y se genera una pared secundaria
coincidiendo con una expansión del volumen celular; entonces se comienzan a
producir carotenoides secundarios tales como cantaxantina, echinenone y en
especial astaxantina que genera el cambio de pigmentación de verde a naranja -
rojo, seguido de una disminución de carotenoides primarios y clorofilas. Bajo la
inducción de luz la astaxantina se dispersa hacia la periferia de las células y
moviéndose hacia el centro cuando se interrumpe la exposición a la luz, siendo
evidencia de que es un proceso reversible, es decir, cuando los quistes maduros
se exponen a mejores condiciones de cultivo, las células hijas intracelulares se
liberan de las células maduras enquistadas y las células vegetativas móviles se
regeneran, al mismo tiempo, degradándose los carotenoides, produciendo clorofila
y síntesis de proteínas (16) (17) y libro AMOS.

Figura 1: Ciclo de vida

H. pluvialis:

(a) Célula Vegetativa

Flagelada (b y c) Palmella

(d y f) Aplanóspora
H. pluvialis acumula carotenoides, predominantemente Astaxantina cuando se
expone a condiciones de estrés, en respuesta a circunstancias ambientales. El
cambio morfológico que esta microalga presenta de célula vegetativa verde a
células con quistes maduros responsables del color rojo sanguíneo esta dado por
factores ambientales tales como deficiencia de nutrientes, temperatura, intensidad
de luz y salinidad, estas condiciones de estrés aumentan directamente las
concentraciones de carotenoides y de Astaxantina. En la tabla1. se observan de
manera general los factores de estrés involucrados en la producción del
carotenoide rojo. (7)

CONDICIONES DE ESTRES CONCENTRACION DE ASTAXANTINA

Mayor intensidad de luz en 13. 5 g/g peso seco

combinación con NaCl/Acetato de
Sodio.

Limitación de Nitrógeno o Fosfato Mayor a 4% respecto a su peso seco

Alta intensidad de luz (150 umol/m 2s) Mayor acumulación de Astaxantina

con disminución del nitratos

Alta intensidad de Luz (umol/m2s) 43 mg/ml

Alta intensidad de luz con deficiencia de 10.3 mg/g de peso seco

nutrientes (Nitrato de Sodio, Cloruro de
Amonio y Urea)

Alta intensidad de luz, pH 6.3 con 12 mg/ml

CO2 mas agitación.

Limitación de nitrógeno y Fosforo, 77 mg/ g

5%CO2 y alta intensidad de luz.

Ciclo de luz/oscuridad, temperatura 460 - 600 mg/ml

20°C, ph 8.0, aireación con CO2,

Alta intensidad de luz (60 umol/m 2s) 24.5 - 32 mg/g peso seco
estrés de nutrientes, adicion de
cloruro de Sodioi/Acetato de
aluminio.

(1) Judith Elena Camacho Kurmen, Gloria González, Bernadette Klotz. Producción de Astaxantina en
Haematococcus pluvialis bajo diferentes condiciones de estrés. NOVA. 23/05/2013. Vol. 11. Pág. 1-12.
Disponible en: [Link]

Los carotenoides son pigmentos orgánicos liposolubles que naturalmente son

sintetizados por plantas, algas, algunas clases de hongos y bacterias. Tienen
capacidad antioxidante atribuida a su estructura. Son componentes esenciales de
los tejidos fotosintéticos de las pantas, algas y cianobacterias que participan en el
proceso de captación de luz, ya que frecen una proteccion al aparato fotosintetico
de daños foto-oxidativos. El interés en los carotenoides se ha incrementado
considerablemente, debido principalmente a los beneficios para la salud humana y
también para el crecimiento de ciertas áreas como la agricultura, la acuicultura, la
industria de aves de corral, suplementos nutricionales, la industria alimentaria y
farmacéutica.(12).

La astaxantina (3, 3'-dihidroxi-β, β-caroteno -4,4'-diona) es un carotenoide

xantofila, que se encuentra en diferentes animales marinos y microorganismos
como en Haematococcus pluvialis , Chlorella zofingiensis , Chlorococcum y Phaffia
rhodozyma. Es un pigmento soluble en grasa de color rojo. La Food and Drug
Administration de Estados Unidos (FDA) y la Comisión Europea consideran la
astaxantina natural como un colorante de alimentos, utilizada como una fuente de
pigmento en salmón, trucha y camarones; tiene propiedades antioxidantes que
reducen el riesgo o previenen afecciones en animales y humanos, por ello,
empleada como suplemento dietético en seres humanos y animales en productos
nutricionales y farmacéuticos (13). H. pluvialis es una fuente comercialmente
prometedora entre los productores de Astaxantina, debido a su capacidad de
acumular hasta el 4% en base a su peso seco, bajo condiciones de estrés, tal
como alta intensidad de luz, salinidad, agotamiento de nutrientes y el aumento de
la relación C/N (18).

Figura 2: Biosintesis de astaxantina en H. pluvialis

[Link] se caracteriza por acumular masivamente astaxantina en glóbulos de

aceite citosólicos, es decir, en forma de acilo graso mono – diester, esto ocurre
cuando se encuentra en condiciones precarias de estrés ambiental. La
acumulación de astaxantina se ha correlacionado con el aumento de la biosíntesis
de ácidos grasos, teniendo gran importancia por llegar a representar el 30% del
peso seco celular total, siendo más del 80% ácidos grasos insaturados, por lo que
es una cepa promisoria para la producción de biocombustible (19).
Figura 3: Biosintesis de ácidos grasos en [Link]

“El biocombustible es una mezcla de ésteres monoalquílicos de ácidos grasos de

cadena larga [ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME)], que se pueden obtener
a partir de diferentes materias primas renovables y de lípidos de la biomasa de las
microalgas” (19). Los combustibles fósiles, principalmente el petróleo crudo y el
gas natural, representan una gran desventaja en la actualidad por el daño que
causan al medio ambiente y la inevitable posibilidad de su extinción, por eso se
busca una posibilidad alterna y es el biocombustible el que garantiza esta opción.
La composición del biocombustible comprende esencialmente ácido palmítico,
ácido esteárico, ácido oleico, ácido linoleico, otros ácidos grasos de cadena larga,
y esteres formados por alcoholes. Por lo tanto, las materias primas que contienen
alto contenido de ácidos grasos deben ser elegidos para la producción de
biocombustibles (20). Las microalgas son una gran fuente de investigación para
ser utilizadas en la producción de lípidos y su aplicación en el área de
biocombustibles, dentro de las ventajas de su uso esta su alto potencial de
crecimiento a lo largo del año teniendo una alta producibilidad, toleran alto
contenido de dióxido de carbono, su consumo de agua es inferior comparado con
otras fuentes de cultivo, no necesita de herbicidas o pesticidas, se pueden utiliza
para el cultivo de algas aguas residuales que contengan nutrientes como nitrógeno
y fosforo. Dentro de las desventajas se encuentran puntualmente el mayor costo
en comparación con los cultivos convencionales, la recolección de salgas
requieren entrada de alta energía, que es aproximadamente un 20-30% del costo
total de producción, técnicas tales como centrifugación, floculación, flotación,
sedimentación, filtración se utilizan generalmente para la recolección y la
concentración de la biomasa de algas. Las algas pueden convertirse en diferentes
tipos de biocombustibles renovables incluyendo bioetanol, biodiesel, biogás,
biohidrógeno.

DISEÑO METODOLÓGICO

Tipo de estudio: experimental

Universo: Microorganismos

Población: Microalgas

Muestra: H. pluvialis

 Hipótesis

Se logro medir la expresión génica relacionada con la producción de ácidos

grasos y astaxantina en Haematococcus pluvialis bajo condiciones de estrés.
  Variable independiente:

Haematococcus pluvialis bajo condiciones de estrés

Indicadores:

Crecimiento

Cambios morfológicos

Alta irradianza

Concentración nitrógeno: 4% o 5%

 Variable dependiente

Expresión génica relacionada con la producción de ácidos grasos y astaxantina

Indicadores

Genes

Producción de astaxantina gr

Producción de ácidos grasos gr

METODOLOGÍA

Fase 1.

El H. pluvialis se cultiva en el medio BBM (Bold´s Basal Medium), Los cultivos de

incubaN a una temperatura de 25 ± 1 ° C bajo un ciclo de luz y oscuridad de 16/8
horas con una intensidad de luz de 30umol/m 2s por un periodo de 7 días y se
airearon continuamente con 0,2 micras de aire filtrado a través de una bomba
mecánica. A continuación los cultivos se recogen por centrifugación a 3500 g
durante 5 minutos. y se re suspenden en medios con el nutriente nitrógeno
limitado (4- 5% respecto al cultivo original) y variaciones de irradiación de luz. Se
hizo recolección de células al principio del tratamiento y en los días 3, 6, 9, 12, 15,
18 y 2. Las células de algas recogidas fueron lavadas con PBS y se hizo la
determinación de la producción de ácidos grasos y Astaxantina (8) (10) (19).

El número de células se midió usando un hemocitómetro bajo microscopio de luz y

el contenido de Astaxantina se midió con un espectrofotómetro, para el análisis de
ácidos grasos se hizo la extracción de lípidos en una biomasa de 10 mg mediante
molienda del sedimento celular con un mortero enfriando con hielo en 100 ml de
cloroformo; metanol (2:1,v/v) Después de la centrifugación a 1000 g durante 5 min,
los extractos se separaron en dos fases y los lípidos totales en la fase orgánica
inferior se transfirieron a otro vial usando una pipeta de vidrio. El disolvente
orgánico se evaporó bajo una corriente de nitrógeno. El análisis de la producción
de ácidos grasos se realizó en un espectrómetro unto con un cromatógrafo de
líquidos de alto rendimiento (8) (10) (19).

Fase 2.

Las células se cultivan bajo condiciones de estrés y se cosechan para el

aislamiento de ARN. La síntesis de ADNc y la expresión génica de los genes
relacionados con la síntesis de ácidos grasos y Astaxantina se analizaron usando
PCR cuantitativa en tiempo real ([Link]) . Los genes asociados con producción
de ácidos grasos por agotamiento de nitrógeno son KAS 3-ketoacyl; SAD:
estearoil-ACP desaturasa y los asociados con alta temperatura (HT) (42 ° C) son.,
SAD estearoil-ACP desaturasa y FAD ω-3 desaturasa de ácido graso y los genes
asociados a la sintesis de Astaxantina son IPI -1, IPI -2, PSY, PDS, LYC, CRT
RB, BKT y CR TO (7) (10). Los cebadores utilizados para PCR de tiempo real
fueron:
(8) Zhengquan Gao, Chunxiao Meng, Hongzheng Gao, Xiaowen Zhang, Dong Xu, Yuanfeng Su, Yuanyuan
Wang, Yuren Zhan, Naihao Ye. Analysis of mRNA expression profi les of carotenogenesis and astaxanthin
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Fase 3.

La observación del cambio morfológico se evalúa por medio de imágenes de

microscopia de luz cada tres días evaluando los distintos tipos de células, el
contenido total de carotenoide y ácidos grasos.(19)

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