UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS
FACULTAD DE QUÍMICA E INGENIERÍA QUÍMICA
Depertamento Académicoo de Química Orgánica
PRÁCTICA N° 5
DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISIELÉCTRICO: CASEINA Y GELATINA
Aisladas de sustancias naturales, la mayoría de las proteínas son polvos blancos. En
soluciones, las macromoléculas proteicas poseen muchas propiedades de las micelas
coloidales: se difunden débilmente, no atraviesan una membrana semipermeable y son
capaces de formar geles en determinadas condiciones. Todas estas propiedades pueden
explicarse por el tamaño de las macromoléculas de las proteínas, que se miden en muchas
decenas e incluso cientos de milimicrones, es decir, se encuentran dentro de límites
coloidales. Pero, a diferencia de los coloides típicos, las macromoléculas de proteínas son
estables en soluciones sin estabilizador, es decir, dan soluciones verdaderas.
Todas las proteínas son solubles en alcohol absoluto y en disolventes orgánicos
comunes. La desnaturalización puede ser causada por calentamiento (60-70o C). la acción de
rayos ultravioleta o rayos X, ultrasonidos, alta presión de 2500-3000 atm, agentes químicos
(sales de metales pesados, alcaloides, soluciones concentradas de ácidos minerales, etc.).
Para cada proteína, existe tal valor de la reacción activa del medio ambiente, en el que
se compensan las cargas positivas y negativas en la molécula. El valor de pH. en el que la
proteína no tiene una carga total y no se mueve en un campo eléctrico, se llama punto
isoeléctrico (pI) y se expresa como pI. El valor de pI se puede determinar a partir de las
curvas obtenidas por titulación ácido-base de una solución de proteína, así como
por enfoque isoeléctrico de la proteína. A continuación, se muestran los puntos
isoeléctricos de algunas proteínas.
Proteína pI Proteína pI
Pepsina 1,0 Catalasa 5,6
Globulina de papa 4,2 Zeína maíz 6,2
Caseína de la leche 4,7 Hemoglobina 6,8
Albúmina de huevo 4,8 Ribonucleasa 7,8
Gelatina 4,5-5,6 Lisozima 11,0
Ureasa 5,1 Clopeína (protamina de 12,5
arenque)
El valor de pH correspondiente a la pI de la proteína, está determinado por el número
de sus grupos ionógenos y los valores de sus constantes de disociación (pK). El punto
isoeléctrico es superior a 7, si la proteína contiene una gran cantidad de residuos de
aminoácidos básicos, y menos de 7, cuando hay un contenido predominante de
aminoácidos ácidos. Para la mayoría de las proteínas globulares, los pI se encuentran en
la región ácida (4,5-6,5). Sin embargo, también existen excepciones. Por ejemplo, la
enzima pepsina, que funciona en un ambiente altamente ácido del estómago, tiene un pI
de aproximadamente 1, y las protaminas, aproximadamente 12.
La carga total de una molécula de proteína es positiva a pH < pI y, negativa, si el pH
> pl. Dado que una molécula de proteína en el pI no tiene una carga total y no hay
repulsión electrostática entre moléculas adyacentes, las proteínas precipitan fácilmente a
partir de soluciones a un pH igual a su pI.
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El punto isoeléctrico de una proteína debe distinguirse del punto isoiónico, ya que estos
valores no siempre coinciden. El punto isoiónico de una proteína es el valor de pH en el
cual, el número de protones que está asociado con los grupos básicos, es igual al número de
protones donados por grupos ácidos disociados en la molécula de proteína. Por tanto, el
punto isoiónico corresponde al valor de pH en el que la carga total de la molécula de proteína
es cero en condiciones de una ausencia plena de electrolitos en la solución.
En consecuencia, los puntos isoeléctrico e isoiónico coinciden solo en el caso de que la
solución de proteína no contenga otros iones, excepto los residuos de aminoácidos ionizados
de la molécula de proteína y los iones formados durante la disociación del agua. La medición
directa del punto isoiónico es difícil, por eso, se determina midiendo el pI a varias
concentraciones de sal y extrapolando a concentración cero. En ausencia de sales y a un
valor del punto isoiónico cercano pH 7, casi coincidirá con el punto isoeléctrico. Sin
embargo, en presencia de sales, la diferencia entre estos puntos puede ser muy significativa.
Caseína de leche
En la leche hay tres clases de proteínas: caseína, lactoalbúminas y lactoglobulinas.
Todas ellas son globulares. La caseína se encuentra en forma de sal cálcica (caseinato de
calcio) y representa aproximadamente el 80% de las proteínas presentes en la leche y el
3% de la composición total de la leche líquida.
La caseína es un complejo de fosfoproteínas que se separa de la leche por acidificación
y forma una masa blanca. Las fosfoproteínas son proteínas que están unidas covalentemente
a un grupo fosfato. En la caseína, la mayoría de los grupos fosfato están unidos por los
grupos hidroxilo de las cadenas laterales de serina y de treonina. La caseína está formada por
αS1-caseína, αS2-caseína, ß-caseína y kappa-caseína. Las tres primeras no son solubles en
la leche porque, en ausencia de kappa-caseína, precipitan como sales de calcio.
La kappa-caseína tiene pocos grupos fosfato y un alto contenido de carbohidratos
unidos a ella. Todos los grupos hidroxilo libres se disponen en la cara exterior de su
superficie, lo que facilita su disolución en el disolvente de la leche, agua. La otra parte de su
superficie se une fácilmente a las α- y β-caseínas, lo que da lugar a la formación de una
micela que permite la disolución del complejo proteico en la leche.
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La leche tiene aproximadamente pH = 6,6. A ese valor de pH, la caseína se encuentra
cargada negativamente y formando las unidades micelares que permanecen disueltas en el
medio como caseinato de calcio. Si se añade ácido a la leche hasta lograr alcanzar un valor de
pH = 4,6, los grupos fosfato (cargas negativas) presentes en la superficie de las micelas se
protonan (cargas neutras) y, en consecuencia, la caseína precipita.
GELATINA
La gelatina es una proteína purificada que se obtiene del colágeno de animales (incluyendo
pescados y aves) mediante hidrólisis parcial alcalina y/o hidrólisis ácida, hidrólisis enzimática
o hidrólisis térmica. La hidrólisis conduce a grados gelificantes o no gelificantes, es el producto
obtenido de la hidrólisis parcial del colágeno de la piel, tejido conectivo y huesos de animales.
La gelatina obtenida a partir de un tejido precursor por tratamiento ácido es conocida como
Tipo A y la obtenida por tratamiento con álcali es conocida como Tipo B.
Las gelatinas Tipo A (ácidas) presentan un punto isoeléctrico que oscila entre 6 -
9.5. Sin embargo, el tratamiento previo de ciertas materias primas (como por ejemplo el proceso
de depilado del cuero o piel) pueden bajar el pI a menos de 6. Las gelatinas Tipo B (alcalinas)
tienen un punto isoeléctrico que oscila entre 4.5 – 5.6. La gelatina con un pI bajo se debe al
fenómeno de desamidación de aminoácidos. Las gelatinas de Tipo A y B provenientes de
materias primas tratadas o pre tratadas con sustancias alcalinas que eliminan los grupos de
amidas, presentan un pI bajo.
Laboratorio N o 5. Determinación del punto isoeléctrico de las proteínas Obtención de
caseína de la leche y determinación de los puntos isoeléctricos de la
caseína y gelatina
OBJETIVO:
Reconocer la naturaleza proteica de la caseína.
Realizar ensayos de reconocimiento.
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OBJETIVOS ESPECIFICOS:
Calcular el PH de cada una de las soluciones buffer utilizadas
Determinar el punto isoeléctrico de las proteínas caseína y gelatina en base a su
solubilidad en soluciones buffer a diferente pH
Materiales y reactivos. Soluciones de caseína y de gelatina (1%); soluciones de ácido
acético 0,01, 0,1 y 1 mol/L; solución de acetato de sodio 0,1 mol/L; alcohol etílico
96% (o acetona al 95%); agua destilada.
Experimento 1. Obtención de caseína de la leche
La caseína se obtiene por acidulación de la leche. Se considera que está contenida en la
leche en forma de caseinógeno, el cual durante el proceso de extracción se transforma en
caseína
Diluir 30 mL de leche desnatada con cuatro volúmenes de agua en un vaso de 200 mL.
Agitar y agregar por gotas ácido acético al 0,1% hasta que no se desprenda el precipitado de
caseína. Evitar el exceso de ácido, porque la caseína se disuelve en él. Después de filtrar lavan
la caseína con agua y, para eliminar las grasas y otras sustancias la disuelven en 0,1%de
carbonato de sodio. La caseína se disuelve, la grasa queda en estado suspendido. La mezcla la
filtran a través de un filtro húmedo, quedando las grasas en el filtro.
El filtrado, que contiene sal sódica de caseína, lo precipitan nuevamente con ácido acético
al 0,1%. Lo filtran y lo exprimen entre hojas de papel de filtro, en lo posible hasta sequedad y,
para deshidratarlo lo muelen en un mortero con alcohol (15—20 mL). Luego, eliminan la grasa
de la caseína agitando en un tubo de ensayo grande al con éter, y luego con 20 mL de una
mezcla de alcohol metílico y cloroformo (1:1). La caseína pura obtenida, después de secarla
al aire debe ser un polvo blanco.
Siendo electrolitos anfóteros, las proteínas se disocian formando grupos cargados positiva
o negativamente. La proporción de estas cargas está determinada por la cantidad de
aminoácidos ácidos y básicos en la molécula. Uno de los factores que establece la estabilidad
de las soluciones es la carga de la molécula proteica, que impide a estas partículas juntarse
(pegarse) y su precipitación. El pH influye en la carga total de la proteína. Para cada proteína
existe un valor de pH, en el cual la suma de las cargas positivas y negativas es igual a cero. A
este estado de la proteína se le llama isoeléctrico y al valor de pH punto isoeléctrico (las
soluciones proteicas no son estables en el punto isoeléctrico y fácilmente precipitan, en
presencia de alcohol etílico, acetona).
Fundamento del método. La determinación del punto isoeléctrico de las proteínas se
basa en la capacidad que tienen estas de precipitarse fácilmente, bajo la acción del precipitante,
que provoca su deshidratación, a un valor de pH del medio, que corresponde a sus puntos
isoeléctricos. Al agregar alcohol etílico el proceso de precipitación se acelera
Determinación del punto isoeléctrico de la caseína
Los polipéptidos de la leche están en suspensión coloidal, para coagularlos basta con
acidular la leche hasta rebasar el punto isoeléctrico del coloide, pH 4,6. Según el agente
utilizado se puede obtener diferentes tipos de caseína. El tipo de caseína que se obtiene es
caseína ácida.
La propiedad característica de la caseína es su baja solubilidad a pH 4,6. El pH de la leche
es 6,6 aproximadamente, estando a ese pH la caseína cargada negativamente y solubilizada
como sal cálcica. Si se añade ácido a la leche, la carga negativa de la
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superficie de la micela se neutraliza (los grupos fosfato se protonan) y la proteína neutra
precipita
Ca²+ Caseinato + 2HCl → Caseína +CaCl2
A diferencia de otras proteínas, la caseína se precipita en el punto isoeléctrico sin
medios deshidratantes. El punto isoeléctrico de la caseína le corresponde a un pH 4,7.
Experimento 1. Enumerar 8 tubos de ensayo. Agregar a cada uno agua, soluciones de
ácido acético y caseína en las proporciones indicadas en la tabla. Determinar el punto
isoeléctrico por el máximo grado de turbidez (pH 4,7).
Tabla 1. Proporción de los componentes de la mezcla reaccionante (mL) para la formación
del valor de pH
CH3COOH CH3COOH Solución de caseína
No Tubo Agua pH de la mezcla
(0,01 mol/L) (0,1 mol/L) (1%)
1 8,4 0,6 – 1,0 5,9
2 7,8 1,3 – 1,0 5,6
3 8,8 – 0,3 1,0 5,3
4 8,5 – 0,5 1,0 5,0
5 8,0 – 1,0 1,0 4,7
6 7,0 – 2,0 1,0 4,4
7 5,0 – 4,0 1,0 4,1
8 1,0 – 8,0 1,0 3,8
Experimento 2. En 6 tubos de ensayo enumerados, colocar a cada uno la cantidad de las
soluciones de ácido acético, acetato de sodio, agua destilada y gelatina (Tabla 2.). Mezclar el
contenido de cada tubo y luego, a cada uno de los tubos, por la pared, agregar
2 mL de alcohol etílico (o acetona). Después de 30 min determinan el punto isoeléctrico. Este
corresponderá al tubo de ensayo con el máximo grado de turbidez.
Tabla 2. Proporción de los componentes de la mezcla reaccionante (mL) para la formación del
valor de pH
Solución de
CH3COOH CH3COOH (1CH3COONa
Agua mL Gelatina (1%)
No Tubo (0,1 mol/L) mL mol/L) mL (0,1 mol/L mL mL pH
1 3,8 0,8 – 2,0 2,0 5,6
2 3,5 0,5 – 2,0 2,0 5,3
3 3,0 1,0 – 2,0 2,0 5,0
4 2,0 2,0 – 2,0 2,0 4,7
5 – 4,0 – 2,0 2,0 4,4
6 3,2 – 0,8 2,0 2,0 4,1
Cuestionario:
1) ¿Cómo se calcula el punto isoeléctrico (pI) de un aminoácido de grupo R ionizado?
2) ¿Cuál es la relación entre el pH, punto isoeléctrico y pureza de las proteínas con su efecto en
la solubilidad?
3) ¿Cómo se clasifica la caseína y cuales aminoácidos lo componen? ¿Cuál es el pH al cuál la
caseína presento la menor solubilidad?
4) ¿Cuál es la función biológica de las micelas de caseína?
5) ¿Qué es la gelatina? ¿De dónde se extrae? ¿Tipos de gelatina? ¿Es una proteína completa?
¿Fundamente?
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