I UNIDAD: HISTOLOGÍA COMO CIENCIA DE LA VIDA

Tejidos fundamentales del organismo humano

Métodos de fijación, cortes histológicos y coloración, histoquímica
Curso: Histología y Hematología
Biología – VIII c.
Docente: Profesor Orlando Enrique Pretel Sevillano
2023 - II
 Histología
HISTOLOGÍA
La histología es la ciencia que estudia la
estructura y la organización de un organismo
vivo o muerto; en el cual participa la bioquímica,
fisiología, biología las cuales son
imprescindibles para conocer su estado sano o
patológico.
El estudio de la histología se localiza entre
dos límites: el límite superior, que son 0,1 mm
ó 100 µm (límite de resolución del ojo
humano); y el límite inferior, que es 1 nm ó 10
Ǻ.
Por sobre el límite superior está la
anatomía humana, y por debajo del límite
inferior, está la bioquímica.
Por otra parte, el límite de resolución del
microscopio óptico va de 100 micras a 0,2
micras, y el del microscopio electrónico de 0.2
micras a 1 nanómetro.
Fig. 1.2. Células, tejidos, órganos y sistemas
• EVOLUCIÓN HISTÓRICA DE LA HISTOLOGÍA
• La historia de la histología ha evolucionado paralela a la de la
medicina.
• Desde las creencias mágico-religiosas: donde el organismo estaba
constituido por seres benignos y malignos (Egipto, Asiria y Babilonia).
• Grecia y Roma, las primeras ideas científicas que se basaban en
pensamientos filosóficos. Donde destacan que el organismo estaba
compuesto por:
• Empédocles s. V a.C: fuego, agua, tierra y aire.
• Hipócrates. 460 - 370 a. C. : humor negro, humor amarillo, sangre y
bilis.
• Aristóteles. 384 a. C.- 322 a. C. moiras (personificaciones del destino)
• Renacimiento– en adelante).
• Figuras como Malpighi , 1628 - 1694 (teoría fibrilar); apoyada por Leeuwenhoek.(1632-
1723)
• Siglo XVI el microscopio (hermanos Hansen), Bichat (1771-1802) inicia la teoría tisular
basada completamente en la observación.
• Schwann y Schleiden (1838-1839), con la teoría celular y reafirmada por.
• Virchow (1821-1902): La célula es la unidad funcional y morfológica de todo organismo,
excepto el nervioso. Teorías a principios del siglo XX:
• Teoría neuronal: De Ramón y Cajal (1852 - 17 de octubre de 1934), el tejido nervioso se
formaba por células (neuronas).
• Teoría reticular: De Camilo Golgi (1843 - 1926), el tejido nervioso estaba formado por
fibras formando redes interconectadas. Ambos científicos compartieron en 1906 el
premio Nobel.
• Actualmente es la histología molecular gracias a la precisión de los microscopios,
herramientas y técnicas de hibridación in situ, marcaciones con anticuerpos, etc.
TEJIDOS. Una organización básica de células con una determinada
función, es decir, agrupaciones funcionales de células. Son cuatro
tejidos básicos para constituir el organismo:
CLASIFICACIÓN
1. Tejido epitelial: constituido por células
íntimamente relacionadas entre sí, con
escaso o nulo material intercelular. Son
tejidos avasculares; las células se nutren
por difusión y siempre están separadas
del tejido subyacente por una membrana
basal.
Revestimiento: revisten cavidades o
superficies corporales.
Glandular o secretor: liberan sustancias útiles
o beneficiosas para el organismo.
2. Tejido conjuntivo: constituido siempre por
células y matriz intercelular. La matriz
constituidas por fibras y de sustancia
fundamental.
T. c. modelados: con una forma determinada
(tejido cartilaginoso y tejido óseo). Son de
sostén.
T. c. no modelados: sin una forma determinada.
Se sitúan entre otros tejidos; son de relleno de
cavidades y sostienen tejidos Fibroso laxo y
denso. Los distintos tejidos no modelados se
diferencian en la variedad de células, fibras y
sustancia fundamental: tejido adiposo, la
sangre y melánico.
3. Tejido muscular: constituido por células, o
fibras musculares, especializadas en la
contracción. Su citoesqueleto está formado
por miofilamentos contráctiles de actina (f.
finos) y miosina (f. gruesos). Rodeadas por una
lámina basal.
• Estriado: La actina y miosina forman
miofibrillas, que forman estriaciones (bandas
claras y oscuras), lo que les da el nombre
(Esquelético Y Cardíaco).
• Liso: los miofilamentos de actina y miosina no
forman miofibrillas. Unitario. Multiunitario.
4. Tejido nervioso: constituido por neuronas que
reciben y transmiten información mediante
impulsos nerviosos (excitabilidad y
conductibilidad). Sistema nervioso central.
Sistema nervioso periférico y células de soporte
y de sostén o glía.
OBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS
Planos corporales Posición anatómica y términos anatómicos
[Link]
[Link]
• Fijadores
• La formalina es el fijador más usado.
• ¿Qué tejidos duran después de fijación?
• Nucleoproteínas: ácidos nucleicos + próteínas.
• Proteínas intracelulares del citoesqeleto
• Proteínas extracelulares: en aglomeraciones insoluble, moléculas vecinas
se unen a través de enlaces cruzados, como ocurre en la formación de las
fibras colágenas.
• Con fijadores acuosos, se pueden perder:
• ARN.
• Lípidos neutros.
• Glucógeno (hígado y células musculares).
• Proteoglucanos y glucosaminoglucanos (tejido conjuntivo).
Esquema del proceso histológico
Parafina

[Link]
 Resina

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• Los colorantes facilitan la observación al
aumentar notablemente el contraste.
• Pueden ser : ortocromáticos y
metacromáticos
• Son sustancias de origen químico o biológico:
tintes, pigmentos, reactivos, etc.
• Al aplicarlo a un sustrato (generalmente
tejidos y microorganismos) le confiere un
color más o menos permanente.
• Se aplica en disolución o emulsión y el
sustrato debe tener cierta afinidad para
absorberlo.
• Son solubles en el medio en el que se aplican
o en el producto final.
• Deben tener dos componentes que son
grupos funcionales químicos: un cromógeno
y un grupo auxocromo.
[Link]
COLORANTES
• Métodos de coloración
• Coloración directa o sustantiva: verdadera afinidad entre el objeto y la sustancia
colorante.
• Coloración indirecta o adjetiva: requiere mordientes. El mordiente puede actuar antes
del baño con el colorante o formar parte de él. En éste último caso, la combinación
formada recibe el nombre de “Laca”. Ejemplo: Alumbre de Potasio o de Sodio.
• Coloración progresiva: El colorante actua hasta que llegue hasta su punto óptimo.
• Coloración regresiva: Se realiza una sobrecoloración y luego se elimina el exceso de
colorante por medio de diferenciadores. (agua, alcoholes, bases o soluciones metálicas.
• Coloración simple: Colorean solo algunos elementos del preparado. Como núcleos,
fibras elásticas, glucógeno, etc.
• Coloración combinada: Tiñen elementos nucleares y citoplasmáticos, se una colorantes
básicos y ácidos: Hematoxilina - violeta el núcleo); Eosina, rosado - citoplasma.
• Coloración panóptica: Es una coloración combinada realizada sucesivamente por
colorantes neutros. Ejemplo: May – Grünwald – Giemsa.
• Coloración pancrómica: En un solo baño, actúan todos los colorantes neutros que se
necesitan. Ejemplo: Pancrómico de Laverman, de Pappenheim.
• Coloración en bloque: Colorea a la pieza en su conjunto antes de cortarla.
• Coloración en cortes: Colorea cada corte por separado.
• I. Histoquímica y citoquímica: Tinciones clásicas
• Conjunto de técnicas empleadas en histología, permiten identificar
y localizar componentes químicos específicos de células y tejidos.
• Dan información detallada acerca de la función de las células y los
componente extracelulares de los tejidos.
• Se pueden fundamentar en: Unión específica de un colorante.
• Uso de anticuerpos marcados con un colorante fluorescente.
• Actividad enzimática inherente al elemento propio de la célula.
• Radiografía (precursores moleculares marcados
radioactivamente ingresan a células y tejidos antes de fijarse.
• *La metacromasia, no es una técnica histoquímica propiamente
dicha, sirve para identificar algunos componentes químicos,
sometiendo previamente a la acción de enzimas que digieren
moléculas metacromáticas. La ausencia de coloración en el tejido
confirma la presencia de la sustancia.
• limitaciones de H&E
• NO puede mostrar:
• Elastina, Fibras reticulares, Membranas basales, Lípidos
• Es inadecuado para dilucidar composición química de elementos celulares.
• Ejem: alcoholes y solventes orgánicos diluyen lípidos neutros.
• Corte por congelación de tejido fijado en formalina y colorantes que se disuelven
en grasas.
• Ejem: preservar estructuras de membrana: Fijadores con metales pesados
(permanganato y osmio). Tetróxido de osmio como fijador para ME.

Tinción selectiva: Ejm:

• Orceína y fucsina
• Resorcina - material elástico
• Impregnación argéntica -> fibras reticulares, membranas basales.
 • Varios componentes de los tejidos se pierden en cortes teñidos
con H&E y fijadores acuosos
• ARN, Lípidos neutros, Glucógeno (hígado y células musculares).
• Proteoglucanos y glucosaminoglucanos (tejido conjuntivo).
• Componentes solubles, iones y moléculas pequeñas también se
pierden durante la preparación de la muestra de parafina + H&E.
• Metabolitos intermediarios, Glucosa, Sodio, Cloro, Etc.

• Ross M, Pawlina W.(2012) Histología, Texto y Atlás color con Biología

celular y Molecular. 7° Edición. Buenos Aires, Argentina. Editorial:
Médica Panamericana.
• sustancias intracelulares y extracelulares que tienen basofilia.
• Ej.:
• Heterocromatina y nucleólos (grupos fosfato ionizados en ácidos
nucleicos)
• Componentes citoplasmáticos: ergastoplasma (grupo fosfato ionizados en
el ARN ribosómico)
• Material extracellular: carbohidratos complejos de la matriz cartilaginosa
(grupos sulfato ionizados).
• sustancias intracelulares y extracelulares que tienen acidofilia.
• Mayoría de filamentos citoplasmáticos, especialmente en células
musculares.
• Mayoría de componentes membranosos intracelulares y gran parte del
citoplasma no especializado.
• Mayoría de las fibras extracelulares (grupos animo ionizados).
 A. Tinciones clásicas: Técnicas.
a) Coloración para proteínas: Reconocer y localizar determinados aminoácidos, se
utilizan anticuerpos específicos.
b) Coloración para nucleoproteínas y ácidos nucleicos: Para identificar al ADN y ARN se
cuenta:
• Comunes a ambos ácidos nucleicos: Hematoxilina, Azul de metileno o de
Toluidina; absorción de rayos UV de determinadas λ; isótopos radioactivos, como
timidina tritiada que evidencia la Timina del ADN, o uridina tritiada para Uracilo
en el ARN.
• Identificación diferencial: REACCIÓN DE FEULGEN O DE FEULGEN –
ROSEMBECK: Específica para ADN, depende de la Desoxirribosa. Tras una
hidrólisis ligera de los cortes con ácido clorhídrico diluido, se extrae el ARN y la
desintegración de la unión desoxirribosa – purina, con liberación de grupos
aldehídos, sobre los cuales actúa el reactivo de Schiff (fucsina básica decolorada
con anhídrido sulfuroso), con el que se tratan los cortes. Se obtiene un color
púrpura o violeta oscuro en las estructuras que contienen ADN.
a) Coloración de Hidratos de Carbono:
•Reacción de PAS (Peryodic acid Schiff): Liberación de grupos aldehídos por la
acción oxidante del ácido periódico y su evidencia ulterior por medio del reactivo
de Schiff. Tiñe de rojo o rojo púrpura a las estructuras que han liberado los
aldehídos (Membrana basal, c. caliciformes, c. que contengan glucógeno).
Existen otras sustancias como, lípidos no saturados, f. de colágena y reticular.
•Método de Alcian Blue: Tiñe selectivamente polisacáridos ácidos a pH de 2,2 o
menos.
Afinidad por grupos sulfatados, colorea de azul a mucopolisacáridos ácidos, y no
tiñe a los neutros.
b) Coloración de lípidos: Sudán III, insolubles en agua, muy solubles en grasa. No es
un verdadero método de coloración, sino un proceso de transferencia de color por
disolución de la sustancia empleada en el lípido. Otros cono Sudán IV, Rojo
escarlata, Sudán negro B. Se aconseja usar formol al 10 % como fijador, que no
los disuelva, o Bouin en cortes con micrótomo de congelación.
• B. Digestión enzimática
• Útil para confirmar la identidad específica del material que se tiñe
como, CHO tisulares (glucógeno, CHO complejos en mucinas
epiteliales, ADN o ARN)
• El material intracelular que se tiñe con la reacción de PAS Periodic
Acid Schiff) puede identificar glucógeno mediante el tratamiento
previo de los cortes con diastasa o amilasa. La falta de tinción después
de este tratamiento identifica con positividad que el material teñido
es glucógeno. Con pretratamiento de los cortes histológicos con
desoxirribonucleasa (DNAsa) evitará la tinción con Feulgen en esos
cortes, tratamiento de epitelios secretores de proteínas con
ribonucleasa (RNAsa) impedirá la tinción de ergoplama con colorantes
básicos
C. HISTOQUÍMICA ENZINÁTICA O HISTOENZIMOLOGÍA

Observar enzimas específicas en células y tejidos

Conocer el estado metabólicos celulares
Se lleva a cabo en secciones congeladas
Tejido fresco se incuba con sustratos específicos +cofactores +
inhibidores, a fin de que el o los enzimas reaccionen
Puede haber agente de visualización ; en el medio o añadido
después
Ej. Succino deshidrogenasa, glucosa-6fosfato deshidrogenasas,
ATPasas, MAO
D. Inmunocitoquímica, inmunohistológicas
• Identificar sustancias específicas
• Relación antígeno-anticuerpo
• Anticuerpo conjugado con colorante fluorescente (MO), o partículas
de oro (ME).
• Método inmunocitoquímico directo e indirecto.
• Para detectar a un antígeno blanco/diana en células y tejidos.
• se utilizan dos tipos de anticuerpos: anticuerpos policlonales
(producidos por animales inmunizados) y anticuerpos monoclonales
(producidos por líneas celulares productoras de anticuerpos
inmortalizadas de duplicación continua).
• E. Técnicas de hibridación
• Localiza ARNm o ADN por hibridar la secuencia de interés
con sonda de nucleótidos de secuencia complementaria.
• FISH (técnica de hibridación in situ con fluorescencia), usa
colorantes fluorescentes combinado con sondas de
nucleótidos, para ver varias sondas simultáneamente. Uso en
pruebas genéticas.
• F. Autorradiografía:
Emulsión fotográfica sobre corte histológico.
- Ubicar material radioactivo en tejidos.
- Cultivo de células o se inyecta a los tejidos con precursor metabólico
marcados radiactivamente (timidina titriada), después la muestra es
extendida en un portaobjetos y sobre èsta se agrega emulsión
fotográfica (cristales de haluro de plata en soporte de gelatina),
activada por radiación de moléculas radiactivas. Posteriormente se
revela fotográficamente.
- Se le usa en MO y MET.
 Artefactos
• Es cualquier alteración
indeseada (evitable o no) que
tiene una muestra de tejido por
las técnicas de procesamiento
que se realizan para su
preparación y observación
• Ejemplo. Espacios sin tejido,
pliegues, burbujas de aire,
defectuosa tinción, estiramientos
y cualquier deformación del
tejido.
El objetivo de la educación es la virtud y el
deseo de convertirse en un buen ciudadano.
Platón. Filósofo griego. Atenas (427-347 a. C.)