Patógenos en Alimentos

Dr. C. René Tejedor Arias

Profesor Titular
IFAL-UH

Referencia:
Kristen Antonellis
Gerente de Productos, Patógenos. Neogen
Titulares recientes
Patógenos en Alimentos

Staphylococcus aureus
Clostridium botulinum
Salmonella spp.
Listeria monocytogenes
Escherichia coli O157:H7
non-O157:H7 STEC (E. coli Shiga Toxin)
 Staphylococcus aureus
 Vive asociado al hombre.
 No son buenos competidores en alimentos.
 Resisten 60ºC durante 30 min.
 Muerte térmica a 100ºC instantánea.

BROTES:
 Productos cárnicos: jamón, embutidos
 Productos lácteos: quesos, helados
 Productos de repostería: dulces de crema
 Ensaladas frías
 Crecimiento en alimentos

pH T (ºC) aw mínima
4,7 - 9,0 7,8 - 45,6 0,86
(7,0–7,5) (37)

•10-15 % de NaCl
•Presencia de nitritos
 Intoxicación estafilocóccica

 Período de incubación de 1 – 6 horas

 Síntomas más característicos: vómitos, salivación
abundante, diarreas y espasmos abdominales. Con
frecuencia otros síntomas: escalofríos, sudoración,
calambres musculares, cefalea y postración.
 Temperatura corporal subnormal.
 Los síntomas tienen una duración de 1–2 días y la
recuperación es fácil y total.
 Bajo índice de mortalidad: shock circulatorio.
 Enterotoxinas
 Se han identificado 7 tipos de enterotoxinas: A, B, C1, C2,
C3, D y E.
 Naturaleza proteica.
 PM= 50 000 Dalton
 Resistentes a enzimas digestivas
 Resisten 100ºC, 30 min.
 Síntesis en alimentos ricos en proteínas y almidones.
Métodos de recuento

Convencional Método rápido

 Recuento en placas de  Compact Dry «Nissui» X-

Agar Baird- Parker. SA
 Confirmación puebas de
coagulasa (+) y
termonucleasa (+)
Prueba de la DNAsa miniaturizada
Clostridium botulinum
 Bacilo esporulado.
 Anaerobio estricto.
 Gram(+).
 Esporas muy termorresistentes.
 Productor de neurotoxinas.
Habitat
 Suelos cultivables y bosques.
 Sedimentos del fondo de los lagos.
 Aguas costeras.
 Tracto intestinal de peces y mamíferos.
 Branquias y vísceras de cangrejos y otros mariscos.
Tipos antigénicos

 Se han reconocido 7 tipos de antígenos de Cl. botulinum: A, B,

C, D, E, F y G; cada uno de ellos produce un tipo de toxina
excepto los tipos C y D.
 Los tipos A, B, E y F pueden ocasionar la intoxicación en el
hombre, siendo los más comunes A, B y E.
 El tipo E es muy frecuente en pescados y mamíferos marinos y
se consideran que tiene un origen marino.
 Todos los tipos A y algunos B y F son proteolíticos.
 Crecimiento en alimentos

pH
T (ºC) aw
Clostridium botulinum mín.
mín.
(ópt)

10-48
Proteolíticos 4,6 0,94
(35)
No Proteolíticos 3,3-45
5,0 0,97
(27)
Termorresistencia
D: tiempo de reducción decimal = tiempo en min. a una T dada necesario
para reducir 10 veces (un ciclo log) la población microbiana

Proteolíticos D a 100ºC=25 min.

No Proteolíticos
D a 100ºC=20,1 min.
Toxinas
 Neurotoxinas (exotoxinas) de naturaleza proteica (globulinas.
 Resisten la acción de las enzimas proteolíticas del tracto
digestivo.
 Pierde actividad con una amplia variedad de compuestos.
 Inactivación a 100˚C durante 10 min.
 Estables en medio ácido.
 Dosis infectiva: solo algunos µg de toxinas pueden causar la
enfermedad.
 Condiciones favorables para el
botulismo/alimentos

 Cualquier tipo de alimento en condiciones anaerobias.

 Proceso de esterilización inadecuado (termorresistencia de
esporas).
 No calentamiento antes del consumo.
 pH mayor de 4.6
 Envasado no industrial.
 Mal almacenamiento e higiene.
Alimentos asociados
Varían de acuerdo al tipo de preservación y los hábitos de consumo
en las diferentes regiones del mundo.
 Carnes y/o vegetales ricos en proteínas en conservas.
 Pasta de ajo, espárragos, espinacas, setas, olivos.
 Atún, salchichas, mariscos, pescado salado y ahumado.
Síntomas
 Periodo de incubación: 18-36 horas y en algunos casos 4h-8
días.
 Debilidad, vértigos, visión borrosa, diplopía, dificultad para
hablar , tragar, respirar y distensión abdominal.
 Parálisis progresiva.
 Curso de la enfermedad

 Parálisis débil (bloqueo de terminales nerviosas)

 Progresión de la parálisis (ojos, cara, tórax)
 Parálisis del diafragma (asfixia)
Tratamientos

 Administración de antitoxinas botulínicas.

 Cuidados intensivos (respiración

artificial)
 Salmonella
• Bacilos Gram negativos, móviles, no formadores de esporas.
• El genero Salmonella contiene solo dos especies, Salmonella entérica y
Salmonella bongori, pero incluye alrededor de 2,500 ‘serovares’, muchos
de los cuales pueden causar enfermedades humanas, usualmente a
partir de alimentos.
• Inicio de la enfermedad: de 6 a 72 horas después de la exposición.
• Síntomas: Nausea, vómitos, diarrea, dolor abdominal, fiebre, dolor de
cabeza.
• Es el patógeno que mas causa enfermedades a partir de alimentos a nivel
mundial.
• US CDC
– Mas de 1,000,000 de casos de Salmonellosis en US anualmente,
(#2 con respecto a Norovirus)
– Mas de 19,000 hospitalizaciones anuales (#1)
– 378 fallecimientos anualmente (#1)
• Contaminantes comunes: Carne, aves, huevos y comida para mascotas.
 Ecología

T crecimiento: 6,7– 45oC T óptima: 35 – 37oC

 Varios procedimientos para su aislamiento en alimentos usan

enriquecimiento en un medio selectivo con incubación a 43oC.

aw límite: 0,93
El crecimiento de salmonelas es generalmente inhibido en
presencia de 3 – 4% de sal.

pH: 4.0 - 9.0 pH óptimo: 6.5 – 7.5

Sobrevivencia

 La sobrevivencia a la congelación por períodos prolongados está

bien establecida.
 Ej. Presencia de Salmonella spp. en pollo y pavo congelados a -
18ºC por varios meses.
 Ej. aislamiento de S. Enteritidis y S. Choleraesuis en helados
almacenados a -25º C.
 Ej. en mantequilla mantenida a temperatura de -23ºC pueden
sobrevivir más de 10 semanas
Sobrevivencia
 Bajos valores de aw limitan el crecimiento; pero permiten la
sobrevivencia por períodos prolongados de almacenamiento a
T altas y ambientales.
 Ej. detección en chocolate deshidratado con aw entre 0.32-
0.41 mantenido 18 meses a T ambiente.
 Ej. en leche almacenada a T ambiente pueden sobrevivir 6
meses.
 En vegetales sobreviven 28 días a 2º-4ºC y mucho más a
temperatura ambiente.
Salmonella – procedimiento BAM
25 g en 225 mL Caldo Lactosado, TSB, UPB
Pre-Enriquecimiento (Dia 1) Incubar a 35oC por 24 h

0.1 mL de enriquecimiento en 10 1.0 mL de enriquecimiento en 10

Enriquecimiento mL de caldo RV mL de caldo TT
Selectivo (Dia 2) Incubar a 42oC por 24 h Incubar a 43oC o 35oC por 24 h

Rayar cultivo en agar BS, XLD y Rayar cultivo en agar BS, XLD y agar
Aislamiento de agar HE HE
Salmonella (Dia 3) Incubar a 43oC o 35oC por 24 h Incubar a 43oC o 35oC por 24 h

Examine las placas por presencia de colonias

de Salmonella (Dia 4)

Identificación de Salmonella (Dias 5 +)

Salmonella – procedimiento MLG
Proporción de 1:10 muestra a medio (BPW) Incubar a
Enriquecimiento Primario 35oC por 18-24 h para productos listos para comer o
(Dia 1) 20-24 h para productos crudos

0.1 mL de enriquecimiento a 10 0.5 mL de enriquecimiento a 10 mL

Enriquecimiento mL de RV de caldo TT
Selectivo Incubar a 42oC por 22-24 h Incubar a 43oC por 22-24 h
(Dia 2)

Estriar los cultivos en BGS y Estriar los cultivos en BGS y

Medio diferencial y de placas de XLT4 o DMLIA Incubar placas de XLT4 o DMLIA Incubar
aislamiento selectivo a 35oC por 18-24 h a 35oC por 18-24 h
(Dia 3)
Inocular tubos inclinados de TSI Inocular tubos inclinados de TSI
Medio Selectivo (Dia 4) & LIA & LIA
Incubar a 35oC por 24 h Incubar a 35oC por 24 h
Identificación bioquimica y confirmación del serotipo
(Dia 5 +)
 Listeria monocitogenes
• Cocobacilos Gram positivos, móviles.
• Existen 6 especies diferentes dentro del genero pero solamente Listeria
monocytogenes es considerada patógena para humanos.
• Es notable por su persistencia en ambientes de producción de alimentos.
– Listeria es obicua del entorno y puede ser encontrada en ambientes húmedos, terrenos
y vegetación en estado de descomposición.
• Su habilidad de crecer a temperaturas tan bajas como 3°C permite su
crecimiento en alimentos refrigerados.
• Periodo de Incubación: Desde 2 días a meses (en formas severas)
• Síntomas: Gastroenteritis, meningitis, septicemia, aborto.
• Está entre las causas principales de fallecimiento por enfermedad
proveniente de alimentos en US
• Contaminantes comunes: Alimentos listos para comer, vegetales, leche cruda,
queso, fiambres, productos del mar.
Patogenia.........
 A partir de casos de personas susceptibles que consumieron leche
cruda o mal pasteurizada se asume que menos de 1,000 UFC
pueden causar la enfermedad.
 Mortalidad:
recién nacidos 26-38%
adultos 13-34%
inmunodeprimidos mucho mayor
 Niveles de L. monocytogenes en alimentos causantes de listeriosis
(ICMSF, 1996)

País, año No. Alimento log ufc/g

casos
Suiza, 1983-87 122 queso 4-6
EU, 1985 142 queso 3-4
UK, 1987-88 > 300 paté >3
Australia, 1991 2 mejillones ahumados 7
NZ, 1992 3 mejillones ahumados 3
Francia, 1992 279 lengua de cerdo, 4-6
“delicatessen”

Francia, 1993 39 carne de cerdo 2-4

EU, 1994 48 leche con chocolate 8
 Brotes Epidemicos por alimentos
contaminados con Listeria monocytogenes
Brote Los Angeles 1995
• N° casos: 142 Muertes :48 34%
• Adultos : 49 18 37%
• Inmunocomprometidos 48
• Cancer 3
• Tratamientos esteroides 12
• Enfermedades crónicas 23
• SIDA 3
• Casos Perinatales 93 30 32%
• Muerte intrauterina 20
• Muerte neonatal 10
L. monocytogenes – procedimiento BAM
25 g en 225 mL BLEB
Enriquecimiento (Dia 1) Incubar a 30oC por 4 h
Agregar agentes selectivos, incubar por 44 h

A las 24 & 48 h raye el cultivo BLEB en agar que contenga

esculina(ej. MOX, PALCAM)
Incubar a 35oC por 24-48 h
Aislamiento (Dias 2-
5)
Transferir 5 colonias a agar TSA con extracto de levaduras
Incubar a 30oC por 24-48 h

Identificación (Dia 6 +)
Listeria monocytogenes – procedimiento MLG
25 g en 225 mL caldo UVM
125 g en 1125 mL de caldo UVM
Enriquecimiento Primario Incubar a 30oC por 20-26 h
(Dia 1)
Sembrar en caldo MOX
Incubar a 35oC por 24-28 h
Enriquecimiento
Transferir 0.1 mL a MOPS-BLEB
Secundario
Incubar a 35oC por 18-24 h
(Dia 2)

Si hay colonias presentes en MOX, transferir al agar HL

Examen de placas (Dia 3) Incubar a 35oC por 22 h
Rayar placa MOX con cultivo MOPS-BLEB
Incubar a 25oC por 26 h

Aislamiento & Purificacion (Dia 4) Siembre las colonias sospechosas en agar HL

Incubar a 35oC por 22 h
Confirmacion & Identificacion (Dia 5+)
 Escherichia coli O157:H7
• Bacilo Gram negativo, caracterizado por la producción de toxina de
Shiga, enterohemorrágica (EHEC)
• Pertenece a las Enterobacterias.
• Aparición de la enfermedad: 3 a 4 días después de la exposición
• Síntomas: diarrea severa, cólicos abdominales, Síndrome Urémico
Hemolítico (SUH), daño renal, PTT.
• Responsables del 75% de infecciones de EHEC a nivel mundial.
• La fuente principal de contaminación esta en los mataderos, no obstante,
sus heces fecales también pueden contaminar el agua usada para
irrigación.
• Contaminantes comunes: Carne molida, leche cruda, fiambres, frutas,
vegetales, jugo y cidra de manzanas, ensaladas.
Crecimiento en los alimentos
pH T (ºC) aw
4.0 – 4.5
(mínimo)
8 - 44 0.98
5.5 - 7.5
(óptimo)
Sobrevivencia

Sustrato/procedimientos Valores
reportados
Carne molida 9 meses a -20ºC
Alimentos ácidos: T refrigeración
embutidos fermentados, Ej. 10 -31 días a
mayonesa, cidra y jugo de 8ºC en cidra/jugo
manzana, queso Cheddar de manzana

Desecación Varias semanas

 Alimentos involucrados en brotes
Carne molida insuficientemente cocida

Hamburguesas

Roast beef

Aguas de pozo Jugos no

pasteurizados

Vegetales crudos Leche cruda

Yogurt Quesos

Salami seco curado Mayonesa

E. coli O157:H7 – procedimiento BAM
• Preparación de la muestra y enriquecimiento (Día 1)
– 25 g en 225 ml de agua peptona modificada con piruvato (mBPWp)
• También hay que agregar suplementos de acriflavina, cefsulodin y vancomicina
– Incubar a 37oC durante 5 hr y luego agregar 1 ml de cada suplemento
– Incubar a 42oC durante 18-24 hr
• Aislamiento por cultivo y selección de colonias aisladas presuntivas (por análisis de
PCR) – Día 2
– Diluir en serie enriquecimientos en tampón de fosfato Butterfields. Siembre en placas de TC-SMAC en duplicado y
una placa de agar cromogénico
– Incubar a 37oC durante 18-24 hr
• Seleccionar colonias (Día 3)
– Elija colonia sospechosa y pruebe si hay antígeno O157 por aglutinación en látex
– Elija todas las colonias positivas y siémbrelas en placas de TSAYE
– Agregue un disco de ColiComplete a estas placas para probar presencia de galactopiranosidasa (X-gal) y
glucuronidasa (MUG)
• Las cepas de O157:H7 son X-gal (+) pero MUG (–)
– Incubar las placas a 37oC durante 18-24 hr
• Leer las placas bajo luz UV (Día 4)
• Realice la prueba del indol
– E. coli O157:H7 es indol (+)
• Pruebas de confirmación de aislados
– Confirme presencia de antígenos O157 y H7 mediante aglutinación en látex
E. coli O157:H7 – procedimiento MLG
325 g en 975 mL (proporcion 1:4) mTSB
Enriquecimiento de la muestra (Dia1) Incubar a 42oC por 15-22 h

Analice con PCR u otro metodo comercial

Prepare alicuota del cultivo mTSB para capturar con

Deteccion & Aislamiento (Dia 2) SIM (separacion Inmuno-Magnetica)

Siembre el eluente del SIM en agar Rainbow

Incubar a 35oC por 24-26 h

Escoja colonias tipicas de la placa y realice prueba

Identificacion (Dia 3) de aglutinacion en latex
Siembre colonias positivas en placas SBA
Incubar a 35oC por 16-24 h

Confirmacion (Dia 4+)

 non-O157:H7 STEC
• Gram negativo, E. coli Shiga-toxigenico (STEC)
• Pertenece al grupo de Enterobacterias.
 Contiene stx, eae y serogrupo O
 Stx: toxina Shiga (también llamada Verotoxina). Se unen a la membrana celular. Una vez dentro de la célula, la
proteína inactiva los ribosomas deteniendo así la síntesis de proteína lo cual conduce a la muerte celular.
 Eae: Intimina. Factor de virulencia que permite que las bacterias se adhieran firmemente a la mucosa intestinal
del huésped durante la infección
 Serogrupo O: lipopolisacárido de la membrana externa. Cada uno es estructuralmente diferente.
• Aparición de la enfermedad: 3 a 4 días después de la exposición
• Síntomas: diarrea severa, cólicos abdominales
• En US los “grandes 6” son responsables de la mayoría de los serotipos aislados
de infecciones clínicas.
– O111, O26, O121, O103, O145, O45
• CDC estima ~100,000 casos al año son atribuidos a non-O157:H7 STEC
– O121 vinculado a 24 enfermedades en 15 estados que resulta en el retiro del mercado de
196.000 kilos de alimentos congelados
• Contaminantes Comunes: Carne molida, leche cruda, fiambres, frutas, vegetales, manzanas,
cidra, ensaladas.
¿Porqué estos 6?
 Han sido aislados de canales de bovino o al por menor en
[Link].
 Con la más alta frecuencia en [Link].
 70% – 83% de las enfermedades STEC según los Centros para el
Control y Prevención de Enfermedades (CDC)
STEC No-O157 – procedimiento
Preparación de muestra y enriquecimiento (Día 1)
•
BAM
– Igual que para E. coli O157
• Aislamiento por cultivos y selección de colonias aisladas presuntivas (por análisis de
PCR) – Día 2
– Diluir enriquecimientos en serie con tampón de fosfato Butterfields. Sembrarlos en duplicado en placas de L-EMB y
una de agar cromogénico
– Agar adicional, placa de agar sangre de infusión de corazón para STEC con mitomicina C (SHIBAM) también puede
ser incluida
– Incubar a 37oC durante 18-24 hr
• Detección de colonias (Día 3)
– Elija colonias de E. coli típicas de las placas L-EMB y colonias hemolíticas de las placas de SHIBAM y siémbrelas en
placas de TSAYE
– Agregue un disco de ColiComplete a estas placas para probar presencia de galactopiranosidasa (X-gal) y
glucuronidasa (MUG)
• Las cepas de O157:H7 son X-gal (+) pero MUG (–)
– Incube las placas a 37oC durante 18-24 hr
• Leer las placas bajo luz UV (Día 4)
• Realice la prueba del indol
– E. coli O157:H7 es indol (+)
• Pruebas de confirmación de aislados
– Identifique los aislados como E. coli utilizando API20 o VITEK
• Ensayo bioquímico