D epartament de B ioquímica i

B iologia M olecular

BIOQUÍMICA
CLÍNICA
Laboratorio
Curso 2022-2023

Profesorado:

Ernest Estornell
Pilar López
Alonso Felipe
 BIOQUÍMICA CLÍNICA

DÍA 1

Glucosa
Triacilgliceroles
Colesterol total y HDL-colesterol

DÍA 2

Urea en suero y orina

Creatinina en suero y orina: aclaramiento renal
Proteínas

DÍA 3

Aspartato aminotransferasa ASAT (GOT)

Alanina aminotransferasa ALAT (GPT)
Fosfatasas alcalinas (FAL)
Gamma-glutamil transpeptidasa (GGT)

DÍA 4

SEMINARIO Y PROBLEMAS
El seminario se impartirá en el aula del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la
Facultad de Farmacia (tercera planta).

1
GLUCEMIA

BIOQUÍMICA CLÍNICA

La glucemia es la concentración de glucosa en sangre. El diagnóstico de los trastornos del metabolismo

de los glúcidos se apoya en parte en la medición de la glucosa plasmática, ya sea en ayunas, tras la
estimulación con pruebas de sobrecarga oral o tras pruebas de supresión.
Los valores de referencia son:
Adultos: 55 a 100 mg/100 mL
Niños: 55 a 90 mg/100 mL
Lactantes: 20 a 80 mg/100 mL

PATOLOGÍA

Hiperglucemias

Diabetes mellitus: síndrome con hiperglucemia persistente:

• Diabetes mellitus insulinodependiente: Diabetes tipo 1, DMID, juvenil o cetósica. La insulinemia es
baja. Su patogenia se cree que es de tipo autoinmune contra las células beta de Langerhans.
• Diabetes mellitus no insulinodependiente: Diabetes tipo 2, DMNID, del adulto o estable. Asociada
frecuentemente a obesidad. Puede cursar con hiperinsulinemia. Existe una pérdida de sensibilidad
a la insulina.

Diabetes mellitus secundaria: diabetes causada por otras condiciones y enfermedades como
enfermedad pancreática, síndrome de Cushing, enfermedad hepática grave, ciertos fármacos, etc.
Diabetes mellitus gestacional: diabetes que ocurre temporalmente durante el embarazo.
Alteración de la glucemia basal: se define como la situación en que la glucemia basal se encuentra
entre 100 y 125 mg/100 mL.
Alteración de la tolerancia a la glucosa: se define como la situación en que la glucemia se encuentra
entre 140 y 199 mg/100 mL a las 2 h. post-ingesta de 75 g de glucosa.
Tanto la alteración de la glucemia basal como la alteración de la tolerancia a la glucosa son
denominadas pre-diabetes por la Asociación Americana de Diabetes.

Hipoglucemias

Insulinomas, exceso de dosis de insulina o hipoglucemiantes orales.

CRITERIOS DE DIAGNÓSTICO DE DIABETES

1. Síntomas clásicos y glucemia casual ≥ 200 mg/100 mL.

2. Glucemia basal (tras ayuno nocturno) ≥ 126 mg/100 mL.
3. Alteración de la curva de glucemia, con valores ≥ 200 mg /100 mL a las 2 horas post-ingesta de 75
g. de glucosa con 300 mL de agua.
4. Valores de HbA1c (hemoglobina glicada) ≥ 6.5 %. Valores entre 5,7 y 6,4 % son considerados como
prediabetes.

2
MÉTODO DE LA GLUCOSA OXIDASA-PEROXIDASA (GOD-POD)

Fundamento
La glucosa oxidasa (GOD) cataliza la oxidación de la glucosa a ácido glucónico. El peróxido de hidrógeno
producido se detecta mediante un agente cromogénico reductor, la 4-aminofenazona + p-clorofenol,
en presencia de peroxidasa (POD). La quinonaimina roja formada es proporcional a la concentración de
glucosa de la muestra.
GOD
β-D-Glucosa + O2 + H2O → Ácido glucónico + H2O2
POD
H2O2 + p-clorofenol + 4-aminofenazona → Quinonaimina + 2 H2O + HCl

Reactivos
Tampón Tris pH 7,5 92 mmol/L
p-Clorofenol 0,03 mmol
Glucosa oxidasa (GOD) 1500 U
Peroxidasa (POD) 100 U
4-Aminofenazona 0,26 mmol

Preparación y estabilidad del reactivo de ensayo

Disolver los reactivos anteriores en 100 mL del tampón Tris pH 7,5.
Esta disolución es estable un mes a 2-8 ºC o 7 días a temperatura ambiente al abrigo de la luz.

Muestra
Suero o plasma. La glucosa en suero es estable al menos 3 días a 2-8 ºC

Ensayo

Blanco Patrón Suero

Glucosa 100 mg/100 mL ---- 10 µL ----
Muestra ---- ---- 10 µL
Reactivo de ensayo 1 mL 1 mL 1 mL

Mezclar e incubar 30 min a Tª ambiente.

Leer a 505 nm frente al blanco. El color es estable durante 30 minutos.

Interferencias
El agua bidestilada utilizada para la disolución debe ser de calidad analítica.
El frasco utilizado para la disolución del reactivo debe estar muy limpio y sin trazas de detergente, pues
podría contaminar el reactivo de ensayo.
Los anticoagulantes de uso corriente como el EDTA, oxalato, heparina o fluoruro no afectan a los
resultados.
No se han observado interferencias por hemoglobina (4 g/L), bilirrubina (20 mg/L), creatinina (100 mg/L)
ni galactosa (1 g/L).

CÁLCULOS

Determinar la glucemia de los sueros analizados e interpretar los resultados.

3
TRIACILGLICEROLES

BIOQUÍMICA CLÍNICA

Los triacilgliceroles, triglicéridos o grasas neutras (ésteres de glicerol con ácidos grasos) procedentes
bien de la absorción intestinal de la grasa o provenientes del hígado, son transportados en la sangre en
forma de lipoproteínas: quilomicrones y lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL).
Los valores recomendables en suero o plasma son inferiores a 150 mg/100 mL. Se consideran valores
elevados a partir de 200 mg/100 mL.

PATOLOGÍA

La hipertriacilglicerolemia aparece en situaciones patológicas como:

• Hiperlipemias: tipo I, IIb , III, IV, V.
• Hipotiroidismo.
• Diabetes mellitus.
• Síndrome nefrótico.

MÉTODO

Fundamento
Los triacilgliceroles de la muestra se hidrolizan a glicerol y ácidos grasos libres por acción de la
lipoproteína lipasa. El glicerol es transformado en glicerolfosfato en presencia de glicerol quinasa y ATP.
El glicerolfosfato es oxidado, a continuación, a dihidroxiacetona fosfato por acción de la glicerolfosfato
oxidasa. El peróxido de hidrogeno producido en esta reacción se valora mediante un agente
cromogénico reductor, la 4-aminofenazona + p-clorofenol, en presencia de peroxidasa (POD). La
quinonaimina roja formada es proporcional a la concentración de triacilgliceroles en la muestra
ensayada.

Lipasa
Triacilgliceroles + H2O → Glicerol + ácidos grasos
Glicerol quinasa
Glicerol + ATP → Glicerol-3-P + ADP
Glicerol-3-P oxidasa
Glicerol-3-P + O2 → Dihidroxiacetona-P + H2O2
Peroxidasa
H2O2 + p-clorofenol + 4-aminofenazona → Quinonaimina + 2 H2O + HCl

Reactivos
Reactivo 1: Tampón Tris-HCl 50 mmol/L pH 7,5, p-clorofenol 2 mmol/L, Triton X-100 0,01 %.
Reactivo 2: Mezcla de enzimas y sustratos: lipoproteína lipasa 15000 U, glicerol quinasa 50 U,
glicerol-P oxidasa 250 U, peroxidasa 44 U, 4-aminofenazona 0,01 mmol y ATP 0,01 mmol.
Patrón de triacilgliceroles 200 mg/100 mL.

4
Preparación y estabilidad del reactivo de ensayo
Disolver, con agitación suave, la mezcla de enzimas y sustratos (R2) en 100 mL del tampón (R1). Este
reactivo es estable 6 meses a 2-8 ºC.

Muestra:
Suero. Los triacilgliceroles son estables en suero 3 días a 2-8 º C

Técnica

Blanco Patrón Suero

Patrón TAG 200 mg/100 mL --- 10 µL ----
Muestra --- --- 10 µL
Reactivo de ensayo 1 mL 1 mL 1 mL

Mezclar e incubar a Tª ambiente durante 15 min.

Leer a 505 nm frente al blanco.

CÁLCULOS

1. Calcular la concentración de triacilgliceroles de los sueros analizados, teniendo en cuenta la dilución

realizada.
2. Interpretar los resultados.

5
COLESTEROL Y HDL-COLESTEROL

BIOQUÍMICA CLÍNICA

El colesterol es un compuesto importante para la formación de membranas celulares y de hormonas

esteroideas. Su transporte por la sangre se realiza asociado a lipoproteínas. Las lipoproteínas
directamente implicadas en el transporte del colesterol libre o esterificado con ácidos grasos son:
• LDL (lipoproteínas de baja densidad): transportan sobre todo ésteres del colesterol desde el hígado
a los tejidos periféricos. Contienen la mayor parte del colesterol total (60-75 %). Si están en exceso,
aumenta el riesgo de formación de placas de ateroma (arteriosclerosis).
• HDL (lipoproteínas de alta densidad): transportan colesterol esterificado y libre desde tejidos
periféricos (incluidas las paredes arteriales) y otras lipoproteínas hasta el hígado, donde será
metabolizado. Contienen el 15-30 % del colesterol total. Su aumento disminuye el riesgo de
arteriosclerosis.
Los valores recomendables de colesterol total y de HDL-colesterol varían con la edad, el sexo y la
presencia de otros factores de riesgo de enfermedad cardiovascular.
- Colesterol total: deseable menor de 200 mg/100 mL; riesgo alto a partir de 240 mg /100 mL. A
más factores de riesgo acumulados, menor ha de ser el valor deseable.
- HDL-Colesterol:
HOMBRES MUJERES
Riesgo bajo > 55 mg/100 mL > 65 mg/100mL
Riesgo normal 35-55 mg/100 mL 45-65 mg/100 mL
Riesgo alto < 35 mg/100 mL < 45 mg/100 mL

Cálculo de LDL-Colesterol por la Fórmula de Friedewald

LDL-colesterol = Colesterol total — Triacilgliceroles (colesterol-VLDL) — HDL-colesterol

5
Valores sospechosos a partir de 130 mg/100 mL; elevados a partir de 160 mg/100 mL

Cociente de Riesgo Aterogénico (índice aterogénico o de Castelli)

Colesterol total < 4 (riesgo aterogénico bajo)

HDL-colesterol

MÉTODO DE CUANTIFICACION DE COLESTEROL Y HDL-COLESTEROL

Fundamento
Los ésteres de colesterol, presentes en la muestra, son hidrolizados a colesterol y ácidos grasos libres
por la acción de la colesterol esterasa. En presencia de O2, la colesterol oxidasa actúa sobre el colesterol
libre formando colestenona y peróxido de hidrogeno, el cual se valora mediante el agente cromogénico
reductor, 4-aminofenazona + p-clorofenol, en presencia de peroxidasa. La quinonaimina roja formada
es proporcional a la concentración de colesterol de la muestra ensayada.
La determinación de HDL-colesterol se basa en una precipitación selectiva de las lipoproteínas.
Mediante el uso de un reactivo precipitante, se logra precipitar las lipoproteínas de baja densidad (LDL)
y las de muy baja densidad (VLDL), permaneciendo en el sobrenadante las lipoproteínas de alta
densidad (HDL). En este sobrenadante se determina el colesterol por el método indicado.

6
 Colesterol esterasa
Ésteres de colesterol + H2O → Colesterol + Ácidos grasos
Colesterol oxidasa
Colesterol + O2 → Colestenona + H2O2
Peroxidasa
H2O2 + p-clorofenol + 4-aminofenazona → Quinonaimina + 2 H2O + HCl

Reactivos
Reactivo 1: Tampón Tris-HCl 50 mmol/L pH 6,9, p-clorofenol 26 mmol/L.
Reactivo 2: Mezcla de enzimas: colesterol esterasa 30 U, colesterol oxidasa 30 U, peroxidasa 125 U y
4-aminofenazona 0,04 mmol.
Patrón de colesterol 200 mg/100 mL.

Preparación y estabilidad del reactivo de ensayo

Disolver, con agitación suave, la mezcla de enzimas y sustratos (R2) en 100 mL del tampón (R1). Esta
disolución es estable 4 meses a 2-8 ºC o 40 días a temperatura ambiente, protegida de la luz.

Técnica

Precipitación de las lipoproteínas VLDL y LDL

Reactivo precipitante: Ácido fosfotúngstico 14 mmol/L pH 1,3, cloruro magnésico 2 mmol/L.
Dosificar en tubos de centrífuga:

Muestra 0,5 mL
Reactivo precipitante 1 gota (eq. 50 µL

Mezclar, dejar reposar 10 minutos a Tª ambiente. Centrifugar 12 min a 4000 rpm o 4 min a 12000
rpm. Separar el sobrenadante, el cual contiene las HDL.

Ensayo

Blanco Patrón Suero Sobrenadante

(Colesterol total) (HDL-colesterol)
Colesterol 200 mg/100 mL --- 20 µL --- ---
Muestra --- --- 20 µL 20 µL
Reactivo de ensayo 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL

Mezclar y dejar 10 min a Tª ambiente. Leer a 505 nm frente al blanco

7
Interferencias
No interfieren en el ensayo los siguientes compuestos y concentraciones: ácido úrico 1.5 mmol/L,
glucosa 28 mmol/L, ácido salicílico 3.6 mmol/L, cafeína 52 mmol/L, paracetamol 0.66 mmol/L, ácido
nicotínico 0.16 mmol/L, fenobarbital 0.4 mmol/L y cortisona 5 mmol/L.
El ácido ascórbico interfiere negativamente por encima de 300 µmol/L.
La hemólisis superior a 3 g/L de hemoglobina interfiere positivamente y se elimina restando la
absorbancia de un blanco de muestra.
Se sugiere procesar, junto con las muestras, algún suero control valorado con concentraciones normal
y anormal, el cual permitirá tener un control de la exactitud y precisión de los resultados.

CÁLCULOS

1. Calcular la concentración de colesterol total en los sueros analizados.

2. Calcular la concentración de HDL-colesterol.
3. Calcular LDL-colesterol.
4. Calcular el cociente de riesgo aterogénico.
5. Interpretar los resultados.

8
UREA

BIOQUÍMICA CLÍNICA

La urea es el producto final del catabolismo de las proteínas. Se sintetiza en el hígado a partir del amonio
generado como consecuencia de la desaminación de los aminoácidos. El 90 % de la urea se elimina por
el riñón mediante la filtración glomerular, y el resto por la piel (sudoración) y el tracto gastrointestinal.
Aunque en el riñón no es objeto de un proceso activo de reabsorción o secreción tubular, entre el 40 y
el 70 % de la urea difunde pasivamente del túbulo al intersticio para volver al plasma, en un proceso
que depende del flujo urinario, de forma que la disminución del flujo urinario trae consigo un aumento
de la reabsorción pasiva de urea y, por tanto, una menor eliminación. La medida de urea es uno de las
pruebas de laboratorio más habituales para valorar la función renal, junto con la medida de las
concentraciones de creatinina
Valores de referencia en suero: Adultos: 17-43 mg /100 mL
Niños: 10-25 mg /100 mL
Lactantes: 5-15 mg /100 mL
Valores de referencia en orina: 20-40 g/24 h

PATOLOGÍA

Un aumento de las concentraciones plasmáticas de urea se denomina azotemia o uremia, y puede

clasificarse en tres categorías:
• Azotemia prerrenal: Es el resultado de una perfusión inadecuada del riñón y, por tanto, de una
filtración glomerular disminuida en presencia de una función renal normal (insuficiencia cardiaca,
shock, hemorragia, deshidratación). Otros factores que pueden causar azotemia prerrenal son las
dietas hiperproteicas, la pérdida de masa muscular durante el ayuno prolongado o el aumento del
catabolismo proteico (fiebre, estrés, quemaduras).
• Azotemia renal: Se produce como consecuencia de una insuficiencia renal aguda o crónica.
• Azotemia postrenal: Es el resultado de una obstrucción del tracto urinario, con la consiguiente
difusión pasiva de la urea desde el túbulo renal al sistema circulatorio.
Las concentraciones de urea en suero o plasma disminuyen en casos de malnutrición, ingesta elevada
de líquidos, embarazo y enfermedades hepáticas graves.

MÉTODO ENZIMÁTICO

Fundamento
La ureasa cataliza la hidrólisis de la urea formando amonio y CO2. El amonio formado se valora mediante
la reacción enzimática catalizada por la glutamato deshidrogenasa (GLDH), que oxida el NADH a NAD+.
La disminución de la absorbancia del NADH frente al tiempo es proporcional a la concentración de urea.

Ureasa
Urea + H2O + 2H → 2 NH4+ + CO2
+

GLDH
NH4+ + α-cetoglutarato + NADH → L-glutamato + NAD+ + H2O

9
Reactivos
Reactivo 1: Tampón Tris-HCl 80 mmol/L pH 7.8.
Reactivo 2: Mezcla de enzimas y sustratos: ureasa 375 U (KM = 1.05 x 10-2 M), GLDH 600 U, NADH
0,032 mmol y α-cetoglutarato 0,6 mmol.
Patrón de urea 50 mg/100 mL (Masa molecular de la urea = 60).

Preparación y estabilidad del reactivo

Disolver, con agitación suave, la mezcla de enzimas y sustratos (R2) en 100 mL del tampón (R1). El
reactivo es estable 4 semanas a 2-8 ºC o 7 días a 15-25 ºC.

Técnica

Preparación de las muestras

El suero se utiliza directamente. La orina hay que diluirla 1/50 con agua destilada tomando 20 µL de
orina y añadiendo 0.98 mL de H2O. Conservar esta dilución tras el ensayo.

Ensayo
Este ensayo se efectúa directamente en cubetas de espectrofotometría. Primero se realiza el patrón, a
continuación se analiza la muestra de suero y finalmente la de orina. Previamente debe ajustarse el
espectrofotómetro con agua destilada.

Patrón Suero Orina

Urea 50 mg/100 mL 20 µL ----- -----
Muestra de suero ----- 20 µL -----
Muestra de orina 1/50 ----- ----- 20 µL
Reactivo de ensayo 1 mL 1mL 1mL

Mezclar bien tras la adición del reactivo, colocar la cubeta en el

espectrofotómetro y esperar a que se produzca cambio de A340.
Anotar el valor de absorbancia a 340 nm a los 1, 2 y 3 min.
Calcular la disminución de la absorbancia media por minuto (∆A/min).

CÁLCULOS

1. Calcular la concentración de urea en el suero y en la orina.

2. Calcular la concentración de urea en la cubeta de ensayo y compararla con la KM de la ureasa.
3. Calcular la excreción urinaria diaria de urea.
4. Interpretar los resultados.

10
CREATININA

BIOQUÍMICA CLÍNICA

La creatinina procede de la fosfocreatina muscular, la cual actúa como una pequeña reserva de energía
de disposición inmediata. El enzima creatina quinasa (CK) cataliza la transferencia del grupo fosfato de
la fosfocreatina al ADP para formar ATP disponible para la contracción muscular. Parte de la creatina
sufre una reacción de deshidratación y ciclación espontánea transformándose en creatinina, producto
no reutilizable metabólicamente. La valoración de la creatinina se emplea como índice de filtración
glomerular, ya que prácticamente toda la creatinina filtrada en el glomérulo se excreta por la orina, no
produciéndose apenas ni reabsorción ni secreción tubular.
En condiciones normales la concentración de creatinina en suero y orina es directamente proporcional
a la masa muscular, por lo que la creatinina es el componente nitrogenado sanguíneo con valores más
constantes. Los valores de referencia en suero son:
Adultos: hombres: 0.6-1.2 mg/100 mL; mujeres 0.5-1.0 mg/100 mL
Niños: 0.25-0.85 mg/100 mL
Los valores en orina de adultos son 1.0-1.5 g/24 h, equivalentes a 15-30 mg/Kg/día.

ACLARAMIENTO RENAL

Para expresar cuantitativamente la función depurativa del riñón se utiliza el concepto de aclaramiento
renal, que se define como el volumen de plasma depurado completamente de una sustancia por unidad
de tiempo. Se calcula a partir de las concentraciones de ciertas sustancias en plasma y orina,
principalmente creatinina, y se expresa generalmente en mL/min.

O (mg/100 mL)
Aclaramiento renal (mL/min) =  x V (mL/min)
P (mg/100 mL)
O = Creatinina en orina
P = Creatinina en plasma (o suero)
V = Volumen urinario expresado en mL/min.

El aclaramiento es proporcional al número de glomérulos, que a su vez lo es a la masa renal, por tanto,
influye la masa corporal del individuo y se debe corregir el aclaramiento absoluto por un factor de
1,73/A, donde A es la superficie corporal (m2) de la persona analizada.

OxV 1.73
AR =  x 
P A

Fórmula de Mosteller: A (m2) = �𝐏𝐏 (𝐊𝐊𝐊𝐊) 𝐱𝐱 𝐚𝐚𝐚𝐚𝐚𝐚𝐚𝐚𝐚𝐚𝐚𝐚 (𝐜𝐜𝐜𝐜)/ 𝟑𝟑𝟑𝟑𝟑𝟑𝟑𝟑

PATOLOGÍA

Los valores de creatinina en suero se encuentran aumentados en la insuficiencia renal, el gigantismo y

la acromegalia. En cambio, se encuentran disminuidos en casos de atrofia muscular.
Los valores en orina aumentan en casos de gigantismo y acromegalia, mientras que disminuyen en la
insuficiencia renal y en casos de atrofia muscular.

11
MÉTODO

Fundamento
Se basa en la reacción de Jaffé, en la cual la creatinina, en medio alcalino, reacciona con el picrato sódico
formando un producto de coloración rojo-anaranjada que se valora espectrofotométricamente. La
adición del ácido pícrico precipita también las proteínas plasmáticas, evitando su interferencia en el
ensayo.

OH-
Picrato + creatinina → compuesto coloreado

Reactivos
Ácido pícrico 11.75 g/L. Conservar a temperatura ambiente y en frasco de topacio.
Disolución madre de creatinina 100 mg/100 mL de HCl 0,1 N. Conservar en refrigerador.
Disoluciones patrón: Diluir la disolución madre de creatinina colocando en 3 probetas de 100 mL
(I, II y III) respectivamente 1, 2 y 4 mL y completando con H2O hasta 100 mL
(extemporáneamente).

Técnica

Preparación de las muestras

Suero: colocar en un tubo de microcentrífuga (usar Eppendorf grande) 1,4 mL de ácido pícrico + 0,350
mL de suero. Agitar y centrifugar 5 min a 12000 rpm. Separar cuidadosamente el sobrenadante, del que
se usaran 1.25 mL para valorar la creatinina.
La orina se utiliza directamente a una dilución 1/50 con agua destilada.

Ensayo

Blanco 1 2 3 Suero Orina

Patrón creatinina I ---- 0,25 mL ---- ---- ---- ----
Patrón creatinina II ---- ---- 0,25 mL ---- ---- ----
Patrón creatinina III ---- ---- ---- 0,25 mL ---- ----
Sobrenadante suero ---- ---- ---- ---- 1,25 mL ----
Orina 1/50 ---- ---- ---- ---- ---- 0,25 mL
H2O 0,25 mL ---- ---- ---- ---- ----
Ácido pícrico 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL ---- 1 mL
NaOH al 10 % 50 µL 50 µL 50 µL 50 µL 50 µL 50 µL

Mezclar y dejar en reposo 10 min a Tª ambiente.

Leer la absorbancia frente al blanco a 520 nm.

CÁLCULOS

1. Calcular la concentración de creatinina en la curva patrón (tubos 1, 2 y 3).

2. Calcular la concentración de creatinina en suero y orina expresada en mg/100 mL
3. Calcular la excreción diaria de creatinina en g/24 h.
4. Calcular el aclaramiento renal.

12
PROTEÍNAS EN SUERO Y ORINA

BIOQUIMICA CLINICA

El glomérulo renal actúa como un ultrafiltro para las proteínas plasmáticas. En condiciones normales, el
paso de proteínas a la orina depende de su peso molecular y de su concentración en el plasma. La
albúmina, de 66 kDa, se filtra con dificultad, pero debido a su elevada concentración plasmática, se
encuentran cantidades considerables en el ultrafiltrado glomerular, constituyendo aproximadamente el
30 % de las proteínas urinarias. Las proteínas de bajo peso molecular, las cuáles filtran más fácilmente
en el glomérulo, son reabsorbidas en los túbulos e hidrolizadas en los lisosomas de las propias células
de los túbulos. Por tanto, apenas aparecen proteínas en la orina, aunque se consideran valores normales
(negativos) concentraciones de proteínas en orina menores de 80 mg/L. Cuando el mecanismo de
reabsorción se satura, la eliminación urinaria de proteínas aumenta (> 150 mg/24 h) y se dice que existe
proteinuria.

En el suero el valor de referencia de proteínas es de 62-82 g/L.

En la orina, las variaciones patológicas de la concentración de proteínas son las siguientes:

Proteinuria débil: < 0.5 g/L (< 1g/24 h)

Proteinuria grave: de 0.5 a 2 g/L (1-4 g/24 h)
Proteinuria muy grave: > 2 g/L (> 4 g/24 h)

PATOLOGÍA

La proteinuria es un signo –uno de los más precoces– de enfermedad renal, tanto glomerular como
tubular. Es un hallazgo constante en las enfermedades propiamente renales, como el síndrome
nefrótico, la glomerulonefritis, las pielonefritis crónicas y la esclerosis renal. También aparece en
enfermedades infecciosas sin afectación específica del sistema renal y en enfermedades generales como
signo de afectación renal (diabetes, gota, hipertensión arterial, etc.).

METODO DE BIURET

Fundamento
Las proteínas, en medio alcalino, proporcionan un intenso color violeta azulado en presencia de sales
de cobre. La intensidad de la coloración está en función de la cantidad de proteína total de la muestra,
así pues, es posible determinar por esta técnica la concentración de proteínas en líquidos biológicos
como suero (o plasma), orina y líquido cefalorraquídeo (LCR).

Reactivos
Reactivo de biuret: SO4Cu⋅5H2O 1,5 g/L, tartrato Na-K 6 g/L, NaOH 30 g/L, IK 1g/L.
Patrón de albúmina 70 g/L.
Ácido tricloroacético (TCA) al 15 %.

13
Técnica

Preparación de las muestras

El suero se toma directamente para la determinación de la concentración de proteínas.
La orina requiere realizar una precipitación previa, del siguiente modo:
1. Pipetear en un tubo de centrífuga 3.0 mL de orina + 3.0 mL de TCA al 15%.
2. Mezclar y dejar reposar 5 min.
3. Centrifugar a alta velocidad 10 min.
4. Decantar el sobrenadante y utilizar el precipitado para la cuantificación.

Ensayo

Blanco Patrón Suero Orina

Suero --- --- 50 µL ---
Orina --- --- --- precipitado
Albúmina 70 g/L --- 50 µL --- ---
Reactivo de biuret 2,5 mL 2,5 mL 2,5 mL 2,5 mL

Mezclar y agitar bien. Incubar los tubos durante 20 min a Tª ambiente.

Leer a 545 nm frente al blanco. El color es estable varias horas.

CÁLCULOS

1. Calcular la concentración de proteínas, en g/L, en el suero

2. Calcular la concentración de proteínas, en g/L, en la orina, teniendo en cuenta el procedimiento
utilizado para su determinación.
3. Calcular la excreción diaria de proteínas en la orina.
4. Interpretar los resultados obtenidos.

14
 ENZIMOLOGÍA SÉRICA

AMINOTRANSFERASAS

BIOQUÍMICA CLÍNICA

Las aminotransferasas, también denominadas transaminasas, son enzimas que catalizan la transferencia
del grupo α-amino de un aminoácido al grupo cetónico de un α-cetoácido. Desempeñan un papel
importante en el metabolismo intermediario de síntesis y degradación de aminoácidos. Aunque existen
numerosas aminotransferasas específicas en los tejidos, en el suero sólo se determinan dos de ellas: la
aspartato aminotransferasa (ASAT), también denominada glutamato oxalacetato transaminasa (GOT),
y la alanina aminotransferasa (ALAT), también denominada glutamato piruvato transaminasa (GPT).
La actividad de ambas en el suero se encuentra elevada en los pacientes con enfermedades hepáticas,
trastornos cardiovasculares, miopatías y otras enfermedades varias. La cantidad de los enzimas séricos
se expresa en términos de actividad, en unidades internacionales (U) por unidad de volumen,
definiéndose la U como la cantidad del enzima que, bajo condiciones definidas, transforma un µmol de
sustrato en 1 minuto. Los valores normales en suero de estas aminotransferasas son:

ASAT (GOT): hasta 35 U/L

ALAT (GPT): hasta 45 U/L

PATOLOGÍA

Las aminotransferasas aumentan en el suero cuando se produce destrucción tisular. La ASAT (GOT) es
muy abundante en el miocardio, mientras que la ALAT (GPT) predomina en el hígado, aunque ambas
se encuentran en otros tejidos. Las principales causas de elevación de estos enzimas en suero son:
Aumentos de ASAT (GOT): Infarto de miocardio, necrosis y traumatismos cardíacos.
Miocarditis reumática aguda.
Traumatismo muscular.
Hepatitis (más que ALAT en hepatitis alcohólicas).
Aumentos de ALAT (GPT): Hepatitis (más que ASAT en hepatitis virales y crónicas).
Cirrosis hepáticas.
Miocarditis.
Necrosis de hepatocitos.

METODO CINÉTICO DE DETERMINACIÓN DE ASAT (GOT)

Fundamento
El método se basa en la propia reacción catalizada por la ASAT. Esta reacción se acopla con la de la
malato deshidrogenasa (MDH), de forma que el oxalacetato formado se reduce a malato, con la
consiguiente oxidación de NADH a NAD+.

ASAT
aspartato + α-cetoglutarato → oxalacetato + glutamato
MDH
oxalacetato + NADH + H +
→ malato + NAD+

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Reactivos
Reactivo 1: Tampón TRIS 80 mM pH 7.8, aspartato 200 mM.
Reactivo 2: NADH 0.018 mmol, α-cetoglutarato 1.2 mmol, MDH 60 U.

Preparación y estabilidad del reactivo de ensayo

Disolver el R2 en 100 mL del tampón R1. El reactivo es estable 72 horas a 18-20 °C o 21 días a 2-8 °C.

Muestra:
Suero o plasma heparinizado.

Técnica
El ensayo cinético se realiza en una cubeta de espectrofotometría del siguiente modo:

Reactivo de ensayo para ASAT (GOT) 1.0 mL

Muestra de suero 50 µL

Ajustar el espectrofotómetro con un blanco de agua destilada a 340 nm.

Mezclar, esperar un minuto a Tª ambiente y anotar la absorbancia a 340 nm.
Anotar la absorbancia tras 1, 2 y 3 min.
Calcular el valor medio de la variación de absorbancia por minuto (∆A/min).

Interferencias
La hemólisis interfiere en el ensayo.

MÉTODO CINÉTICO DE DETERMINACIÓN DE ALAT (GPT)

Fundamento
El método se basa en la propia reacción catalizada por la ALAT. Esta reacción se acopla con la de la
lactato deshidrogenasa (LDH), de forma que el piruvato formado se reduce a lactato, con la
consiguiente oxidación de NADH a NAD+.

ALAT
alanina + α-cetoglutarato → piruvato + glutamato
LDH
piruvato + NADH + H +
→ lactato + NAD+

Reactivos
Reactivo 1: Tampón TRIS 100 mM pH 7.8, alanina 500 mM.
Reactivo 2: NADH 0,018 mmol, α-cetoglutarato 1,2 mmol, LDH 120 U.

Preparación y estabilidad del reactivo de ensayo

Disolver el R2 en 100 mL del tampón R1. El reactivo es estable 72 horas a 18-20 °C o 21 días a 2-8 °C.

Muestra:
Suero o plasma heparinizado.

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Ensayo
El ensayo cinético se realiza en una cubeta de espectrofotometría del siguiente modo:

Reactivo de ensayo para ALAT (GPT) 1,0 mL

Muestra de suero 100 µL

Ajustar el espectrofotómetro con un blanco de agua destilada a 340 nm.

Mezclar, esperar un minuto a Tª ambiente y anotar la absorbancia a 340 nm.
Anotar la absorbancia tras 1, 2 y 3 min.
Calcular el valor medio de la variación de absorbancia por minuto (∆A/min).

Interferencias
La hemólisis interfiere en el ensayo.

Linealidad
Tanto en el ensayo de ASAT como en el de ALAT, si el ∆A/min a 340 nm es superior a 0.150, la muestra
deberá diluirse 1:10 con suero fisiológico. Deberá tenerse en cuenta esta dilución al hacer los cálculos.

CÁLCULOS

1. Calcular las actividades enzimáticas de la ASAT (GOT) y de la ALAT (GPT) en el suero. Expresarlas en
U/L.

∆A340 1 V TOTAL 106 µmol

U/L =  x  x  x 
min ε340NADH VMUESTRA mol

ε340NADH = 6220 M-1⋅ cm-1

2. Interpretar los resultados.

17
FOSFATASAS ALCALINAS

BIOQUÍMICA CLÍNICA
Entre las numerosas fosfatasas presentes en los diferentes tejidos del organismo sólo interesan, desde
el punto de vista clínico, dos grupos de fosfatasas séricas, diferenciados por el pH óptimo de actuación:

• Fosfatasas ácidas: Su pH óptimo es de 4.9-5.2. Se encuentran principalmente en la próstata, los

hematíes, el riñón y los leucocitos.
• Fosfatasas alcalinas: Su pH óptimo es de 8.6-9. Tienen un origen esencialmente óseo y
hepático.

Los valores de referencia en suero de las fosfatasas ácidas (FAC) son de 0.2 a 1.8 U/L. Las FAC pueden
encontrarse aumentadas en el carcinoma prostático y en metástasis óseas, mientras que disminuyen en
los tratamientos con estrógenos.
Las fosfatasas alcalinas (FAL) oscilan entre 50 y 130 U/L. La actividad de las FAL en suero puede aumentar
en el raquitismo, en la osteomalacia, en las metástasis óseas y en las ictericias obstructivas (obstrucción
biliar). Disminuyen en los casos de hipofosfatemia y en las atrofias óseas.

MÉTODO DE DETERMINACIÓN DE LAS FOSFATASAS ALCALINAS

Fundamento
Las FAL hidrolizan enlaces éster fosfato, por tanto, sus sustratos naturales son fosfatos orgánicos y su
producto, el fosfato inorgánico. Cuando el sustrato es el p-nitrofenil-fosfato sódico y el medio básico,
las FAL liberan como producto de la reacción el p-nitrofenol, que tiene una intensa coloración amarilla
cuantificable por espectrofotometría. En el método optimizado que se va a utilizar, la dietanolamina
actúa como aceptor del grupo fosforilo.

FAL
p-nitrofenil-fosfato + dietanolamina → p-nitrofenol + fosfato de dietanolamina

Reactivos
Tampón fosfatasas alcalinas pH 9.8: Dietanolamina 1 M pH 9.8, Cl2Mg 0,5 mM.
Reactivo de ensayo: p-nitrofenil fosfato sódico 0.01 M (0,35 g/100 mL de tampón fosfatasas
alcalinas). Estable 8 semanas en frasco oscuro.
Disolución de p-nitrofenol (PNP) 0,05 mM (0,7 mg/100 mL de tampón fosfatasas alcalinas).

Muestra
Suero o plasma heparinizado. La actividad enzimática debe ser determinada rápidamente o bien
separar el suero de los hematíes para evitar interferencias. La pérdida de la actividad enzimática es
menor de un 10 % entre 2 y 3 días a 15-25 ºC o durante un mes a -20 ºC.

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Técnica

Recta patrón de p-nitrofenol (PNP)

Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3

Disolución de PNP 0,3 mL 0,6 mL 1,2 mL
Tampón fosfatasas alcalinas 0,9 mL 0,6 mL ------

Medir la absorbancia a 405 nm frente a un blanco.

Método cinético optimizado de la Sociedad Alemana de Química Clínica

Reactivo de ensayo 1,2 mL

Suero 20 µL

Ajustar el espectrofotómetro con un blanco de agua destilada a 405 nm.

Mezclar y anotar la absorbancia a 405 nm.
Anotar la absorbancia tras 1, 2 y 3 min.
Calcular el valor medio de la variación de absorbancia por minuto (∆A/min).

Linealidad
Si el ∆A/min es superior a 0,25 se repetirá la determinación diluyendo la muestra a 1:10 con suero salino.

CÁLCULOS

1. Calcular la cantidad (µmol) de p-nitrofenol y su concentración (M) en los tres tubos de ensayo (Pm
p-nitrofenol = 139) y elaborar las respectivas rectas patrón.
2. Calcular el coeficiente de extinción molar del p-nitrofenol ε405p-NITROFENOL.
3. Calcular la actividad (U/L) de las fosfatasas alcalinas en el suero utilizando la recta patrón elaborada.
4. Calcular la actividad (U/L) de las fosfatasas alcalinas en el suero utilizando el coeficiente de extinción
molar del p-nitrofenol: ε405p-NITROFENOL = 18700 M-1 ⋅ cm-1.
5. Interpretar los resultados.

19
GAMMA-GLUTAMIL TRANSPEPTIDASA (GGT)

BIOQUÍMICA CLÍNICA
La gamma-glutamil transpeptidasa (GGT o γGT) es un enzima que participa en el transporte de
aminoácidos a través de la membrana celular. Cataliza la transferencia de un grupo γ-glutamilo desde
el glutatión a los aminoácidos. Aunque se encuentra en la mayoría de órganos y tejidos del organismo,
a excepción del músculo, es especialmente abundante en el riñón, y en menor proporción en el hígado
y en el páncreas.
La actividad GGT varía con el sexo y la edad del individuo. Los valores de referencia en suero son:

Hombres: hasta 38 U/L

Mujeres: hasta 30 U/L

PATOLOGÍA

La actividad GGT sérica se atribuye, fundamentalmente, al isoenzima hepático. Se encuentra aumentada

en patologías hepatobiliares, en las hepatitis víricas agudas, hepatitis alcohólicas, hepatitis crónicas,
obstrucción biliar y en las enfermedades pancreáticas.
Este enzima es especialmente interesante en la detección de las metástasis hepáticas de una neoplasia.
Además, su determinación en suero es de gran sensibilidad como indicativo de afección hepática (97 %
de verdaderos positivos frente a un 54 % que proporciona la ALAT), pero de baja especificidad, con un
valor predictivo positivo de sólo el 32 %. La GGT, junto con las fosfatasas alcalinas y la leucil-
aminopeptidasa se determinan normalmente para el diagnóstico de enfermedades hepatobiliares.

MÉTODO DE DETERMINACIÓN DE LA GGT

Fundamento
La GGT cataliza la transferencia de un grupo γ-glutamilo desde un dador artificial, la L-γ-glutamil-3-
carboxi-4-nitroanilida, hasta un dipéptido aceptor, la glicil-glicina, liberándose al medio el producto
5-amino-2-nitrobenzoato según la reacción siguiente:

GGT
L-γ-Glutamil-3-carboxi-4-nitroanilida + glicil-glicina →
5-amino-2-nitrobenzoato + γ-Glutamil-glicil-glicina

La velocidad de formación del 5-amino-2-nitrobenzoato, compuesto intensamente coloreado con un

máximo de absorbancia a 405 nm, es proporcional a la actividad de la GGT en la muestra ensayada.

Reactivos
Tampón GGT: Tris-HCl 100 mM pH 8,25. Disolver 1,21 g de Tris (hidroximetil) aminometano en 50
mL de agua bidestilada. Ajustar el pH a 8,25 con ClH 1N y llevar hasta un volumen final de 100
mL con agua bidestilada.
Reactivo de ensayo: Disolver 100 mg de L-γ-Glutamil-3-carboxi-4-nitroanilida y 1,32 g de glicil-glicina
en 100 mL de tampón GGT. Las concentraciones finales en el medio de reacción son: L-γ-Glutamil-
3-carboxi-4-nitroanilida 3 mM, glicil-glicina 100 mM y Tris 100 mM. Estable durante 21 dias a 4º
C o 5 días a temperatura ambiente.

20
Técnica
Tras atemperar el reactivo de ensayo y la muestra de suero, pipetear en la cubeta del espectrofotómetro:

Reactivo de ensayo 1,0 mL

Suero 50 µL

Ajustar el espectrofotómetro con un blanco de agua destilada a 405 nm.

Mezclar y anotar la absorbancia a 405 nm.
Anotar la absorbancia tras 1, 2 y 3 min.
Calcular el valor medio de la variación de absorbancia por minuto (∆A/min).

Linealidad
Si el ∆A/min es superior a 0,2 se repetirá la determinación diluyendo la muestra a 1:10 con suero salino.

CÁLCULOS

1. Calcular la actividad (U/L) de la GGT en el suero.

∆A405 1 V TOTAL 106 µmol

U/L =  x  x  x 
min ε4055-amino-2-nitrobenzoato VMUESTRA mol

ε4055-AMINO-2-NITROBENZOATO = 9244 M-1⋅ cm-1

2. Interpretar los resultados.

21
NOTAS

22
Departament de Bioquímica
i Biologia Molecular

23