Practica 3 Tinción de Gram.
Médico Cirujano
Microbiología
ICEST
Cesar Miguel Blanco Figon
QFB. Narro Villaseñor Teresa de
Jesús 4°H
Febrero 1 2024
Objetivos:
La tinción de Gram es una técnica microbiológica utilizada para
examinar la morfología y composición estructural de las bacterias,
permitiendo distinguirlas en dos categorías principales según la
estructura de su pared celular. Esta diferenciación es clave para
comprender su comportamiento fisiológico y su respuesta a distintos
agentes antimicrobianos.
Propósito principal:
Caracterización celular: Identificar la presencia y estructura de
microorganismos en muestras biológicas.
Aplicación clínica: Contribuir al diagnóstico de infecciones y
orientar la elección de tratamientos antibióticos adecuados.
Resultados esperados:
1. Bacterias Gram positivas: Se tiñen de morado debido a su
gruesa capa de peptidoglicano, lo que les confiere mayor
resistencia a la deshidratación y ciertos antibióticos.
2. Bacterias Gram negativas: Adquieren un color rosado o rojo al
final del proceso, ya que su pared celular más delgada permite la
eliminación del colorante primario durante el procedimiento.
Fundamentos:
Fundamento de la Tinción de Gram
La tinción de Gram es una técnica de laboratorio fundamental en
microbiología, utilizada para diferenciar las bacterias en dos grandes
grupos: Gram positivas y Gram negativas, de acuerdo con las
diferencias en la estructura de su pared celular. Fue desarrollada en 1884
por el médico danés Hans Christian Gram y sigue siendo una herramienta
esencial en el diagnóstico de enfermedades infecciosas y en la
investigación microbiológica.
El principio de esta tinción se basa en la composición de la pared celular
bacteriana. Las bacterias Gram positivas poseen una gruesa capa de
peptidoglicano (entre 20 y 80 nm de espesor), que retiene el complejo
cristal violeta-yodo durante el proceso de decoloración con alcohol o
acetona. Esto hace que las bacterias Gram positivas se observen de color
morado bajo el microscopio. En contraste, las bacterias Gram negativas
tienen una pared celular más delgada, con una capa de peptidoglicano de
aproximadamente 2-7 nm, rodeada por una membrana externa
compuesta de lipopolisacáridos. Esta estructura permite que el colorante
primario (cristal violeta) sea eliminado durante la decoloración,
permitiendo que la safranina (colorante de contraste) las tiña de color
rosado o rojo.
El proceso de la tinción de Gram consta de cuatro pasos principales:
1. Aplicación de cristal violeta: Todas las bacterias se tiñen de color
morado.
2. Fijación con yodo de Lugol: Actúa como mordente, formando un
complejo con el cristal violeta que se adhiere mejor a la pared celular.
3. Decoloración con alcohol o acetona: Las bacterias Gram
negativas pierden el colorante debido a su estructura de pared más
delgada.
4. Contratinción con safranina: Permite visualizar las bacterias Gram
negativas al teñirlas de rojo o rosa.
La tinción de Gram no solo permite la clasificación de las bacterias, sino
que también ofrece información clave sobre su fisiología y sensibilidad a
los antibacterianos. Por ejemplo, muchas bacterias Gram positivas son
sensibles a antibióticos como la penicilina, mientras que las Gram
negativas suelen presentar mayor resistencia debido a la presencia de su
membrana externa.
En el ámbito clínico, esta técnica es de vital importancia en el diagnóstico
rápido de infecciones, facilitando la selección de tratamientos adecuados.
Sin embargo, no es un método definitivo de identificación, por lo que suele
complementarse con cultivos y pruebas bioquímicas para una
caracterización más precisa.
Materiales y reactivos:
MATERIAL REACTIVOS
Asa de platino Cristal de violeta
Mechero Yodo iugol
Pinzas Alcohol
Porta objeto Safranina
Microscopio
Cámara de tinción
Procedimiento:
I.- Frotis.
1. Colocar (gota de solución salina en un portaobjetos).
2. Colocar el asa de platino en la flama del mechero hasta el rojo vivo y enfriar
unos
segundos en zona estéril.
3. Tomar con el asa una pequeña cantidad de una colonia de bacterias aislada.
4. Colocar en la gota de Solución salina y homogeneizar.
5. Dejar secar o utilizar el mechero pasando el portaobjetos rápidamente por
la
flama varias veces.
2. - Tinción de Gram.
1. Cristal violeta I minuto.
2. Lavar con agua y escurrir.
3. Yodo lugol 1 minuto.
4. Lavar con agua y escurrir.
5. Decolorar con alcohol-acetona durante 30 segundos.
6. Lavar con agua.
7. Teñir con Safrinina
8. Lavar con agua y escurrir
9. Dejar secar o utilizar la flama del mechero.
10. Colocar 1 gota de aceite de inmersión en el porta objetos
11. Observar al microscopio con objetivo de 100x
Observaciones:
Descripción macroscópica de Klebsiella
pneumoniae:
Tamaño: Las colonias son grandes, alrededor de 2-3 mm de diámetro
después de 24 horas de incubación a 37°C.
Forma: Tienen una forma redondeada, son
elevadas y lisas.
Color:
o En agar MacConkey: Las colonias son de
color rosa porque fermentan lactosa.
o En agar sangre: Las colonias son de color
crema o gris, sin hemólisis (no causan
destrucción de los glóbulos rojos).
Bordes: Son regulares y suaves.
Aspecto: Tienen un aspecto mucoide debido a la
cápsula que producen, lo que les da un borde
gelatinoso.
Descripción microscópica de Klebsiella
pneumoniae:
Forma: Son bacilos cortos, rectos, con los extremos redondeados.
Tinción: Son bacterias gramnegativas, por lo que se tiñen de color
rosado con la tinción de Gram.
Agrupación: Suelen verse de manera aislada, en pares o en cadenas
cortas.
Otros detalles:
o No forman esporas.
o Tienen una cápsula grande que es visible
con tinciones especiales como la tinta china.
o Son inmóviles, lo que las diferencia de otras
bacterias de la misma familia.
Descripción macroscópica de Streptococcus
agalactiae:
Tamaño: Las colonias son pequeñas a
medianas, de aproximadamente 1-2 mm de
diámetro después de 24 horas de incubación.
Forma: Son redondeadas, ligeramente
elevadas y tienen una superficie lisa.
Color: En agar sangre, las colonias suelen ser
de color gris o translúcidas.
Bordes: Los bordes son bien definidos.
Hemólisis: Causa una hemólisis beta estrecha,
lo que significa que hay una zona clara
alrededor de las colonias, pero en algunos casos
puede ser débil o incluso no estar presente.
Descripción microscópica de Streptococcus agalactiae:
Forma: Son cocos de forma redonda.
Tinción: Son bacterias grampositivas, por lo que se tiñen de color
violeta con la tinción de Gram.
Agrupación:
o Se ven en cadenas cortas o como diplococos (pares de bacterias)
cuando se cultivan en líquidos.
o En muestras clínicas, pueden verse en cadenas más largas.
Características adicionales:
o No forman esporas.
o No tienen movilidad.
o Algunas cepas tienen una cápsula de polisacáridos, que se puede
observar con tinciones especiales.
Bacterias Gram positivas:
1. Staphylococcus aureus
o Enfermedad: Puede causar infecciones en la piel (como
forúnculos y abscesos), intoxicación alimentaria, neumonía, y
sepsis. También es conocido por producir infecciones
nosocomiales resistentes a antibióticos (como la MRSA).
2. Streptococcus pyogenes
o Enfermedad: Causa faringitis estreptocócica (dolor de garganta),
escarlatina, fiebre reumática, y la fascitis necrosante (una
infección grave de los tejidos blandos).
3. Clostridium tetani
o Enfermedad: Provoca el tétanos, una enfermedad caracterizada
por rigidez muscular y espasmos debido a la toxina producida por
la bacteria.
Bacterias Gram negativas:
1. Escherichia coli
o Enfermedad: Aunque muchas cepas son parte de la flora
intestinal normal, algunas pueden causar infecciones urinarias,
diarrea, y en casos más graves, septicemia y síndrome urémico
hemolítico (SHU).
2. Salmonella enterica
o Enfermedad: Causa salmonelosis, que generalmente se
manifiesta como una infección gastrointestinal con síntomas como
diarrea, fiebre y dolor abdominal.
3. Pseudomonas aeruginosa
o Enfermedad: Provoca infecciones en personas
inmunocomprometidas, especialmente en quemaduras,
infecciones pulmonares (como en pacientes con fibrosis quística),
y puede causar infecciones en heridas o tracto urinario.
En esta imagen podemos
observar los materiales que se
utilizaron para esta prueba
Se coloco la gota de solución
salina para frotis
Se coloco el asa de platino
en la flama para tomar la
muestra
Se coloco la muestra de
bacterias en el portaobjetos
con la solución salina y se
procedió a esparcir para su
observación
Colocar cristal violeta sobre la
muestra por 1 minuto
Se lavo después la muestra con
agua y se esperó a secar
Se coloco yodo iugol por un
minuto se lavó y se dejó secar
Se decoloro con alcohol por un
minuto se lavó y dejo secar
Por último, se tiñe con
safranina y se lava y se deja
secar y se procede a observar
bajo el microscopio
Por último, para secar más
rápido se pasó en el mechero
Resultado:
En la tinción de Gram, observamos que las bacterias se tiñen de color
violeta. Esto indica que las bacterias son grampositivas, lo que significa que
tienen una pared celular gruesa compuesta principalmente por peptidoglicano.
Al examinar el microscopio, las bacterias aparecieron en forma de cocos
(bacterias redondas) y se agrupaban en cadenas cortas o en algunos casos
en pares.
Conclusión:
El resultado de la tinción de Gram nos permite clasificar las bacterias
observadas como grampositivas y, según su forma y agrupación, podrían ser
parte del grupo de estreptococos. La tinción de Gram es una herramienta
clave en microbiología porque nos ayuda a diferenciar entre bacterias
grampositivas y gramnegativas, lo cual es fundamental para decidir el
tratamiento adecuado, ya que estas dos clases de bacterias responden de
manera diferente a los antibióticos.
Bibliografía:
Madigan, M. T., Bender, K. S., Buckley, D. H., Sattley, W. M., & Stahl, D. A. (2021). Brock Biology
of Microorganisms (16th ed.). Pearson.
Forbes, B. A., Sahm, D. F., & Weissfeld, A. S. (2016). Bailey & Scott’s Diagnostic Microbiology
(14th ed.). Elsevier.
