Diagnostic biologique, caractérisation moléculaire et

identification de nouveaux gènes impliqués dans des

thrombopathies congénitales non étiquetées
Arnaud Dupuis

To cite this version:

Arnaud Dupuis. Diagnostic biologique, caractérisation moléculaire et identification de nouveaux gènes
impliqués dans des thrombopathies congénitales non étiquetées. Hématologie. Université de Stras-
bourg, 2015. Français. �NNT : 2015STRAJ078�. �tel-01393368�

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abroad, or from public or private research centers. publics ou privés.
 Université de STRASBOURG

ÉCOLE DOCTORALE VIE ET SANTE (ED 414)

Thèse présentée par Arnaud DUPUIS

Unité INSERM UMR S949

pour obtenir le grade de : !"#$%&'($')*%+,-$&.,#/'($'0#&1.2!%&3

Soutenue le : 14 Décembre 2015

Discipline/Spécialité : Hématologie et physiopathologie vasculaire

DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE, CARACTERISATION

MOLECULAIRE ET IDENTIFICATION DE NOUVEAUX
GENES IMPLIQUES DANS DES THROMBOPATHIES
CONGENITALES NON ETIQUETEES

Thèse dirigée par :

M. GACHET Christian, Professeur conventionné, université de Strasbourg

Membres du Jury :
Mme GOUDEMAND Jenny, Professeur, université de Lille II (Rapporteur)
Mme ALESSI Marie-Christine, Professeur, !"#$%&"'()*+Aix-Marseille (Rapporteur)
Mme DOLLFUS Hélène, Professeur, université de Strasbourg
 Remerciements

Je remercie !"#$ %& $"'& (")*"+,$&-.&/!"0/1, ."#2($"%3/42&$"# $%&-"53&!.67$ $"'38./9'&-- % !."

:$/!;/&-"5("</!7"='-/1 ">"'/"?&!"5 "'3/!!6 "@AB@"&%%65&/. % !."/#$C-"'/" fin de mon internat.
D& !"E(36./!."56F>"9&2'27&-. "-#61&/'&-6" !",6%/.2'27& G"'38:<"='-/1 " ."'3(!&.6"HI<8J)"K)J"
<LML"%32!."$6 '' % !."?/&."$ 5612(4$&$"'3(!&4 $-"#/--&2!!/!."5 -"#'/E( .. -"-/!7(&! -*")*"0/1, ."
%3/".$C-"$/#&5 % !."?/&."12!?&/!1 "5/!-"'3 N $1&1 "5 "%/"#$2? --&2!"5 "9&2'27&-. " ."&'"%3/"52!!6"
les moyens nécessaires à la réalisation de ce tra4/&'*"+ .. ".,C- "53(!&4 $-&.6"!3/($/&. jamais pu
être menée à son terme sans son soutien aussi bien durant ces trois années de doctorat que durant
la rédaction de ce manuscrit. Je vous adresse M. Gachet un très grand merci.

O "42(5$/&-"67/' % !."$ !5$ ",2%%/7 "/(N".$2&-". 1,!&1& !! -"5("'/92$/.2&$ "53 N#'2$/.&2!"5 -"
fonctions plaquettaires P"Q6$2!&E( "R &%G"S2%&!&E( "+/-- '" ."T/.$&1&/"U/ (?? $*"+3 -."7$V1 aux
N#'2$/.&2!-"E( "!2(-"/42!-"$6/'&-6 -" !- %9' "E( "1 .. ".,C- "53(!&4 $-&.6"/"#("/92(.&$*"O3/&"(! "
# !-6 " #/$.&1('&C$ " #2($" Q6$2!&E( " E(&" %3/" /&56" E(2.&5& !! % !." '2$-" 5 " '/" $65/1.&2!" 5 " 1 "
manuscrit. Merci Véro pour les nombreuses relectures et toute '3/&5 "E( ".("%3/-"/##2$.6 "'2$-"5 "
'/"%&- " !"#/7 " ."'3&%#$ --&2!"5 "1 "521(% !.*

Un grand merci également à Amandine Baron pour son efficacité redoutable pour traquer les
coquilles au sein de ce manuscrit. Quel plaisir de pouvoir travailler avec une personne aussi
efficace !

) $1&"67/' % !.">".2(."' "# $-2!! '"5 "'38:<"='-/1 " ."/(N"% %9$ -"5 "'36E(&# "HI<8J)"K)J"
S949 pour les discussions que nous avons eu ensemble et pour tous les conseils que vous avez pu
me donner.

Enfin, je voudrais remercier ma fem% "=%6'& G"E(&G"%/'7$6"-2!".$/4/&'".$C-"#$ !/!."%3/"612(.6"

au quotidien (ou devrais-F "#'(.W."5&$ "-(##2$.6XY" ."E(&"%3/"/##2$.6".2(. "-2!" N# $.&- "5/!-"'/"
maitrise des logiciels de bureautique. Merci de .3Z.$ "211(#6 "- (' "5 "!2.$ "?&'-"Q/' !.&!"5($/!."
1 -"5 $!&C$ -"- %/&! -"%/'7$6"./"7$2-- -- "9& !"/4/!16 *"O "!3/($/&-"F/%/&-"#("$6/'&- $"1 ".$/4/&'"
sans ton soutien indéfectible.
Liste des abréviations

2MeSADP : 2-(Methylthio)adenosine5'-diphosphate
AA Acide Arachidonique
AC : Adénylate Cyclase
ADN : Acide Désoxyribonucléique
ADP : Adénosine Diphosphate
Afssaps : Agence française de sécurité sanitaire des produits de santé
AMPc : Adénosine Monophosphate cyclique
ANAES =7 !1 "I/.&2!/' "53=11$65&./.&2!" ."5384/'(/.&2!" !"</!.6
ANSM : Agence Nationale de Sécurité du médicament et des produits de santé
ARNm : Acide Ribonucléique messager
ATP : Adénosine Triphosphate
BLOCs : Biogenis of Lysosome Related Organelle Complexes
BSS : Syndrome de Bernard Soulier
CCPP : Centre de Compétences pour l'étude des pathologies Plaquettaires
CRPP : Centre de Référence des Pathologies Plaquettaires
CSH : Cellule souche Hématopoïétique
DAG : Diacide Glycérol
DTT : Dithiothréitol
ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay
ENTPD2 : Ecto-Nucléotide Triphosphate Diphosphohydrolase 2
FSK : Forskolin
FT : Facteur de Transcription
GAPDH : Glyceraldéhyde-3-Phosphate Déshydrogénase
GDP : Guanine Diphosphate
GTP : Guanine Triphosphate
GZ : Glanzmann
HA : Hémagglutinine
HPLC : Chromatographie Liquide Haute Performance
IBMX : 3-Isobutyl-1-Methylxanthine
INSERM : Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale
IP3 : Inisitol 1,4,5 diphosphate
IPD : Inherited Platelet disorder
IPF : Immature Platelet Fraction
ISTH : International Society of Thrombosis and Haemostasis
KO Knockout
MET : Microscopie Electronique à Transmission
MGG : May Grünwald Giemsa
NGS : Next Generation Sequencing
OMS : Organisation Mondiale de la Sante
PCR : Polymerase Chain Reaction
PGE1 : Prostaglandine E1
PGI2 : Prostacycline
PI3K : Phosphoinositide3-Kinase
PIP2 : Phosphatidyl Inisitol 4,5-diphosphate
PLC : Phospholipase C
PRPc : Plasma citraté Riche en Plaquettes
RCPG : Récepteur couplé aux Protéines G
SDS : Sodium Dodecyl Sulfate
SEM : Scanning Electron Microscopy
SNARE Soluble N-éthylmaleimide-sensitive-factor Attachment protein REceptor
SPD : Storage Pool Disease
TXA2 : Thromboxane A2
VASP : Vasodilator Stimulated Phosphoprotein
VNUT : Vesicular Nucleotides Transporter
VPM : Volume Plaquettaire Moyen
VWF : Facteur Willebrand
Table des ma !"#$%

Table des illustrations.........................................................................................................................................3

1 Introduction ...........................................................................................................................................6

1.1 K!"# ("53,&-.2&$ ............................................................................................................................7

1.1.1 Observations cliniques et microscopie optique ......................................................................7

1.1.2 Agrégométrie et microscopie électronique .............................................................................8

1.1.3 U3 --2$"5 "'/"9&21,&%& "5 -"#$2.6&! - ....................................................................................9

1.1.4 Le développement des anticorps monoclonaux ....................................................................10

1.1.5 U3C$ "5 "'/"9&2'27& "%2'61('/&$ ...........................................................................................11

1.2 Les plaquettes sanguines P"2$&7&! G"-.$(1.($ " ."?2!1.&2!-"5/!-"'3,6%2-./- "#$&%/&$ .................14

1.2.1 Origine des plaquettes sanguines..........................................................................................14

1.2.2 Structure des plaquettes sanguines .......................................................................................15

1.2.3 T,[-&2'27& "#'/E( ../&$ "/("12($-"5 "'3,6%2-./- "#$&%/&$ ..................................................20

1.3 Diagnostic et classification des thrombopathies ...........................................................................28

1.3.1 Stratégie diagnostique des thrombopathies ..........................................................................28

1.3.2 Présentation des principales thrombopathies........................................................................40

1.4 Problématique de la thèse .............................................................................................................52

2 Diagnostic des thrombopathies liées à des anomalies du récepteur P2Y12 et caractérisation des variants
du récepteur identifiés au laboratoire ...........................................................................................................53

2.1 Le récepteur P2Y12 ......................................................................................................................53

2.2 Le récepteur P2Y12 /("12($-"5 "'3/1.&4/.&2!"5 -"#'/E( .. -..........................................................55

2.3 Diagnostic des anomalies du récepteur P2Y12 ..............................................................................56

2.4 Les différents mutations décrites pour le récepteur P2Y12 ...........................................................58

2.5 Les variants du récepteur P2Y12 identifiés et caractérisés au laboratoire .....................................59

2.5.1 Mutation p.His187Gln du récepteur P2Y12 ..........................................................................59

2.5.2 Mutation p.Tyr259Cys du récepteur P2Y12 ..........................................................................69

2.5.3 Mutation p.Phe95Ser du récepteur P2Y12.............................................................................73

2.6 Diagnostic et caractérisation des anomalies du récepteur P2Y12 : discussion ..............................77

1
3 Recherche des gènes impliqués dans les maladies du pool vide non syndromiques (\-SPD).............79

3.1 Définition des \-SPD et stratégie diagnostique ............................................................................79

3.2 La découverte des \-SPD .............................................................................................................80

3.3 Biogénèse et sécrétion des granules denses plaquettaires ............................................................80

3.3.1 Biogénèse des granules denses .............................................................................................80

3.3.2 <61$6.&2!"5 -"7$/!(' -"5 !- -"/("12($-"5 "'3/7$67/.&2!"#'/E( ../&$ ...................................81

3.4 Les différents types de maladies du pool vide..............................................................................82

3.4.1 Les \-SPD syndromiques .....................................................................................................82

3.4.2 Les formes non syndromiques ..............................................................................................83

3.5 Recherche des gènes impliqués dans les maladies du pool vide non syndromiques avec déficit
isolé en ADP ............................................................................................................................................84

3.5.1 Exploration de la famille S et du propositus SJ ....................................................................84

3.5.2 Recherche des gènes impliqués dans la maladie du pool vide non syndromique diagnostiquée
chez certains membres de la famille S ................................................................................................88

3.6 Recherche des gènes impliqués dans la maladie du pool vide non syndromique :
conclusion/discussion ..............................................................................................................................95

4 Diagnostic et caractérisation des thrombopathies : discussion et perspectives ...................................96

5 Annexes .............................................................................................................................................105

5.1 Annexe 1.....................................................................................................................................105

5.2 Annexe 2.....................................................................................................................................124

5.3 Annexe 3.....................................................................................................................................144

5.4 Annexe 4.....................................................................................................................................154

6 Bibliographie .....................................................................................................................................161

2
&'()$*+$%*!)),% #' !-.%

Figure 1 : Différenciation mégacaryocytaire et production des plaquettes sanguines dans la moelle osseuse
..........................................................................................................................................................................15
Figure 2 : !"#$%&'()*+&,-%.)+//+&0%*1)2*+....................................................................................................17
Figure 3 Principaux constituants des organelles plaquettaires .......................................................................19
Figure 4: représentation des différents domaines du facteur Willebrand et de leurs rôles physiologiques
respectifs...........................................................................................................................................................21
Figure 5 : Structure générale du complexe GPIb-V-IX et principales voies de signalisation en aval du complexe
..........................................................................................................................................................................22
Figure 6 : Structure générale de la GPVI et principales voies de signalisation associées ..............................23
Figure 7 : 342*!2,%-+0&562+0&'+&021*%-20%/26*&%)&!6)40&'+&-(%!/25%/26*&,-%.)+//%24+ ........................................25
Figure 8 : 7!/25%/26*&'+&-(2*/#142*+&899:;< .......................................................................................................27
Figure 9 : Immunofluorescence indirecte réalisée sur des frottis sanguins fixés .............................................30
Figure 10 : Plaquettes sanguines en microscopie électronique à transmission ...............................................31
Figure 11 : =6)4:+&/>,2.)+&'(%14#1%/26*&'+0&,-%.)+//+0&")$%2*+0&+* PRPc après stimulation par le collagène
..........................................................................................................................................................................33
Figure 12 : =6)4:+0&*64$%-+0&'(%14#1%/26*0&,-%.)+//%24+0.............................................................................35
Figure 13 : /4%/#12+&'2%1*60/2.)+&,4#!6*20#+&,%4&)*&146),+&'+&/4%5%2-&')&!6$2/#&'+&0/%*'%4'20%/26*&'+&-(9 ?@&
+/&%,,-2!%:-+&%)&-%:64%/624+&'+&-(AB &7-0%!+ ..................................................................................................39
Figure 14 : Fréquences observées des différentes thrombopathies et thrombopénies constitutionnelles
étiquetées et non étiquetées en 2012 ................................................................................................................40
Figure 15 : 74:4+&1#*#%-612.)+&'+0&,%/2+*/0&C &'+&-(2-+&'+&-%&D#)*26* .........................................................48
Figure 16 : Structure linéaire du récepteur P2Y12 ...........................................................................................53
Figure 17 : Représentation en trois dimensions du récepteur P2Y12 cristallisé ...............................................54
Figure 18 : E62+0&'(%!/25%/26*&+*&%5%-&'+0&4#!+,/+)40&3FG1 et P2Y12...............................................................55
Figure 19 : D#1)-%/26*&'+&-%&.)%*/2/#&'(7H3!&2*/4%!+--)-%24+&+/&'+&-(#/%/&'+&,"60,"64>-%/26*&'+&-%&,46/#2*+&
E7 3&%,4I0&0/2$)-%/26*&'+0&,-%.)+//+0&,%4&-(7J3&6)&-%&3KA1 (ou PGI2) .......................................................57
Figure 20 : Structure linéaire (à gauche) et tridimensionnelle du récepteur P2Y 12 et localisation des trois
mutations identifiées au laboratoire.................................................................................................................60
Figure 21 : Agrégations plaquettaires réalisées chez le patient III-1 et chez un témoin du jour .....................61
Figure 22 : J60%1+&'+&-(7H3!&+*&4%'26-immunologie chez les plaquettes témoins (bleues) et les plaquettes du
patient III-1 (rouge)..........................................................................................................................................62
Figure 23: Expérience de saturation effectuée sur des plaquettes témoin (à gauche) et sur des plaquettes du
patient III-1 (à droite) ......................................................................................................................................63

3
Figure 24 : Expérience de compétition entre une concentration fixe de [ 3H]PSB-0413 (20 nM) et des
!6*!+*/4%/26*0&!46200%*/+0&'(7J3&LM&1%)!"+N&6)&de 2MeSADP (à droite) .....................................................64
Figure 25 O&H#/"6'+&'+&/4%*0P+!/26*&,+4$+//%*/&-(6:/+*/26*&'+&!+--)-+0&Q<FQRQ&%>%*/&2*!64,64#&-+&,-%0$2'e
pcDNA3 portant le cDNA du récepteur P2Y12 sauvage (cellules WTD12) ou muté (cellules CATC3)............65
Figure 26 : Expérience de saturation effectuée sur des cellules 1321N1 transfectées avec le récepteur P2Y 12
sauvage (à gauche) et sur des cellules 1321N1 transfectées avec le récepteur muté (à droite) ......................66
Figure 27 : Expérience de compétition entre une concentration fixe de [ 3H]PSB-0413 (20 nM) et des
!6*!+*/4%/26*0&!46200%*/+0&'(7J3&LM&1%)!"+N&6)&'+&FH+ 7J3&LM&'462/+N&LRS<N ..........................................67
Figure 28 : T)%*/2P2!%/26*&'+&-(7H3!&+*&4%'262$$)*6-612+&0)4&'+0&!+--)-+0&Q<FQRQ&U?JQF&/4%*0P+!/#+0&%5+!&
le récepteur P2Y12 sauvage (noir) et sur des cellules 1321N1 CATC3 transfectées avec le récepteur P2Y12
muté (blanc)......................................................................................................................................................68
Figure 29 : Agrégations plaquettaires réalisées chez le patient CJP et chez un témoin du jour .....................70
Figure 30 : Expérience de saturation effectuée sur des plaquettes témoin (à gauche) et sur des plaquettes de
CJP (à droite) ...................................................................................................................................................71
Figure 31 O&T)%*/2P2!%/26*&'+&-(7H3!&'%*0&-+0&,-%.)+//+0&')&,%/2+*/&L+*&46)1+N&+/&'%*0&-+0&,-%.)ettes témoins
(en bleu)............................................................................................................................................................72
Figure 32 : Agrégations plaquettaires réalisées chez la patiente KC et chez un témoin du jour .....................74
Figure 33 O&A5%-)%/26*&'+&-(%PP2*2/#&V3H]PSB-0413 pour le récepteur P2Y12 du quantification des récepteurs
plaquettaires chez la patiente KC, son père KM et sa mère KT.......................................................................75
Figure 34 : Agrégations plaquettaires réalisées en PRPc chez le propistus (SJ) et chez un témoin du jour
(CTRL) ..............................................................................................................................................................85
Figure 35 : Agrégations plaquettaires réalisées en plaquettes lavées chez le propositus (SJ, courbes rouges) et
chez un témoin du jour (courbes bleues) ..........................................................................................................86
Figure 36 : Dosage des nucléotides plaquettaires ............................................................................................87
Figure 37 : Plaquettes du propositus (SJ) observées en microscopie électronique à transmission .................87
Figure 38 : Arbre généalogique de la famille S ................................................................................................88
Figure 39 : !"#$%& 4#0)$#& '+& -%& 0/4%/#12+& '(%*%->0+& :26-informatique et des scénarios de transmission
%,,-2.)#0&M&-%&0)2/+&')&0#.)+*W%1+&'(+X6$+&'+&-%&P%$2--+& ............................................................................91
Figure 40 : Le transporteur de nucléotides VNUT ...........................................................................................92
Figure 41 : Immuno-empreintes (Western blot) réalisées sur un lysat de plaquettes témoin ou de plaquettes du
patients SJ ........................................................................................................................................................93
Figure 42 : Liste des gènes candidats qui présentent des mutations chez le père du propositus (SF) ainsi que
chez les trois enfants atteints (SJ, SCH et SM) .................................................................................................94
Figure 43 : Observat26*&+*&$2!460!6,2+&#-+!/46*2.)+&'+0&,-%.)+//+0&'()*+&,%/2+*/+&%//+2*/+&'()*+&$%-%'2+&')&
pool vide non syndromique avec rapport ATP/ADP > 10 ...............................................................................99
Figure 44 : 9$$)*6$%4.)%1+0&4#%-20#0&0)4&'+0&->0%/0&'+&,-%.)+//+0&'()*&/#$62*&6)&'()*&,%/2+*/&%//+2*/&'()*&
syndrome des plaquettes grises associé à un déficit en GPVI ........................................................................100

4
Figure 45 : 74:4+&'#!2026**+-&'#'2#&%)&'2%1*60/2!&'+0&%*6$%-2+0&'+0&562+0&'+&-(7J3&%)&!6)40&'+&-(%!/25%/26*&
des plaquettes. ................................................................................................................................................103

5
1 Introduction

La première description morphologique et fonctionnelle des plaquettes sanguines réalisée il y a environ 130
/!-"#/$"0&('&2"D&]]2]] $2G"?(."'/"#$ %&C$ "6./# "53(! "'2!7( "-(&. "5 "5612(4 $. -"E(&"# $%&. la caractérisation
5 "'/"#,[-&2'27& "#'/E( ../&$ "/("12($-"5 "'3,6%2-./- "#$&%/&$ *"I2(-"-/42!-"/(F2($53,(&"E( "' -"#'/E( .. -"
sanguines sont, avec le facteur Willebrand et la matrice sous-endothéliale riche en collagène, les acteurs
essentiels de la ?2$%/.&2!" 5(" 1'2(" #'/E( ../&$ " !61 --/&$ " >" '3/$$Z." 5 -" -/&7! % !.-*" + " %61/!&-% " ?/&."
&!. $4 !&$" 5 " !2%9$ (N" $61 #. ($-" #'/E( ../&$ -" E(&" #/$.&1&# !." /(N" 6./# -" 53/5,6-&2!, 53/1.&4/.&2! et
53/7$67/.&2!"#'/E( ../&$ . Les anomalies des récepteurs plaquettaires ou des voies de signalisation en aval de
ceux-ci entrainent alors des pathologies plaquettaires au potentiel hémorragique hétérogène. Grâce à la mise
/(" #2&!." 5 -" . 1,!&E( -" 53/7$67/.&2!" #'/E( ../&$ " !" .($9&5&%6.$& G" >" '329- $4/.&2!" 5 -" #'/E( .. -" !"
%&1$2-12#& "6' 1.$2!&E( G"/(N"5&??6$ !. -". 1,!&E( -"5 "9&21,&%& "5 -"#$2.6&! -" .">"'3 N#/!-&2!"5 "'/"9&2'27& "
moléculaire, nous connaissons dorénavant les mécanismes moléculaires et les anomalies génétiques qui
conduisent à certaines thrombopathies comme la maladie de Glanzmann ou le syndrome de Bernard-Soulier.
Une dizaine de pathologies plaquettaires liées à des anomalies des principaux récepteurs (GZ, BSS, GPVI,
P2Y12, TP^YG">"5 -"/!2%/'& - de facteurs de transcription (RUNX1, GATA-1, FLI1) ou à des anomalies du
cytosquelette plaquettaire (MYH9, WAS) sont ainsi bien caractérisées. Cependant, de nouvelles mutations
sont régulièrement mises en évidence et nécessitent toujours une étude approfondie afin de confirmer la
relation entre la mutation détectée et le phénotype observé chez les patients. En complément, les études
génétiques essentiellement réalisées chez des familles porteuses de thrombopathies congénitales ont plus
récemment permis 53&5 !.&?& $ les gènes responsables de maladies plaquettaires parfois étudiées depuis des
53/!!6 -*"+3 -t le cas notamment du syndrome des plaquettes grises rapporté dès les années 70 et dont nous
s/42!-" 52$6!/4/!." E(3&'" -." 5_" >" 5 -" %(./.&2!-" 5 " 5 (N" 7C! - : NBEAL2 ou GFI1B. Les grandes études
génétiques récentes ont #/$" /&'' ($-" # $%&-" '3&5 !.&?&1/.&2!" 5 " !2%9$ (N" 7C! -" &%#'&E(6-" 5/!-" 5 -"
thrombopathies non étiquetées touchant '3('.$/-.$(1.($ " #'/E( ../&$ " `TUBB1, FLNA, ACTN1), ainsi que
certaines voies de signalisation (ANKRD26, FERMT3, RASGRP2, PRKACG, TMEM16F). Malgré la mise en
évidence de toutes ces nouvelles entités syndromiques ou non syndromiques, la plupart des auteurs considèrent
E(3>" 1 " F2($, au moins 50% des thrombopathies ne sont pas encore étiquetées et par conséquent non
diagnostiquées. Cette situation p (."-3 N#'&E( $" !"#/$.& "#/$"'/"?/&9' "?$6E( !1 "5 "1 -"#/.,2'27& -"5/!-"'/"
population générale et par le faible nombre de laboratoires spécialisés 5/!-"'36.(5 "5 -"#'/E( .. -"-/!7(&! -*"
Les progrès de la génétique et des techniques de séquençage à haut débit sont une opportunité pour accélérer
'3&5 !.&?&1/.&2!"5 -"7C! -"$ -#2!-/9' -"5 "1 -"%/'/5& -*"I6/!%2&!-G"(!" ??2$."12'' 1.&?"-3/4C$ "!61 --/&$ "#2($"
. !. $"5 "12%9' $"' -"'/1(! -"5/!-"!2-"12!!/&--/!1 -*"=&!-&G"13 -."dans le cadre du $6- /("!/.&2!/'"536tude des
pathologies plaquettaire, que ' " '/92$/.2&$ " 53,6%2-./- " 5 " '38:<" ='-/1 " ." '3unité INSERM UMR S949
.$/4/&'' !."5 "12!1 $.">"'36.(5 " .">"'/"1/$/1.6$&-/.&2!"5 -"%/'/5& -"#'/E( ../&$ -"5&/7!2-.&E(6 -"5/!-"'/"#/$.& "
Nord-Est de la France. En collaboration avec les CHU du Grand-Est, la centralisation des explorations

6
plaquettaires complexes permet de disposer de moyens suffisants pour la réalisation des explorations et de
564 '2## $" (! " N# $.&- " /5/#.6 " >" '3&5 !.&?&1/.&2!" 5 " 1 -" #/.,2'27& -" !12$ " # u connues. Les échanges
permanents entre cliniciens, biologistes et chercheurs de cette grande région permettent ' "$ 1$(. % !."53(!"
grand nombre de cas impossibles à réunir de manière isolée. Grâce à cette démarche coopérative, nous avons
eu la #2--&9&'&.6" 53étudier à '38:<" ='-/1 " 5 " !2%9$ (N" .[# -" 5 ".,$2%92#/.,& -" `-[!5$2% " 5 -" #'/E( .. -"
grises, déficit en GPVI, variant du récepteur P2Y12, syndromes de Bernard-Soulier, maladie de Glanzmann,
maladies du pool vide). Afin de limiter ce manuscrit aux explorations les plus abouties réalisées depuis 2013,
nous avons choisi de présenter '36.(5 et la caractérisation de trois nouvelles mutations du récepteur P2Y12
&5 !.&?&6 -"5/!-".$2&-"?/%&'' -"5&??6$ !. -"/&!-&"E( "'36.(5 "53(! "?/%&'' "#2$. (- "53(!e maladie du pool vide.

1.1 K!"# ("53,&-.2&$

1.1.1 Observations cliniques et microscopie optique

La première description des plaquettes sanguines répertoriée remonte à la fin du XVIIème siècle et est attribuée
à Antoni van Leeuwenhoeck qui présenta ses observations sur le sang à la « Royal society of London » en
1675. Le siècle suivant Hewson donna en 1780 la première description morphologique des plaquettes en
parlant de « very small undefined particle in blood ». )/&-"13 -. le Français George Hayem qui, entre 1878 et
1879 (Hayem, 1879) (Hayem, 1878) établit une description précise des plaquettes en parlant de corpuscules
/[/!."'3/##/$ !1 "5 "# .&. s hématies pâles et « très délicates ». Il évoqua 56F>">"'36#2E( "'/"1/#/1&.6"5 "1 -"
éléments à adhérer aux autres composants du sang et à former des agrégats. Cependant, George Hayem émit
'3,[#2.,C- "53(! "2$&7&! "6rythroïde de ces cellules. Les plaquettes sanguines furent finalement considérées
comme un troisième type cellulaire sanguin suite aux travaux de Giulio Bizzozzero qui en 1882 évoqua
également les propriétés hémostatiques de ces éléments figurés du sang. Il décrivit alors les plaquettes comme
étant des cellules de forme biconvexe de 2 à 3 µm de diamètre circulant à la fois dans les veines et les artères.
Il démontra également à l3époque que ces cellules étaient 1/#/9' -"53/5,6$ $"-($"(! "-($?/1 "5 "4 $$ "2u sur
un endothélium '6-6G" 5 " 1,/!7 $" $/#&5 % !." 5 " ?2$% G" 536% ..$ " 5 " '2!7( -" #$2.$(-&2!-" ." 5 " ?2$% $" 5 -"
agrégats composés de plaque.. -G"5 "E( 'E( -"' (121[. -G"53hématies ainsi que de fibrine. Il en conclut alors
que « le thrombus est constitué de quelques leucocytes inclus dans une grosse masse plaquettaire » et que « ce
.,$2%9(-"5 4/&."Z.$ "53(! "&%#2$./!1 "1/#&./' "#2($"'3/$$Z."5 -",6%2$$/7& -"grâce à sa capacité à boucher les
brèches vasculaires (Bizzozero, 1881, Bizzozero, 1882). U3,[#2.,C- "5 "'3implication des plaquettes sanguines
dans l3/$$Z."5("-/&7! % !."?(."12!?&$%6 " !"BaLA"#/$"George Hayem. Ce dernier fit le lien entre la présence
53(! "thrombopénie chez les patients et '329- $4/.&2!"53(! "tendance hémorragique. Par la suite Duke montra
en 1910 que le test clinique 5(". %#-"5 "-/&7! % !."#/$"&!1&-&2!"5("'29 "5 "'32$ &'' "6./&."#$2'2!76" !"1/-"5 "
thrombopénie (Coller and Shattil, 2008). Quarante ans plus tard, le pédiatre suisse Eduard Glanzmann évoqua
les premiers cas de maladie plaquettaire (Glanzmann, 1918). Il décrivit une série de patients non

7
thrombopéniques qui présentaient un syndrome hémorragique cutanéo-muqueux. Ce phénotype hémorragique
était /--21&6">"(! "/!2%/'& "?2!1.&2!! '' "#'/E( ../&$ "%&- " !"64&5 !1 "#/$"'36.(5 "5 "'/"rétractation du caillot.
Il nomma alors cette thrombopathie héréditaire : hémorragie thrombasthénique. Trente ans plus tard, deux
hématologues français, Jean Bernard et Jean-Pierre Soulier décrivirent le cas de deux enfants présentant un
syndrome hémorragique majeur associé à un temps de saignement allongé et à une macrothrombocytopénie.
Ils nommèrent alors cette pathologie : « dystrophie thrombocytaire hémorragipare congénitale (Bernard and
Soulier, 1948).

O(-E(3/(" 569(." 5 -" /!!6 -" bAG" # (" 532(.&'-" 5&/7!2-.&E( -" 6./& !." 5&-#2!&9' -" #2($" 6.(5& $" 'es maladies
plaquettaires. Seuls la microscopie optique, la numération sanguine, le temps de saig! % !." ."'36.(5 "5 "'/"
rétraction du caillot permettaient de caractériser les thrombopathies. Avec ces techniques simples, les
cliniciens et scientifiques ont ainsi individualisé quelques pathologies plaquettaires identifiées essentiellement
par des anomalies morphologiques importantes :

- Les anomalies dites de « May-Hegglin » présentées pour la première fois par Richard May en 1909
chez un patient associant une macrothrombocytopénie et '/"#$6- !1 "53&!1'(-&2!s basophiles bleutées
et persistantes dans le cytoplasme des leucocytes (May, 1909). Ces observations furent complétées en
1945 par Robert Hegglin qui précisa le caractère héréditaire de la pathologie (Hegglin, 1945). Cette
anomalie ne sera regroupée avec les syndromes de Fechtner et Sebastian sous le nom de syndrome
)cRL"E(3 !"@AAAX (Seri et al., 2000)
- Le syndrome 53R $%/!-d[-Pudlak dont la première description fut publiée par Frantisek Hermansky
et Paulus Pudlak en 1959 (Hermansky and Pudlak, 1959). + -"5 (N"%65 1&!-"#$6- !.C$ !."'3,&-.2&$ "
de deux patients albinos non apparentés présentant un syndrome hémorragique modéré caractérisé par
(!". %#-"5 "-/&7! % !."/''2!76" !"'3/9- !1 "5 thrombopénie.

1.1.2 Agrégométrie et microscopie électronique

Deux technologies révolutionnèrent par la suite '36.(5 "5 -"#/.,2'27& -"#'/E( ../&$ - P"'3agrégométrie en 1962
et la microscopie électronique /##'&E(6 ">"'329- $4/.&2!"5("-/!7"5/!- les années 1950. Décrit en 1962 par
Gustav Born (Born, 1962) ." e39$& ! (O'Brien J, 1962), un agrégomètre est un photomètre qui permet de
mesurer la transmission lumineuse au travers 53une cuvette thermostatée dans laquelle une solution ou une
suspension est sous agitation constante. Cette technique turbidimétrique permet de mesurer in vitro les
capacités des plaquettes à former des agrégats après stimulation par divers agonistes appelés agents agrégants.
Les agrégats formés au cours de la réaction entrainent un éclaircissement du milieu réactionnel dont la
cinétique -."1/$/1.6$&-.&E( "5 "'3/7 !."/7$67/!."(.&'&-6*"U -"5&??6$ !. -"42& -"53/1.&4ation plaquettaire peuvent
#2. !.& '' % !."Z.$ "6.(5&6 -"5 "%/!&C$ "&!56# !5/!. *"SC-"'3&!4 !.&2!"5 "1 .. "technologie, plusieurs équipes
testèrent les plaquettes des patients atteints de thrombasthénie de Glanzmann et démontrèrent E(3 '' -"étaient
incapa9' -" 53/7$67 $" !" $6#2!- " >" (! " -.&%('/.&2!" #/$" '3=ST" `/56!2-&! " f3-diphosphate), le collagène,

8
'3/5$6!/'&! , la sérotonine et la thrombine (Zucker et al., 1966). La première 1/$/1.6$&-/.&2!" 53(!" 56?&1&."
fonctionnel plaquettaire avait ainsi été réalisée.

U3(.&'&-/.&2!"5("%&1$2-12# électronique à transmission permit 53/1165 $"à '329- $4/.&2!"5 "'3ultrastructure

#'/E( ../&$ " ." !"#/$.&1('& $"5 -"2$7/! '' -". '' -"E( "' -"7$/!(' -"^" ."\. James G White publia une revue en
1971 (White and Gerrard, 1976) qui proposa une description extrêmement moderne des thrombopathies avec
anomalie morphologique. Il décrivit alors les maladies du pool vide `\-SPD pour \-Storage Pool Disease) en
séparant déjà les entités syndromiques (Hermansky-Pudlak) des entités non syndromiques. Il observa
également des petites plaquettes provenant de patients atteints de syndrome de Wiskott-Aldrich découvert en
1954. Il mit en évidence les plaquettes « vides 532$7/! 'les» chez un patient atteint du syndrome des plaquettes
grises ainsi que les anomalies de May-Hegglin et débuta '329- $4/.&2!" 5 -" macrothrombocytopénies en
général. Enfin, il étudia les macro-plaquettes des patients atteints du syndrome de Bernard-Soulier et montra
que celles-ci ne présentaient pas de déficit en organelles intracellulaires.

1.1.3 U3 --2$ de la biochimie des protéines

A partir des années 19gAG"' "564 '2## % !."5 -". 1,!&E( -"53électrophorèse permit non seulement la détection
des principales glycop$2.6&! -" #'/E( ../&$ -" %/&-" -($.2(." 53 ?? 1.( $" '/" 12$$6'/.&2!" !.re une absence de
glycoprotéine ." (! " /!2%/'& " ?2!1.&2!! '' " $ -#2!-/9' " 53(!" -[!5$2% " ,6%2$$/7&E( * U3(.&'&-/.&2!" 5 "
'3électrophorèse en gel de polyacrylamide utilisant un agent détergent ionique (le sodium dodecyl sulfate :
SDS) autorisa 53/92$5 la séparation de différentes protéines membranaires plaquettaires en fonction de leur
taille (Nachman and Ferris, 1972). Trois glycoprotéines majeures furent alors individualisées : la GPI (future
GPIb), la GPII (future GPIIb) et la GPIII (future GPIIIa) (Nurden, 2007)*"U -".$/4/(N"53='/!"I($5 !"et de
Jacques Caen (Nurden and Caen, 1974) réalisés à Paris sur des membranes de plaquettes de patients atteints
de thrombasthénie de Glanzmann (GZ) %&$ !." !"64&5 !1 "'3/9- !1 "5 "5 (N"#$2.6&! -"%/F2$&./&$ - : la GPII
." '/" 0THHH*" U3/9- !1 " 5 " 1 -" 7'[12#$2.6&! -" ?(." $/#&5 % !." 12$$6'6 " /4 1" '3&!1/#/1&.6" 5 -" #'/E( .. -" 5 -"
patients GZ à agréger après stimulation par divers agonistes. Ces données furent également complétées par les
tests de liaison de fibrinogène (Mustard et al., 1978) qui montrèrent '3&!1/#/1&.6"5 -"#'/E( .. -"#$24 !/!."5 "
patients GZ à lier le fibrinogène même après activation de celles-ci #/$"'3=ST" ."'3adrénaline (Bennett and
Vilaire, 1979). Les techniques 536' 1.$2#,2$C- " !" 5 (N" 5&% !-&2!-" /--21&6 -" >" '3(.&'&-/.&2!"
53&%%(!27'29('&! -" issues de lapins immunisés contre des plaquettes humaines (immunoélectrophorèses
croisées) (Hagen et al., 1979) permirent #/$" '/" -(&. " 53&!5&4&5(/'&- $" -ix glycoprotéines plaquettaires et de
$646' $"'3/--21&/.&2!"5 la GPIIb et la GPIIIa précédemment identifiées -2(-"'/"?2$% "53(!"12%#' N "56# !5/!."
du calcium : la GPIIb-IIIa (Kunicki et al., 1981). + .. "7'[12#$2.6&! "- $/"$ 12!!( "#'(-"./$5"12%% "'3&!.67$&! "
^IIbh3 (Coller and Shattil, 2008). U3(.&'&-/.&2!" 5 " '3&%%(!26' 1.$2#,2$C- " 1$2&-6 " /##'&E(6 " >" '36.(5 " 5 -"
plaquettes provenant de patients GZ permit 53/??&! $" '/" 1/$/1.6$&-/.&2!" 5( défaut fonctionnel plaquettaire
12$$6'6" >" '3absence de glycoprotéine (Hagen et al., 1980)*" U3&!.$25(1.&2!" 5 " '36' 1.$2#,2$C- " !" 12!5&.&2!"
réductrice (SDS-PAGE) précisa rapidement que la sous-(!&.6"0THH9"6./&."12%#2-6 "53(! "1,/&! "'2($5 " ."

9
53(! "1,/&! "'67C$ "liées par des ponts disulfures et que la sous unité GPIIIa comportait au moins un pont
disulfure intra-caténaire.

En suivant le même .[# "5 "$/&-2!! % !." ." !"(.&'&-/!."' -". 1,!&E( -"%25 $! -"5 "'36#2E( G"' -"#'/E( .. -"
sanguines des patients atteints du syndrome de Bernard-Soulier (BSS) furent caractérisées #/$"'3absence de
glycoprotéine GPIb (Grottum and Solum, 1969) (Clemetson et al., 1982) (Hagen et al., 1980) et par une
in1/#/1&.6" >" -3/77'(.&! $" !" #$6- !1 " de facteur Willebrand et de ristocétine (antibiotique extrait du
champignon : Amycolatopsis lurida ."/[/!."'/"#$2#$&6.6"53 !.$/&! $"'3/77'(.&!/.&2!"5 -"#'/E( .. -" !"#$6- !1 "
de facteur Willebrand (VWF) via la GPIb plaquettaire). U " 56?&1&." 53/5,6-&2!" /(" -2(--endothélium des
plaquettes provenant des patients BSS fut rapidement mis en évidence et permit '3&5 !.&?&1/.&2!"5 "'3&!. $/1.&2!"
entre la GPIb et le VWF.

8!"#/$/''C' "5 "'3&5 !.&?&1/.&2!"5 -"#$2.6&! -"&%#'&E(6 -"5/ns les maladies de GZ et les syndromes de BSS, la
9&21,&%& "5 -"#$2.6&! -"5("569(."5 -"/!!6 -"aA"52!!/"(!"/# $;("5 "'3,6.6$276!6&.6"5 -"#$2.6&nes membranaires
plaquettaires.

1.1.4 Le développement des anticorps monoclonaux

Dès 1980, le développement des anticorps monoclonaux dirigés contre les récepteurs plaquettaires (McEver
et al., 1980) a permis 53/??&! $"'/$7 % !."les connaissances sur les plaquettes ."53&5 !.&?& $"5 ".$C-"!2%9$ (N"
/1. ($-" 5 " '/" #,[-&2'27& " #'/E( ../&$ *" 8!" ?? .G" ' -" N#6$& !1 -" 53&%%(!2#$61&#&./.&2!" 12(#'6 -" /(N"
. 1,!&E( -" %25 $! -" 536' 1.$2#,2$C- " ont permis une caractérisation précise des différents partenaires des
#$2.6&! -"53&!térêt. En particulier, la découverte de la GPV et de la GPIX, 9& !"12!!( -"/(F2($53,(&"12%% "
étant associées à la GPIb pour former le complexe GPIb-V-IX, ont été mises en évidence un peu plus
./$5&4 % !." >" '3/&5 " 53 N#6$& !1 s de co-immunoprécipitation utilisant un anticorps monoclonal (FMC25)
dirigé contre la GPIb (Berndt et al., 1983). Quelques années plus tard, la GPVI fut caractérisée grâce à deux
équipes : celle de Sugiyamqui mit e!"64&5 !1 "'/"#$6- !1 "53(!"/!.&12$#-"5&$&76"12!.$ "(ne protéine de 62 kDa
chez un patient présentant un purpura thrombopénique idiopathique (Sugiyama et al., 1987) et '36E(&# "5 "
Moroi Masaaki qui 56%2!.$/" E( " '3/!.&12$#-" 5612(4 $." #/$" <(7iyama était dirigé contre la GPVI, une
7'[12#$2.6&! "#'/E( ../&$ "1/#/9' "5 "'& $"' "12''/7C! " ."53 !.$/&! $"'3/7$67/.&2!"des plaquettes (Moroi et al.,
1989). Par ailleurs, l3(.&'&-/.&2!"5 "'/"1[.2%6.$& " !"?'(N"permet la quantification précise des glycoprotéines
membranaires mais aussi plus récemment '36.(5 "5 -"42& -"5 "-&7!/'&-/.&2!"&!.$/-cellulaires. Bien entendu, ces
. 1,!&E( -" &%%(!2'27&E( -" !61 --&. !." '/" 76!6$/.&2!" 53/!.&12$#-" %2!21'2!/(N" -#61&?&E( -" 5 -" 1&9' -"
pro.6&E( -" 53&!.6$Z.*" +eci inclut les spécificités de conformation (état activé ou non activé) ainsi que la
spécificité liée aux modifications post-traductionnelles des protéines au cours de la vie des cellules
(phosphorylation par exemple). Il est important de noter E(3 ! 2015, !2(-" ! " 5&-#2-2!-" #/-" 53/!.&12$#-"
monoclonaux dirigés contre certaines protéines plaquettaires et leur caractérisation passe alors par '3(.&'&-/.&2!"
de techniques alternatives.

10
1.1.5 U3C$ "5 "'/"9&2'27& "%2'61('/&$

Le milieu des années 80 annonce '36% $7 !1 " 5 -" !2(4 '' -" %éthodes de biologie moléculaire. Dès 1987
(Fitzgerald et al., 1987) (Bray et al., 1987), les techniques de clonage et de séquençage suivant la méthode de
Sanger (Sanger et al., 1977) permirent '3identification des gènes codant pour les deux sous-unités de la GPIIb-
IIIa (ITGA2B et ITGB3 respectivement pour les sous-unités GPIIb et GPIIIa) et les localisèrent sur le
1,$2%2-2% "Bg"1, ]"'3R2%% *"U -"/'&7! % !.-"5 "-6E( !1 s indiquèrent également que la GPIIb-IIIa fait
#/$.& "53(! "7$/!5 "?/%&'' "5 "#$2.6&! -"/5,6-&4 -"12%#2-6 -"-[-.6%/.&E( % !."53(! "-2(--unité ^" . 53(! "
sous-unité h : les intégrines (Hynes, 1987). Afin de correspondre à la nomenclature de ces intégrines, la GPIIb-
IIIa changea /'2$-"5 "!2%"#2($"-3/## ' $"'3&!.67$&! "^IIbhi*"(Dans la suite de ce document, nous nommerons
indifféremment cette glycoprotéine la GPIIb-999%&6)&-(2*/#142*+&899:;<N. Les travaux réalisés à la fin des années
80 et dans les années 90 mirent en évidence E( " '3&!.67$&! " ^IIbhi" '&/!." !.$ " /(.$ " ' " ?&9$&!27C! " $ ste
'3&!.67$&! "'/$7 % !."%/F2$&./&$ "`fA 000 à 80 000 copies présentes sur la membrane des plaquettes au repos).
Toutefois, quatre autres protéines de la même famille sont présentes sur la membrane des plaquettes en quantité
bien plus faible P" ^@hBG" ^fhBG ^bhB" ." ^Vhi* Le séquençage des protéines se liant aux intégrines permit
67/' % !." 5 " % ..$ " !" 64&5 !1 " ' -" %2.&?-" # #.&5&E( -" &!5&-# !-/9' -" >" '3&!. $/1.&2!" $61 #. ($j'&7/!5"
partiellement redondante de cette classe de protéines adhésives. Ainsi le motif RGD (Arg-Gly-Asp) présents
sur la fibronectine, le VWF, la vitronectine, la thrombospondine et le fibrinogène permit de comprendre la
$/&-2!"5 "'/"?&N/.&2!"5 "1 -"5&??6$ !.-"'&7/!5-"-($"'3&!.67$&! "^IIbhi tandis que la portion docecapeptide -
terminale du fibrinogène lui est unique et joue un rôle important dans la liaison à '3&!.67$&! "(Timmons et al.,
1984).

De nombreux récepteurs plaquettaires dont la présence à la surface des plaquettes et le rôle au cours de la
physiologie plaquettaire étaient déjà suspectés furent /'2$-"1'/&$ % !."&5 !.&?&6-*"+3 -."' "1/-"!2./%% !."#2($"
les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) tel que le premier récepteur de la thrombine PAR-1 qui fut
cloné et caractérisé en 1991 (Vu et al., 1991). De même, les récepteurs purinergiques P2 furent clonés et
séquencés à partir de 1993 pour le récepteur P2Y1 de poulet (Webb et al., 1993) F(-E(3en 2001 pour le récepteur
P2Y12 (Hollopeter et al., 2001) /'2$-"E( "' ($"&%#'&1/.&2!"5/!-"'3/1.&4/.&2!"#'/E( ../&$ "6./&."6.(5&6e depuis des
décennies (Mills, 1996) (Gachet, 2001). De manière concomitante, les techniques de PCR (polymerase chain
reaction) associées au séquençag " 5 -" 7C! -" 53&!.6$Z." # $%&$ !. petit à petit de mettre en évidence des
mutations chez des patients atteints de pathologies plaquettaires déjà caractérisées au niveau fonctionnel.
L3&!.$25(1.&2!"5 "1 -"7C! -"%(.6-"dans des lignées cellulaires grâce à des techniques de transfection et/ou la
76!6$/.&2!" 53/!&%/(N" 76!6.&E( ment modifiés exprimant ou non les protéines mutantes 53&!.6$Z." ."
reproduisant la pathologie humaine permettent dorénavant de corréler le phénotype observé avec la présence
53/!2%/'& - génétiques précises. De cette manière, un spectre de mutations délétères parfois très étoffé est
régulièrement mis à jour dans des banques de données dédiées à des pathologies précises. Plusieurs centaines
de mutations ont ainsi été décrites pour être responsables des maladies de Glanzmann (Mount-Sinai-School-

11
of-Medicine) et de Bernard-Soulier (Savoia et al., 2014). U3 --2$"5 "'a bio-informatique et des capacités de
modélisation in silico des structures tridimensionnelles des protéines complètent ces données moléculaires par
des prédictions de modification de structure responsables des anomalies fonctionnelles observées in vitro et in
vivo. Ces modélisations et les prévisions structurales qui en découlent peuvent également être confirmées par
les études en cristallographie lorsque les dites molécules ont pu être cristallisées avec une résolution suffisante.
T/$" /&'' ($-G" '3(.&'&-/.&2!" 532$7/!&-% -" 76!6.&E( % !." %25&?&6-" -." devenue un outil indispensable pour la
compréhension des mécanismes moléculaires responsables de-" #/.,2'27& -" 29- $46 -" 1, ]" '3Romme. De
nombreuses thrombopathies disposent ainsi de leur modèle animal et cette approche est particulièrement
&!.6$ --/!. "#2($"'36.(5 "5 - thrombopénies congénitales. En effet, la culture des précurseurs plaquettaires, les
%67/1/$[21[. -G"F(-E(3>"'36./# "('.&% "5 "'&96$/.&2!"5 "#'/E( .. -"?2!1.&2!! '' -"!3 -."/1.( '' % !."%/&.$&-6 "
que par très peu 53équipes dans le monde. Les modèles animaux sont donc un moyen précieux pour étudier les
mécanismes de maturation et de différenciation des mégacaryocytes qui conduisent à ces pathologies (voir
annexe 1 « Apport des modèles murins dans les thrombopénies constitutionnelles »). Cependant, la recherche
de mutation par séquençage ciblé complétée par une 64/'(/.&2!"5("#2. !.& '"56'6.C$ "5 "'3/!2%/'& "in silico et
dans un modèle cellulaire adapté !3 -."possible que si le gène responsable de la pathologie est connu.

Les nouvelles techniques de séquençage à haut débit (autrement appelées NGS pour Next Generation
Sequencing) développées depuis 2005 permettent de séquencer des milliards de bases nucléotidiques de
manière très rapide et à faible coût. Ces nouvelles technologies permettent dorénavant de séquencer tout ou
#/$.& "53(!"76!2% "1, ]"(! "2("#'(-& ($-"# $-2!nes en une seule manipulation. Son application principale
correspond à '/"#2--&9&'&.6"5 "$ 1, $1, $"5 -"%(./.&2!-"5/!-"(!" !- %9' "5 "7C! -"42&$ "5/!-"'3 N2% "2("' "
génome complet de patients présentant des anomalies fonctionnelles identiques et bien caractérisées. Le
1$2&- % !."5 -"52!!6 -"5 "-6E( !;/7 "29. !( -"1, ]"#'(-& ($-"#/.& !.-">"'3/&5 "532(.&'-"9&2-informatiques
# $% ." /'2$-" 5 " % ..$ " !" 64&5 !1 " 5 " !2(4 /(N" 7C! -" -(-1 #.&9' -" 53Z.$e impliqués dans les défauts
?2!1.&2!! '-"#$6/'/9' % !."&5 !.&?&6-*"+ -"/!/'[- -"53 N2% -"2("5 "76nomes complets sont actuellement à
'32$&7&! " 5 " '3identification de nombreux gènes responsables de thrombopathies dont voici quelques
exemples :

- ACTN1 codant pour '3^-actinine dont ' -" %(./.&2!-" -2!." $ -#2!-/9' -" 53(! " %/1$2.,$2%92#6!& "
modérée sans syndrome hémorragique (Gueguen et al., 2013, Kunishima et al., 2013)
- Deux gènes impliqués de manière mutuellement exclusive dans le syndrome des plaquettes grises :
NBEAL2 (Albers et al., 2011) (Gunay-Aygun et al., 2011) (Kahr et al., 2011) ou GFi1B (Monteferrario
et al., 2014).
- Le gène RASGRP2 125/!."#2($"' "?/1. ($"5361,/!7 "5("0ST"+/'S=0-08:H" ."$ -#2!-/9' "53(! "
thrombopathie particulièrement hémorragique (Canault et al., 2014)
- Le gène PRKACG codant pour la sous-(!&.6"k"53(! "#$2.6&! "d&!/- "56# !5/!. "5 "'3=)T cyclique
(AMPc) ."$ -#2!-/9' "53(! "%/1$2.,$2%92#6!& à tendance hémorragique modérée (Manchev et al.,
2014).

12
Dans chaque 1/-G" '3&5 !.&?&1/.&2!" 5 " 7C! -" 5 " susceptibilité grâce aux techniques NGS nécessite
obligatoirement une confirmation fonctionnelle in vitro ou mieux encore in vivo. Les techniques de biochimie
5 -" #$2.6&! -G" '329- $4/.&2!" !" %&1$2-12#& " 2#.&E( " ." 6' 1.$2!&E( G" '/" 1/$/1.6$&-/.&2!" #,6!2.[#&E( " 5 -"
cellules ou /!&%/(N" 53&!.6$Z." ." '364/'(/.&2!" 5 -" &!. $/1.&2!-" $61 #. ($-j'&7/!5-" /&!-&" E( " ' -" 42& -" 5 "
-&7!/'&-/.&2!" !"/4/'"$ -. !."52!1"/9-2'(% !."&!5&-# !-/9' -"#2($"12!?&$% $"'3&%#(./9&'&.6"5 -"%(./.&2!-"5 "
ces nouveaux gènes dans le phénotype observé chez les patients.

Depuis la découverte des plaquettes sanguines, l3(.&'&-/.&2!"5 -"5&??6$ !. -". 1,!&E( -"564 '2##6 -"/"# $%&-
53/4/!1 $"5/!-"la compréhension de la physiologie plaquettaire et de la physiopathologie des thrombopathies.
U3(!&.6"HI<8J)"UMR S949 et l "'/92$/.2&$ "53,6%2-./- "5 "'38:<"='-/1 , qui travaillent en coopération
permanente, participent /1.&4 % !." >" '3&5 !.&?&1/.&2!" ." >" '/" 1/ractérisation de ces pathologies souvent peu
connues et par conséquent encore sous-diagnostiquées. Ainsi, dans la cadr "5("$6- /("!/.&2!/'"536.(5 "5 -"
pathologies plaquettaires, l -"#/.& !.-"/.. &!.-"5 "-[!5$2% -",6%2$$/7&E( -"#$&-" !"1,/$7 "5/!-"'3&!. $-région
grand-8-."-2!."$67('&C$ % !."/5$ --6-"/("'/92$/.2&$ " !"1/-"5 "-(-#&1&2!"53/!2%/'& "#'/E( ../&$ *"S "1 "?/&.G"
no(-"/42!-"'/"#2--&9&'&.6"536.(5& $"de nombreux cas de thrombopathies différentes : syndrome de Bernard-
Soulier, maladies de Glanzmann, syndromes des plaquettes grises, déficit en GPVI, anomalie du récepteur
P2Y12 et maladie du pool vide.

Nous présenterons, 5/!-"1 "%6%2&$ "5 ".,C- "53(!&4 $-&.6G"une description actualisée des plaquettes sanguines
et 5 "' ($"$W' "5/!-"'3,6%2-./- "#$&%/&$e. Puis nous dresserons (!"6./."5 "'3/$."5 -". 1,!&E( s actuellement
utilisées lors du diagnostic des thrombopathies dont nous tenterons de proposer une classification pertinente.
Enfin, nous décrirons plus en détail '36.(5 "des thrombopathies congénitales liées à des anomalies des voies
53/1.&4/.&2!" #'aq( ../&$ -" 56# !5/!. -" 5 " '3=ST" à savoir trois cas de variants du récepteurs P2Y12 et une
?/%&'' "#2$. (- "53(! maladie du pool vide non syndromique avec déficit sélectif en ADP dans les granules
denses.

13
1.2 Les plaquettes sanguines : origine, structure et fonctions dans
'3,6%2-./- "#$&%/&$

U3,6%2stase primaire correspond à la première 6./# "5("#$21 --(-",6%2-./.&E( "52!."'329F 1.&?" -."'3/$$Z."5("
saignement en cas de brèche vasculaire. La formation du clou plaquettaire fait intervenir trois acteurs
essentiels : les plaquettes sangui! -G" '3 !dothélium vasculaire avec la matrice sous-endothéliale et une
macromolécule de très haut poids moléculaire : le facteur Willebrand. Nous nous focaliserons dans cette partie
sur les plaquettes sanguines et nous présenterons brièvement leur origine, leur structure et leur physiologie au
12($-"5 "'3,6%2-./- "#$&%/&$ *

1.2.1 Origine des plaquettes sanguines

Les plaquettes sanguines sont des éléments figurés du sang anucléés produits à partir de précurseurs
médullaires polyploïdes de grande taille : les mégacaryocytes (Lordier et al., 2008). Au cours de leur
maturation, les mégacaryocytes subissent #'(-& ($-"1[1' -"53 !52mitoses et acquièrent la machinerie cellulaire
nécessaire à la production 53 !4&ron 2000 plaquettes par mégacaryocyte mature. En parallèle, le cytoplasme
subit une maturation et acquiert un système de membranes de démarcation (DMS) (Eckly et al., 2014). Ce
DMS est un réseau de membranes internes qui remplit tout le cytoplasme et qui est connecté à la surface du
mégagaryocyte.

Le processus de différenciation et de maturation des mégacaryocytes à partir des cellules souches

hématopoïétiques est régulé #/$"'3 N#$ --&2!"-6E( !.& '' "5 "?/1. ($-"5 ".$/!-1$&#.&2!"`0=l=-1, RUNX1 etc.)
et par plusieurs cytokines (Kaushansky, 2008). Le SCF (Stem Cell Factor) ." '3&!. $' (d&!e 3 agissent
essentiellement au cours des premiers stades de différenciation alors que la thrombopoïétine (TPO) qui se lie
à son récepteur mégacaryocytaire (cMPL) est absolument indispensable tout au long du processus qui mène à
la génération de mégacaryocytes matures (Kaushansky, 1995) dits proplaquettogènes. Les interleukines 6 et
11 sont également nécessaires à la différenciation des progéniteurs plaquettaires mais agissent plutôt en
122#6$/.&2!"/4 1"'3&!. $' (d&! "i"2("'/"lTe (Michelson, 2013)(Chapter 2).

U " #$21 --(-" 5 " '&96$/.&2!" 5 -" #'/E( .. -" !3 -." #/-" !12$ " 12%#'C. % !." 6'(1&56" %/&-" '/" .,62$& " '/" #'(-"
12%%(!6% !."/5%&- "#/-- "#/$"'36%&--&2!"dans les sinusoïdes médullaires de fragments cytoplasmiques, les
proplaquettes (> 100µm), q(&"-2(-"'3 ?? ."5("?'(N"-/!7(&! se séparent du corps des mégacaryocytes pour former
des pré-plaquettes (Italiano et al., 1999, Thon and Italiano, 2010). Ces pré-plaquettes constituées de boutons
plaquettaires reliés par de fins ponts cytoplasmiques se fragmentent par la suite dans la circulation afin de
former les plaquettes définitives (Machlus and Italiano, 2013) (Figure 1).

14
Figure 1 : Différenciation mégacaryocytaire et production des plaquettes sanguines dans la moelle osseuse
Les précurseurs mégacaryocytaires se différencient à partir des cellules souches hématopoïétiques (CSH)
présents dans la moelle osseuse. 9-0&0):200+*/&,-)02+)40&!>!-+0&'(endomitose pour aboutir à la formation de
cellules polyploïdes. Le cytoplasme subit également une maturation. Les mégacaryocytes matures
proplaquettogènes émettent alors des protrusions dans les sinusoïdes médullaires (les proplaquettes) et
libèrent des pré-plaquettes dans la circulation. Ces dernières se fragmentent pour former les plaquettes
sanguines.

1.2.2 Structure des plaquettes sanguines

1.2.2.1 Présentation générale

Les plaquettes sanguines mesurent 2 à 3 µm de diamètre pour un volume moyen compris entre 8 et 11 fL.
+2%% "' -"/(.$ -"1 ''(' -"5 "'32$7/!&-% G"' ($ membrane plasmique est composée de 1,2' -.6$2'" ."53(! "
9&12(1, "#,2-#,2'&#&5&E( "/-[%6.$&E( *"8!"'3/9- !1 "53/1.&4/.&2!G"' -"#,2-#,2'&#&5es neutres sont localisés
sur le feuillet externe alors que les phospholipides anioniques sont majoritaires sur le feuillet interne (Colman,
2006) (Chapter 22). =("12($-"5 "'3/1.&4/.&2!"#'/E( ../&$ G"'3 N#2-&.&2!"5 -"#,2-#,2'&#&5 -"/!&2!&E( s vers le
milieu extracellulaire est essentielle pour '3/1E(&-&.&2!"5("caractère pro coagulant des plaquettes activées.

La membrane plasmique est le support de très nombreux récepteurs plaquettaires impliqués dans les différentes
#,/- -"53/5,6-&2!G"53/1.&4/.&2!" ."53/7$67/.&2!"#'/E( ../&$ -*"S "#'(-G" '' " -3&!4/7&! "4 $-"'3&!.6$& ($"5 "'/"

15
cellule et donne naissance à un système de membrane particulièrement développé, le système canaliculaire
ouvert. Celui-ci a un double rôle :

- H'"# $% ."53/(7% !. $"'/"-($?/1 "5361,/!7 "/4 1"' "%&'& (" N.6$& ($" !"?/1&'&./!.">"'/"?2&-"'3 !521[.2- "
."'3 N21[.2- "5 -"2$7/! '' -"&!.$/1 ''('/&$ s (White and Escolar, 1991)
- Il sert de réserve de membranes et est &!5&-# !-/9' ">"'36%&--&2!"5 "?&'2#25 -" .">"'36./' % !."5 -"
#'/E( .. -"/("12($-"5 "' ($"'3/1.&4/.&2!"(Escolar et al., 1989)

U "1[.2-E( ' .. "#'/E( ../&$ " -."?2$%6"5 ".(9('&! G"53/1.&! G"5 "%[2-&! "HH=" ."12%#2$. "(!" !$2(' % !."5 "
8 à 12 microtubules formant un anneau en périphérie appelé la bande marginale. Cet enroulement confère à la
plaquette une forme discoïde stable (White, 1968, White and Rao, 1998).

Les plaquettes possèdent également de nombreuses organelles : du réticulum endoplasmique lisse (système
.(9('/&$ "5 !- YG"5 -"%&.21,2!5$& -G"5 -"7$/!(' -"^G"5 -"7$/!(' -"5 !- -"`2("7$/!(' -"\YG"5 -"'[-2-2% -" ."5 s
grains de glycogènes (Figure 2).

1.2.2.2 Les organelles plaquettaires

Les plaquettes sanguines disposent de nombreuses organelles intracellulaires impliquées dans les processus
%6./92'&E( -" ."5/!-"' -"#,6!2%C! -"5 "-61$6.&2!*"S -"%&.21,2!5$& -" ."5("7'[127C! "?2($!&-- !."'36! $7& "
nécessaire au métabolisme plaquettaire et e!"#/$.&1('& $"/("%61/!&-% "5 "-61$6.&2!*"U -"7$/!(' -"^G"\" ."' -"
lysosomes contiennent de nombreuses molécules (décrites ci-dessous) qui sont sécrétées dans le milieu
N.6$& ($"'2$-"5 "'3/1.&4/.&2!"(Gresele, 2002), Chapter 7).

1.2.2.3 /$%*0#'.,)$%*1

Les gr/!(' -"^"-2!."5 -"2$7/! '' -"#'/E( ../&$ -"-#,6$&E( -"2("242m5 -"5 "@AA"à 500 nm de diamètre synthétisés
par le mégacaryocyte durant la maturation de son cytoplasme. Une plaquette contient entre 50 et 80 granules
^" ."1 (N-ci sont identifiables en microscopie électronique à transmission (MET) grâce au contraste hétérogène
E(3&'-" #$6- !. !. (Michelson, 2013) (chapter 7). Ce sont par ailleurs les seules structures plaquettaires
observables en microscopie optique après coloration au May-Grunwald-0& %-/*"U/"% %9$/! "5 -"7$/!(' -"^"
portent de nombreuses glycoprotéines sur sa face interne qui sont exposées sur la membrane plasmique après
activation et dégranulation des plaquettes :

- la P-selectine (CD62) spécifique des granules ^ (Harrison and Cramer, 1993).

- S3/(.$ -" 7'[12#$2.6&! -" #'/E( ../&$ - 67/' % !." #$6- !. -" >" '/" % %9$/! " #'/-%&E( " >" '36./." 9/-/'P"
GPIIb-IIIa, GP IV (CD36), CD9, PECAM1 (Cramer et al., 1994) .">"'36./."5 ".$/1 - : le complexe
GPIb-V-IX (Berger et al., 1996).

16
Figure 2 : !"#$%&'()*+&plaquette sanguine
7&1%)!"+Y&0!"#$%&'()*+&,-%.)+//+&+*&!6),+&/4%*05+40%-+&L%'%,/#&'+&CZ&C6*+)&+/&[-P. Cazenave, Introduction
M& -(#/)'+& '+&-("#$60/%0+&+/& '+& -%&/"46$:60+& \& '+)X2I$+& #'2/26*& LQ]]^NY& P21)4+&9-4) (Boneu and Cazenave,
1997)Y& 7& '462/+Y& !6),+& P46*/%-+& '()*+& ,-%quette en microscopie électronique à transmission (Anita Eckly,
UMR_S949, EFS Alsace).

U -" 7$/!(' -" ^" 12!.& !! !." 5 " .$C-" !2%9$ (- -" %2'61(' -" E(&" # (4 !." Z.$ " &!12$#2$6 -" -2&." # !5/!." ' ($"
synthèse au cours de la maturation mégacaryocytaire, soit plus tardivement dans la plaquette mature. Ainsi, le
dosage des molécules l -"#'(-"/92!5/!. -"12%% "'/"h-thromboglobuline `h-TG) et le facteur 4 plaquettaire
(PF4) (Kaplan and Owen, 1981) (Ohkawa et al., 2005) dans le surnageant des suspensions plaquettaires au
12($-"5 -". -.-"53/grégation -2!."5 4 !(-"5 ".$C-"92!-"%/$E( ($-"5 "'3/1.&4/.&2!"des plaquettes. De manière
#'(-" N,/(-.&4 G" ' -" 7$/!(' -" ^" 12!.& !! !." 5 -" ?/1. ($-" 5 " '/" 12/7('/.&2!G" 5 -" facteurs de croissance, des
inhibiteurs de protéases, des protéoglycanes et des immunoglobulines (Figure 3).

S($/!."'3/1.&4/.&2!"#'/E( ../&$ "' -"7$/!(' -"^"$ '/$7( !."' ($"12!. !("5/!-"' "%&'& (" N.$/1 ''('/&$ "/?&!" de
stabiliser et de faire croitre le thrombus. Les molécules sécrétées permettent le recrutement local de nouvelles
plaquettes (VWF, fibrinogène) (Blair and Flaumenhaft, 2009) et participent également >"'3/%#'&?&1/tion de la
12/7('/.&2!"5/!-"' "1n($"5(".,$2%9(-"en favorisant la génération de thrombine (McFadyen and Jackson, 2013).

1.2.2.4 Les granules denses

U -" 7$/!(' -" \" -2!. des organelles spécifiques des plaquettes qui appartiennent à la classe des organelles
dérivées des lysosomes. Ils mesurent environ 150 nm de diamètre et sont appelés granules denses en raison de

17
leur centre opaque aux électrons en microscopie électronique à transmission. On compte entre 3 et 8 granules
\ (Mumford et al., 2015) par plaquette qui contiennent uniquement de petites molécules : du calcium présent
en très forte concentration (environ 2 M) conférant aux granules denses leur opacité aux électrons, 90% de la
-6$2.2!&! " 1&$1('/!. " 5 " '32$7/!&-% " `bf" %)YG" 5 " 7$/!5 -" E(/!.&.6-" 5 " !(1'62.&5 - (ATP et ADP) aux
concentrations respectives de 0.6 et 0.4 M, des pyrophosphates et des polyphosphates (Smith and Morrissey,
2008).

Comme les granules ^G" '/" % %9$/! " 5 -" 7$/!(' -" 5 !- -" #2$. " 5 -" $61 #. ($-" qui peuvent également être
retrouvés sur les membranes des autres organelles plaquettaires (CD63 (Nishibori et al., 1993) , GPIIb-IIIa,
GPIb (Youssefian et al., 1997) et LAMP2 (Israels et al., 1996)). Des transporteurs permettant '3 !.$6 " 5 -"
petites molécules dans les granules denses sont également présents : les transporteurs vésiculaires de
monoamines (VMAT2) (Carneiro et al., 2008) (Jedlitschky et al., 2012), les transporteurs de nucléotides MRP4
(Jedlitschky et al., 2010) et VNUT (Hiasa et al., 2014).

U2$-"5 "'3/1.&4/.&2!"#'/E( ../&$ G"' -"7$/!(' -"5 !- -"?(-&2!! !."/4 1"'/"% %9$/! "#'/-%&E( "afin de déverser
leur contenu dans le milieu extérieur. U3=ST" et la sérotonine sécrétés agissent de manière autocrine et
paracrine pour 12!5(&$ ">"'3/7$67/.&2! des plaquettes. En particulier l3=ST"- "?&N "sur ses deux récepteurs
plaquettaires : P2Y1 et P2Y12 ." !.$/&! " 53(! " #/$."' " 1,/!7 % !." 5 " ?2$% " 5 -" #'/E( .. -" ." 53/(.$ " #/$."
'3/%#'&?&1/.&2! de '3/1.&4/.&2!"#'/E( ../&$ "&!5(&. "#/r les autres agonistes solubles (sérotonine, thromboxane
A2 et thrombine).

1.2.2.5 Lysosomes

On compte deux à trois lysosomes de 200 et 250 nm de diamètre par plaquette. Ces organelles contiennent
essentiellement des protéases et des hydrolases (Figure 3) dont le rôle principal est la dégradation et le
recyclage des récepteurs plaquettaires internalisés (Hoxie et al., 1993) (Michelson, 2013) (Chapter 7)

18
 Principales molécules stockées dans les oragnelles plaquettaires

Granules Granules ! Lysosomes

Proteoglycanes Sérotonine Protéases acides

!"#$%&'%&%()*+,- Calcium Cathepsines D, E
PF4 ATP Carboxypeptidase (A, B)
Glycoprotéines riches en histidines ADP Prolinecarboxypeptidase
Platelet basic protein Pyrophosphates Collagenase
NAP-2 Polyphosphates Phosphatase acide
CTAP-III arylsulfatase

Protéines adhésives Glycohydrolases

Fibronectine Heparinase
Vitronectine !"!#$%&'(!)(*$+,#-./#,%
vWF !)(*$*0+1./#,%23 !)#(#$&+,./#,%
Thrombospondine !)('$%0+45+,45#&#,%236-D-glucosidase
!D-glucosidase, 6!7!8*$+,./#,%
Facteur de la coagulation 6!7!#0#9.1+,./#,%23 !:!8*$+,./#,%
Fibrinogène 6!:!-#11+,./#,%
facteur V, VIII, XI, XIII
Protéine S

Facteur de croissance
PDGF
TGF
ECGF
EGF
VEGF
IGF
Interleukine

Inhibiteur de protéase
./!0&12$%3*%')*+,-
./!1,"+"$456+,-
PDCI
./!1,"+5*16&+,-
PAI-I
TFPI
C1-inhibiteur
PN-2/APP

Immunoglobuline
IgG, IgA, IGM
Albumine

Figure 3 Principaux constituants des organelles plaquettaires

J(%,4I0&3-%/+-+/0&2*&?"46$:6/ic and Non-thrombotic Disorders. (Gresele, 2002)

19
1.2.3 !"#$%&%'$()*&+,-(..+$/()+-)0%-/#)1()&2!34%#.+#()*/$4+$/(

La physiologie plaquettaire au cours de &2!34%#.+#() */$4+$/() 5+$.) $6.(/7(6$/) 1() 6%48/(-9) /30(*.(-/#)
4(48/+6+$/(#),-$)*+/.$0$*(6.)+-9)3.+*(#)12+1!3#$%6:)12+0.$7+.$%6)(.)12+'/3'+.$%6)1(#)*&+,-(..(#;)<(#)*/%.3$6(#)
riches en leucine (complexe GPIb-V-IX), des intégrines (=2>1, =IIb>3), des récepteurs couplés aux protéines
G (RCPG) et des protéines appartenant à la superfamille des immunoglobulines (GPVI) modulent les flux
calciques intra-cellulaires et l23.+.)12+0.$7+.$%6)1()6%48/(-#(#)*/%.3$6(#)?$6+#(#)*%-/)0%61-$/()@)&23.+&(4(6.)
des plaquettes et à leur agrégation. En parallèle, le contenu des granules plaquettaires est sécrété et amplifie
de manière autocrine et paracrine &2+0.$7+.$%6) 1(#) *&+,-(..(#;) A2(6#(48&() 1() 0(#) 430+6$#4(#) +8%-.$.) @) &+)
5%/4+.$%6)12-6).!/%48-#),-$)*(/4(.)&()0%48&(4(6.)1(#)8/B0!es vasculaires.

C6)&2+8#(60()1()8/B0!()7+#0-&+$/(:)&2(61%.!3&$-4)7+#0-&+$/()#"6.!3.$#()et libère des inhibiteurs plaquettaires

(Furchgott and Vanhoutte, 1989). A()4%6%9"1()12+D%.( (Moncada and Higgs, 1991) inhibe les plaquettes en
stimulant la production de GMP cyclique (Warner, 1996) et entraine également une vasodilatation locale en
agissant directement sur les cellules musculaires lisses de la paroi vasculaire. La PGI2 inhibe les plaquettes en
se liant à son récepteur : un RCPG couplé avec une protéine G=s qui augm(6.()&2EF 0)$6./+-cellulaire en
#.$4-&+6.) &2+136"&+.() 0"0&+#( (AC) (Armstrong, 1996). Cette inhibition permanente permet de garder les
plaquettes sous une forme discoïde et non activée.

1.2.3.1 !"#$%&'()*#+&*,-"./+00+&

En cas de traumatisme vasculaire, la matrice sous-endothéliale riche en collagène et en autres protéines

fibrillaires (fib/%6(0.$6(:) &+4$6$6(#:) (.) 7$./%6(0.$6(G) (#.) (9*%#3() +-) 5&-9) #+6'-$6) (.) (6./+$6() &2+1!3#$%6) 1(#)
plaquettes. Cette première étape est un phénomène rapide (3 à 5 min) et débute par une vasoconstriction reflexe
qui perturbe le flux sanguin pour le rendre turbulent. Les plaquettes sont ainsi projetées contre la matrice sous-
endothéliale. Dans les artères en particulier où les forces de cisaillement sont élevées, les plaquettes ne peuvent
pas adhérer directement à la matrice sous-endothéliale. Une macromolécule, le facteur Willebrand (VWF)
(Figure 4), joue alors un rôle essentiel en se fixant sur le collagène et en induisant le recrutement des plaquettes.
Le VWF est un multimère de très haut poids moléculaire (500 à 20 000 kDa) constitué 12!%4%1$4B/(#. Chaque
monomère de 2050 acides aminés possède entre autre un site de liaison au collagène (domaine A3) et un site
de liaison pour la sous-unité GPIb= domaine A1) (Zhou et al., 2012) du complexe protéique GPIb-V-
IX présenté dans le paragraphe suivant. Le VWF est présent dans le plasma à la concentration de 5 à 10 mg/L
mais est stocké dans les corps de Weibel Palade des cellules endothéliales ainsi que dans les granules =)
plaquettaires (Nightingale and Cutler, 2013).

20
Figure 4: représentation des différents domaines du facteur Willebrand et de leurs rôles physiologiques
respectifs
D !"#$%&'#()*!+#t et al. (Bryckaert et al., 2015).

Le VWF circule dans le plasma sous une forme globulaire dans laquelle les sites de liaison à la GPIb= de
chaque monomère sont masqués. En cas de contact avec le sous-endothélium, le VWF adhère au collagène via
son domaine A3. La force du flux sanguin déplie alors le VWF et démasque les sites de liaison à la GPIb=
plaquettaire. Ce mécanisme permet ainsi &2+1!3#$%6)/37(/#$8&()1(#)*&+,-(..(#)et le rapprochement spatial de
celles-ci au niveau du tissu vasculaire lésé.

Le complexe GPIb-V-IX (Figure 5) indispensable à &2+1!3#$%6)1(#)*&+,-(..(# est composé de quatre sous-

unités transmembranaires H)&+)I J8=: &+)I J8>:)&+)I JK)(.)&+)I L),-$ appartiennent à la famille des protéines
riches en leucine (Kobe and Deisenhofer, 1994);)A+)I J8=),-$)#-**%/.()&2(##(6.$(&)1()&2+0.$7$.3)1()0()0%4*&exe
(#.)+##%0$3()1()5+M%6)0%7+&(6.()@)-6)%-)1(-9)4%6%4B/(#)1()I J8>)*%-/)5%/4(/)&+)'&"0%*/%.3$6()J8)NI J8G
(Lanza et al., 2008). La GPIb est associée de manière non covalente avec les deux dernières glycoprotéines :
la GPIX qui est indispensable @) &2(9*/(##$%6) 4(48/+6+$/() 1-) 0%4*&(9() (.) la GPV (Figure 5). Sa partie
extracellulaire possède des sites de liaison avec de nombreux ligands (VWF, thrombospondine, thrombine,
facteurs de la coagulation XI et XII, kininogène de haut poids moléculaire, P-selectine et intégrine leucocytaire
=F>OG tandis que sa partie intr+0(&&-&+$/() *(/4(.) &2+60/+'() 1-) 0%4*&(9() +-) 0".%#,-(&(..() 12+0.$6() *+/)
&2$6.(/431$+$/()1()&+)5$&+4$6()(Dyson et al., 2003). La partie intra-cellulaire permet également la transduction
du signal en aval du récepteur.

21
Figure 5 : Structure générale du complexe GPIb-V-IX et principales voies de signalisation en aval du complexe
D !"#$%&Lanza et al. (Lanza et al., 2008)

A2$6.(/+0.$%6)VWF/GPIb entraine une activation la phospholipase C PO)N AQPOG)(. la mobilisation des stocks
de calcium intra-cellulaire qui induit une modification du cytosq-(&(..()12+0.$6( (Faix and Rottner, 2006). Les
*&+,-(..(#) 1(7$(66(6.) 12+8%/1) #*!3/$,-(#) *-$#) 34(..(6.) 1() 6%48/(-9) 5$&%*%1(#) (Mangin et al., 2003). En
parallèle, la liaison GPIb/VWF active la phosphoinositide-3-kinase (PI3K) qui interagit directement avec la
protéine 14.3.3 intimement liée au domaine intra-0(&&-&+$/()1()&+)I J8=;)A2+0.$7+.$%6)1()&+) JRS)*/%7%,-()-6()
entrée supplémentaire de calcium à partir du milieu extracellulaire qui soutient les modifications du
0".%#,-(&(..()13T@)(6'+'3(#)(.)*+/.$0$*()@)&2+0.$7+.$%6)1()&+)I JJ8-IIIa (Nesbitt et al., 2002). Cette première
3.+*() 12+1!3#$%n dite instable favorise alors le contact entre les autres récepteurs plaquettaires et les
composants de la matrice sous-endothéliale pour conduire à une adhésion stable des plaquettes et à une
activation de celles-0$;)C6)*+/.$0-&$(/:)&2+1!3#$%6)13*(61+6.( du complexe GPIb-V-IX induit la dimérisation
de la glycoprotéine VI (GPVI) qui peut ainsi fixer le collagène matriciel et activer les plaquettes (Jiang and
Jandrot-Perrus, 2014).

La GPVI qui appartient à la superfamille des immunoglobulines est le principal récepteur 12+0.$7+.$%6 au
collagène (Nieswandt and Watson, 2003). La GPVI est étroitement associée à la chaine P)1(# récepteurs au
fragment Fc des i44-6%'&%8-&$6(#)NU0VPG *+/)&2$6.(/431$+$/()1()#%6)1%4+$6()./+6#4(48/+6+$/(. La liaison

22
+-)0%&&+'B6()(6./+$6()-6()1$43/$#+.$%6)1(#)0%4*&(9(#)I LJWU0VP)(.)-6)134+#,-+'()1(#)1%4+$6(#)JXEF)1(#)
U0VP;)A2+-.%)*!%#*!%/"&+.$%6)1(#)1%4+$6(#)JXEF)*+/)&(#)*/%.3$6(#)?$nase Fyn et Lyn associées au domaine
intra-cellulaire de la GPVI permet le recrutement de la protéine kinase Syk et des protéines adaptatrices LAT
(.) YA Z[;) A2+0.$7+.$%6 de la phospholipase C PO (PLCP2) et de la PI3K qui en découle entraine alors la
mobilisation du calcium intracellulaire, la dégranulation des plaquettes (.)&2+0.$7+.$%6)1(#)$6.3'/$6(# (Zahid et
al., 2012) (Figure 6). Tout récemment, Mammadova et al. (Mammadova-Bach et al., 2015) ont par ailleurs mis
(6)37$1(60()&()/\&()1()&+)I LJ)1+6#)&+)0/%$##+60()1-).!/%48-#)(.)&2+4*&$5$0+.$%6)&%0+&()1()&+)0%+'-&+.$%6;)C6)
effet, en se liant à la fibrine polymérisée, la GPVI permet le recrutement des plaquettes au niveau du thrombus
en formation. De plus:) &2$6.(/+0.$%6) (6./() &+) I LJ) (.) &+) 5$8/$6() +4*&$5$() &+) '363/+.$%6) 1() .!/%48$6() (6)
*/%4%-7+6.)&2(9*%#$.$%6)1()*!%#*!%&$*$1(#)+6$%6$,-(#)@)&2(9.3/$(-/)1()&+)0(&&-&(;)

<2+-./(#) $6.(/+0.$%6#) /30(*.(-/#W&$'+61#) #.+8$&$#(6.) (60%/() &2+1!3#$%6) *&+,-(.taire : le collagène se lie à

&2$6.3'/$6() =O>]:) &+) 5$8/%6(0.$6() $6.(/+'$.) +7(0) &2$6.3'/$6() =^>]:) &(#) &+4$6$6(#) +7(0) &2$6.3'/$6() =[>]:) (.)
&2$6.3'/$6()=JJ8>R)&$()&()5$8/$6%'B6()+1#%/83)1+6#)&+)4+./$0(;)A%/#)1-)*/%0(##-#)12+1!3#$%6:)&2(6#(48&()1()0(#)
interact$%6#)0%61-$.)@)&2+0.$7+.$%6)proprement dite des plaquettes.

Figure 6 : Structure générale de la GPVI et principales voies de signalisation associées

D !"#$%&,-../01&+.&!23 (Dutting et al., 2012).

23
1.2.3.2 L!"10'2"0'()*,-"./+00"'3+ (Figure 7)

A2+1!3#$%6)irréversible des plaquettes à la matrice sous-endothéliale $6$.$()&2+0.$7+.$%6) *&+,-(..+$/() '/_0()@

&2+0.$7+.$%6)1()7%$(#)1()#$'6+&$#+.$%6)(6)+7+&)1-)0%4*&(9()I J8-V-IX et de la GPVI. Cette activation est par
la suite renforcée par la synthèse et la sécrétion de médiateurs solubles qui agissent essentiellement par
&2$6.(/431$+$/( de RCPG présents sur la membrane des plaquettes.

Les RCPG sont des récepteurs composés de sept domaines transmembranaires couplés à des protéines G
hétéro-trimériques composées de deux sous-unités : = (.)>WP. La sous--6$.3)=)*%/.()-6()+0.$7$.3)IX +#$,-()(.)
4%1-&()&2+0.$%6)1(#)(55(0.(-/#)(6D"4+.$,-(#)#$.-3#)(6)+7+&;)A+)#%-#--6$.3)>WP)#()1$##%0$()1()&+)#%-#--6$.3)=)
-6$,-(4(6.) +*/B#) &230!+6'() I< WIX ) (.) +0.$7() &+) PLC, la PI3K ou certains récepteurs canaux. Dans les
plaquettes sanguines, au moins quatre grands types de récepteurs couplés aux protéines G ont été décrits :

- A(#)/30(*.(-/#)0%-*&3#)+-9)*/%.3$6(#)I=q ,-$)+0.$7(6.)&+) AQ>)*-$#)&+)*/%.3$6()?$6+#()Q (PKC) pour

aboutir à la mobilisation du calcium intracell-&+$/(;)Q2(#.)&()0+#)notamment pour les récepteurs à la
thrombine : PAR1 et PAR4 (protease activated receptor 1 et 4), le /30(*.(-/)@)&2E< : P2Y1, et le
récepteur au thromboxane A2 : TBXA2R.
- A(#)/30(*.(-/#)0%-*&3#)+-9)*/%.3$6(#)I=12/13 qui permettent la phosphorylation de la myosine comme
les récepteurs TBXA2R, PAR1 et PAR4.
- A(#)/30(*.(-/#)0%-*&3#)+-9)*/%.3$6(#)I#),-$)+0.$7(6.)&2EQ).(&),-()&()/30(*.(-/)@)&+) IJ2.
- A(#)/30(*.(-/#)0%-*&3#)+-9)*/%.3$6(#)I=i qui inhibent &2EQ et activent des sous-types de PI3K tels que
le /30(*.(-/)@)&2E< : P2Y12 (Versteeg et al., 2013).

Parmi les nombreuses molécules relarguées par les plaquettes +-) 0%-/#) 1() &2+0.$7+.$%6) *&+,-(..+$/(, les
431$+.(-/#)&(#)*&-#)$4*%/.+6.#)#%6.)&2E< :)&+)#3/%.%6$6()(.)&()0+&0$-4)0%6.(6-) dans les granules denses, le
thromboxane A2 (TXA2) nouvellement formé et la thrombine générée localement.

Les *&+,-(..(#)+0.$73(#)#"6.!3.$#(6.)1-)XKEO)@)*+/.$/)1()&2+0$1()+/+0!$1%6$,-()4(48/+6+$/(;)Q()*/%0(##-#)
*+##()*+/)&2+0.$%6)1()la phospholipase A2 puis de la cyclo-oxygénase de type 1 (COX-1) bien connue pour être
$6!$83() 1() 4+6$B/() $//37(/#$8&() *+/) &2+#*$/$6( (Landry et al., 2006). Le TXA2 très lipophile diffuse alors à
&2(9.3/$(-/)1()&+)0(&&-&(;)J&)(6./+$6( une vasoconstriction locale et agit sur son récepteur plaquettaire, un RCPG
couplé à des protéines G=q et G=12/13, (TBXA2R) (Giannarelli et al., 2010) (Feletou et al., 2010) afin de
mobiliser le calcium intra-cellulaire, activer la PKC, la PI3K et la GTPase RhoA. La stimulation de ces voies
de transduction renforce:) (6) 0%%*3/+.$%6) +7(0) &2+0.$%6) 1es autres agonistes solubles, la dégranulation des
plaquettes, un re4%1(&+'()1-)0".%#,-(&(..()(.)&2activation des intégrines.

A+).!/%48$6()'363/3()&%0+&(4(6.)+-)0%-/#)1()&2+0.$7+.$%6)1()&+)0%+'-&+.$%6)est également un puissant agoniste

plaquettaire. C&&() +'$.) *+/) &2$6.(/431$+$/() 1() #(#) /30(*.(-/#) *&aquettaires, les récepteurs PAR1 et PAR4
(Coughlin, 2005);)A()430+6$#4()12+0.$7+.$%6)1()0(#)/30(*.(-/#)(#.)+."*$,-(;)C6)(55(.:)&+).!/%48$6()-.$&$#()#%6)
activité enzymatique de type sérine protéase pour cliver la partie extracellulaire du récepteur. Il en résulte la

24
5%/4+.$%6) 12-6() 6%-7(&&() (9./34$.3) `-.(/4$6+&() 0+*+8&() 12+-.%-+0.$7(/) &() /30(*.(-/;) A2+0.$7+.$%6) 1(#)
récepteurs PAR entraine une activation plaqu(..+$/()#$4$&+$/()@)&2+0.$%6)1(#)/30(*.(-/#)XaKEOV)entrainant la
dégranulation des plaquettes, des modifications du cytosquelette et &2activation des intégrines.

A2E< )libéré au cours de la sécrétion des granules denses se fixe sur ses récepteurs : P2Y1 et P2Y12 (Gachet,
2001) (Gachet, 2008) (Gachet, 2006). Le récepteur P2Y1, couplé à une protéine G=q, qui se désensibilise
transitoirement après une activation (Baurand et al., 2000), induit une mobilisation modérée du calcium
intracellulaire et initie le changement de forme des plaquettes. A2+0.$%6)1()&2E< )#-/)&()/30(*.(-/) Ob12 qui
est lui couplé à une protéine G=i inhibitrice, entraine de son côté une &(73()1()&2$6!$8$.$%6)431$3()*+/)&+) IJ2
(6)8&%,-+6.)&+)#"6.!B#()12EF 0)13*(61+6.()1()&2EQ;)Q(..()&(73()12$6!$8$.$%6)(6./+$6()-6()amplification de
&2+0.$7+.$%6) *&+,-(..+$/() $6$.$3() 12-6() *+/.) *+/) &2+0.$7+.$%6 du récepteur P2Y1 mais aussi par les autres
médiateurs solubles tels que la sérotonine et le TXA2. A2+0.$%6)1()&2E< )#-/)&()/30(*.(-/) Ob12 stimule la
PI3K 0() ,-$) (6./+$6() &2+0.$7+.$%6) 1( &2$6.3'/$6() =JJ8>R;) A+) #3/%.%6$6() /(&+/'-3() 1() 4+6$B/() 0%60%4$.+6.(
permet une vasoconstriction locale et stimule aussi les plaquettes en se liant à son récepteur membranaire
couplé à une protéine Gq (Figure 7).

Figure 7 : 4#/0)/"!2+%&56/+%&7+&%/10!2/%!./60&!8&)68#%&7+&2 !)./5!./60&plaquettaire

9 !)./5!./60&7+%&"2!:8+..+%&%!018/0+%&"!%%+&"!#&2 !):8/%/./60&7+&"#6"#/;.;%&"#6)6!182!0.+%&<+="6%/./60&7+%&
">6">62/"/7+%& !0/60/:8+%& 5+#%& 2 +=.;#/+8#& 7+& 2!& )+2282+?3& 2!& %;)#;./60& 7+%& 1#!082+%& @& +.& A& :8/& 2/B$#+0.& 7+%&
agonistes solubles (ADP, sérotonine), et la génération de TXA2C&9 !)./5!./60&D;7/;+&"!#&2+%&!160/%.+%&%628B2+%&
tels que la sérotonine, la thrombine et le TXA2 +%.&"6.+0./!2/%;+&"!#&2 !)./60&7+&2 E,4&%8#&2+%&#;)+".+8#%&4FG12
et P2Y1C&H+&">;06D$0+&!B68./.&I&2 !1#;1!./60&7+%&"2!:8+..+%&7;"+07!0.+&7+&2 !)./5!./60&7+&2 /0.;1#/0+&@JJBKLC

25
Enfin, au cours de leur activation, les plaquettes exposent vers le milieu extracellulaire des phospholipides
anioniques normalement localisés sur le feuillet interne de la membrane plasmique (van Kruchten et al., 2013).
Q(..()(9*%#$.$%6)*+##()*+/)&2+0.$%6)12-6()#0/+48&+#()13*(61+6.()1-)0+&0$-4 : TMEM16F (Suzuki et al., 2010).
A2(9*%#$.$%6)1(#)*!%#*!%&$pides anioniques vers le milieu extracellulaire permet ainsi, en présence de calcium,
le recrutement des facteurs de la coagulation et la génération de thrombine.

1.2.3.3 3ème étape 4*-!"53%5"0'()*,-"./+00"'3+ irréversible (Figure 8)

A2!34%#.+#()*/$4+$/()0%6#$#.()(6)&+)5%/4+.$%6)12-6)0&%-)*&+,-(..+$/()#.+8$&$#3)+-)6$7(+-)1-).$##-)7+#0-&+$/()
&3#3;)A2+'/3'+.$%6)*&+,-(..+$/()(6)(#.)-6)3&34(6.)(##(6.$(&),-$)/(,-$(/.)&2+0.$7+.$%6)1()&2$6.3'/$6()=JJ8>R),-$)
doit changer de conformation afin de fixer le fibrinogène et former ainsi des ponts entre les plaquettes.

A2$6.3'/$6( =JJ8>R dont on compte 50 000 à 80 ccc)4%&30-&(#)*+/)*&+,-(..()0!(D)&2d%44()(#.)0%4*%#3()1()

deux sous-unités transmembranaires liées de manière non covalente (Nurden et al., 2011a). Son activation est
déclenchée par la signalisation en aval des récepteurs plaquettaires stimulés par les agonistes solubles (ADP,
thrombine, TXA2) ou $4*&$,-3#)1+6#)&+)*!+#()12+1!3#$%6)1(#)*&+,-(..(#)N&()0%4*&(9()I J8-V-IX et la GPVI).
On parle alors de signalisation « inside out e;)C&&()0%4*%/.()&()/(0/-.(4(6.)1() AQ)N AQ>)*%-/)&(#)/30(*.(-/#)
+-9) +'%6$#.(#) #%&-8&(#) (.) AQP) *%-/) &(#) /30(*.(-/#) $4*&$,-3# 1+6#) &2+1!3#$%6G) (Jackson et al., 2004) qui
hydrolysent le phosphatidyl-inositol 4,5 diphosphate (PIP2) en diacide glycérol (DAG) et inositol 1,4,5
1$*!%#*!+.()NJ RG;)A2J R)*(/4(.)+&%/#)&+)&$83/+.$%6)1(#)#.%0?#)1()0+&0$-4)$6./+-cellulaire qui participe avec le
<EI)+-)/(0/-.(4(6.)1()&+)*/%.3$6()1230!+6'()1-)I< )QEA<EI-GEFI nécessaire @)&2+0.$7+.$%6)12-6()*(.$.()
protéine G : Rap1 (Guidetti and Torti, 2012);)Q(..()*(.$.()*/%.3$6()I)*(/4(.)&2+##%0$+.$%6)1()&+).+&$6()(.)1()&+)
kindline-3 avec la queue intracellulaire de la sous--6$.3)>R)1()&2$6.3'/$6()(.)(6./+$6()#%6)+0.$7+.$%6)(Ma et al.,
2007, Shen et al., 2013). Cette signalisation dite « inside out » aboutit au changement de conformation de la
GPIIb-IIIa qui peut fixer de manière très affine le fibrinogène en présence de calcium. La fixation du
fibrinogène induit la création de ponts entre les plaquettes activées et autorise le recrutement de plaquettes
supplémentaires au sein du thrombus en format$%6;)A+)&$+$#%6)(6./()&(#)*&+,-(..(#)(.)&2+0.$7+.$%6)1()0(&&(#-ci
est encore renforcée grâce au regroupement spatial des récepteurs GPIIb-JJJ+) $61-$.) *+/) &2+0.$7+.$%6) 1()
&2$6.3'/$6()Nf clustering »). Ce regroupement entraine une activation massive de protéines kinases interagissant
avec le domaine intracellulaire de la sous--6$.3)>R)1()&+)I JJ8-IIIa telles que c-Src, Syk et Fyn (signalisation
« outside in »). Le recrutement de c-Src (Wu et al., 2015) permet la phosphorylation de Syk qui conduit à la
*!%#*!%/"&+.$%6) 1() &+) AQPO) N(Zhang et al., 2011) *-$#) @)&2+0.$7+.$%6) 1() V+*]8;) <() 0(..() 4+6$B/(:) V+*]8)
*(/4(.) &() 4+$6.$(6) 1() &2$6.3'/$6() 1+6#) #+) 5%/4() +0.$73(;) +/) +$&&(-/#:) &+) */%.3$6() ?$6+#() U"6) *(/4(.) &+)
phosphorylation de nombreuses protéines intra-cellulaires dont la myosine 2A ainsi que de plusieurs protéines
adaptatrices qui entrainent le recrutement de la PI3K (Gratacap et al., 2011)(Figure 8). La myosine 2A participe
+&%/#)+-)0!+6'(4(6.)1()5%/4()(.)@)&23.+&(4(6.)1(#)*&+,-(..(#).+61$#),-()&+) JRS)/(65%/0()&+)13'/+6-&+.$%6)1(#)
organelles plaquettaires qui majore de manière autocrine et *+/+0/$6()&2+0.$7+.$%6)1(#)*&+,-(..(#)*/3#(6.(#)+-)
sein du thrombus en formation.

26
Figure 8 : E)./5!./60&7+&2 /0.;1#/0+&@JJBK3
9 !)./5!./60& 7+%& "2!:8+..+%& %!018/0+%& 7;"+07!0.+& 7+%& #;)+".+8#%& 7 !7>;%/60& <M4NJ& +.& M4JB-V-IX) ou des
récepteurs aux agonistes solubles (thrombine, TXA2, ADP) conduit à une augmentation de calcium
/0.#!)+2282!/#+&+.&I&2 !)./5!./60&7+&2!&*/0!%+&O!"PB&:8/&"+#D+.&2+&#+)#8.+D+0.&7+&2!&*/072/0+-3 et de la taline
sur la sous-80/.;& KL& 7+& 2 /0.;1#/0+& @JJBKLC& Hette signalisation « inside out » induit le changement de
)60Q6#D!./60&7+&2 /0.;1#/0+&:8/&"+8.&2/+#&2+&Q/B#/061$0+C&9 !)./5!./60&7+&2 /0.;1#/0+&+0.#!/0+&80+&%/10!2/%!./60&
« outside in » qui permet le renforcement du recrutement de Rap1b et le regroupement spatial des intégrines
@JJBKL&!)./5;+%&)6078/%!0.&I&2 !1#;1!./60&/##;5+#%/B2+&7+%&"2!:8+..+%C

Comme nous venons de le voir, les plaquettes sanguines sont un élément central dans le processus d2arrêt du
saignement +-)0%-/#)1()&2!34%#.+#()*/$4+$/(;)Toutes les anomalies qualitatives ou quantitatives des plaquettes,
de leurs récepteurs plaquettaires ou des voies de signalisation associées peuvent potentiellement entrainer un
1"#5%60.$%66(4(6.)1()&2!34%#.+#()*/$4+$/()(.)0%61-$/()@)-6)#"61/%4()!34%//+'$,-(;)`%-s nous attacherons
dans la suite de ce document à présenter les différents outils actuellement utilisés au laboratoire pour le
diagnostic et la caractérisation des thrombopathies et nous proposerons ensuite une classification des
principales pathologies plaquettaires actuellement identifiées.

27
1.3 Diagnostic et classification des thrombopathies

1.3.1 Stratégie diagnostique des thrombopathies

Les syndromes hémorragiques liés à une anomalie plaquettaire congénitale peuvent avoir deux origines : la
*/3#(60()12-6)135$0$.),-+6.$.+.$5)*+/)$6#-55$#+60()1()*/%1-0.$%6)0(6./+&()(.W%-)&+)*/3#(60()12-6)135$0$.),-+&$.+.$5)
entrainant une limitation des plaquettes à adhérer au sous-(61%.!3&$-4:)@)#2+0.$7(/)%-)@)#2+'/3'(/)1()4+6$B/()
irréversible. De nombreuses analyses ont été développées au cours du temps afin de mettre en évidence ces
différentes anomalies. Nous présenterons dans cette partie les examens essentiels *%-/) &2$1(6.$5$0+.$%6) 1(#)
principales pathologies des plaquettes connues à ce jour.

1.3.1.1 Etude de la morphologie plaquettaire

1.3.1.1.1 Numération plaquettaire et microscopie optique

A2(9+4(6)8$%&%'$,-()1()*/(4$B/()$6.(6.$%6)*(/4(..+6.)1237%,-(/)-6()$6#-55$#+60()1()*/%1-0.$%6)1()*&+,-(..(#)
par la moelle osseuse est la réalisation 12une numération plaquettaire avec évaluation du volume plaquettaire
moyen (VPM). Une thrombocytopénie doit alors être recherchée (numération plaquettaire < 150 000 plt/µL)
(Rapport de &2E`ECY : &(0.-/()0/$.$,-()1()&2!34%'/+44( : valeurs seuils à reconnaitre comme probablement
pathologiques et principales variations non pathologiques, 1997) (Geneviève, 2014) associée ou non à une
macrocytose plaquettaire (VPM > 10.9 5AG;)A237+&-+.$%6)1()0(#)/3#-&.+.#)*(/4(.)13T@)12%/$(6.(/)&()1$agnostic
de thrombopathie congénitale vers certaines pathologies bien caractérisées. En effet, les travaux récents de
Noris et al (Noris et al., 2014a) réalisés sur une population de 376 patients atteints de thrombopathies bien
caractérisées montrent que la présence de plaquettes largement macrocytaires oriente le diagnostic vers un
groupe de pathologies limitées qui seront présentées dans le chapitre suivant : les syndromes MYH9, les
maladies de Bernard-Y%-&$(/)(.)1+6#)-6()4%$61/()4(#-/()&(#)+6%4+&$(#)1()&+).-8-&$6()>]:)&(#)#"61/%4(#)1(#)
*&+,-(..(#) '/$#(#:) &(#) +6%4+&$(#) 1() &2+&*!+-actinine et les anomalies de la filamine A. Sur la base de cette
observation, les autres thrombopathies actuellement connues ne semblent pas différenciables à la seule lecture
de ces paramètres de numération. Toutefois, un groupe de pathologies avec présence de plaquettes
microcytaires se démarque mais une zone de recouvrement du VPM avec les valeurs obtenues chez les témoins
$60&-#)1+6#)&23.-1()6()*(/4(.)*+#)12$#%&(/)1()4+6$B/()5$+8&()0(#)*+.!%&%'$(#)#-/)0()#(-&)*+/+4B./(;)C6)*+/+&&B&()
1() &+) 6-43/+.$%6) *&+,-(..+$/(:) &2%8#ervation du frottis sanguin coloré au May-Grunwald-Giemsa peut
également donner des informations capitales sur la pathologie H) &+) */3#(60() 12$60&-#$%6) 8+#%*!$&() 1+6#) &(#)
polynucléaires neutrophiles oriente vers un syndrome MYH9, la présence de plaquettes incolores ou très pâles
*(/4(.)1237%,-(/)-6)#"61/%4()1(#)*&+,-(..(#)'/$#(#:)&2%8#(/7+.$%6)1()'/+6-&(#)'3+6.#)1+6#)&(#)*%&"6-0&3+$/(#)
doit faire penser à une maladie de Chediakh-Higashi et la présence de granules géants dans les plaquettes
oriente le diagnostic vers une maladie de Paris-Trousseau.

28
Les nouveaux automates de numération proposent actuellement, en plus des paramètres classiques de la
numération plaquettaire, une évaluation quantitative des plaquettes immatures (IPF= immature platelet
fraction) dites plaquettes réticulées. Ces plaquettes réticulées correspondent aux plaquettes les plus jeunes qui
0%6.$(66(6.)(60%/()1()&2EV`)(.)1(#)/$8%#%4(#)(Ault and Knowles, 1995). Ce nouveau paramètre IPF est basé
sur la mise en évidence de ces plaquettes jeunes 0%6.(6+6.)1(#)/3#$1-#)12EV`)@ &2+$1()12-6)4+/,-+'()1(#)
+0$1(#)6-0&3$,-(#)N*+/)&+)*%&"4(.!$6()(.)&2%9+1$6()#-/)&(#)+-.%4+.(#)K`)1()Y"#4(9G (Briggs et al., 2012). Un
+&'%/$.!4()6%6)*-8&$3)*(/4(.)1237+&-(/)&+)5/+0.$%6)1(#)J U)*+/)&2+-.%4+.(;)Q(..()6%-7(&&().(0!6%&%'$()#(48&()
8$(6)+1+*.3()@)&237+&-+.$%6)1(#)0+*+0$.3#)1()production plaquettaire de la moelle osseuse au cours du suivi des
greffes de cellules souches hématopoïétiques (van der Linden et al., 2014) et des purpuras thrombotiques
idiopathiques (Adly et al., 2015). Cependant, bien que certaines études soient actuellement en cours, aucune
publication permettant de corréler la numération des IPF avec des sous-types de thrombopathies congénitales
62(#.)*+/-()@)0()T%-/. Par ailleurs:)&2+8#(60()1()0%4*/3!(6#$%6)1(#)+&'%/$.!4(#)*(/4(..+6.)&+)6-4ération des
IPF ne permet pas de considérer ce paramètre comme fiable et utilisable dans une réflexion scientifique. Du
reste, l2-.$&$#+.$%6)1(#)*+/+4B./(#)1()&+)6-43/+.$%6)*&+,-(..+$/()6()*(/4(.)*+#)1+6#)-6()$44(6#()4+T%/$.3)1()
cas de statuer sur le potentiel hémorragique des thrombopathies congénitales. En effet, comme le montrent les
recommandations sur les modalités des transfusions plaquettaires *-8&$3(#)*+/)&2E5##+*# N+-T%-/12!-$)E`YFG
(6) OccR:) &() /$#,-() 12!34%//+'$() #*%6.+63() 0!(D) &(#) *+.$(6.#) .!/%48%*36$,-(#) 62(#.) /3(&) ,-2(6) 0+#) 1()
thrombopénie sévère inférieure à 10 000 plt/µL ce qui est rarement le cas lors des thrombopathies congénitales.
Une évaluation d()&2$6.3'/$.3)1(#)5%60.$%6#)*&+,-(..+$/(# est donc indispensable dans un contexte de suspicion
de pathologie plaquettaire.

1.3.1.1.2 Etudes plaquettaires en immunofluorescence

A2-.$&$#+.$%6)12+6.$0%/*#)#*30$5$,-(#)0%-*&3#)1$/(0.(4(6.)%-)$61$/(0.(4(6.)@)1(#)5&-%/%0!/%4(#)*(/4(.)&+)4$#()
en évidence de nombreux récepteurs ou molécules plaquettaires directement sur un frottis sanguin fixé. Cette
technique simple permet le dépistage des déficits en certains récepteurs (GPIIb-IIIa, GPIb-V-IX) et des
principales anomalies de l2-&./+#./-0.-/() *&+,-(..+$/() N'/+6-&(#) =, g, tubuline, myosine). Ces techniques
12$44-6%5&-orescence font en particulier partie des tests de dépistages des syndromes MYH9 (Figure 9). En
(55(.:)&2-.$&$#+.$%6)12-6)+6.$0%/*#)+6.$-4"%#$6()OE)*(/4(.)&+)4$#()(6)37$1(60()12+4+#)1()4"%#$6()1+6#)&(#)
*%&"6-0&3+$/(#)6(-./%*!$&(#)0!(D)&(#)*+.$(6.#)+..($6.#;)Q2(#.)+-##$)-6)%-.$&)$4*%/.+6.)*%-/)&23.-1()1(#)'/+6-&(#)
=) N4+/,-+'() LhU:) .!/%48%#*%61$6e et P-selectine), des granules g) N4+/,-+'() Q<[R) (.) AEF OG et des
macrothrombopénies (marquage MYH9, tubulines, et filamine) (Figure 9);) A+) 4$#() (6) 37$1(60() 12-6)
$44-6%4+/,-+'()+6%/4+&)*(/4(.)(6./()+-./()12%/$(6.(/)&(#).(#.#)#*30$+&$#3#),-$)0%61-$/%6.)+-)1iagnostic de
la thrombopathie.

29
Figure 9 : Immunofluorescence indirecte réalisée sur des frottis sanguins fixés
A : marquage anti-myosine 2A sur des plaquettes témoins. B : marquage anti-myosine 2A sur les plaquettes
7 80&"!./+0.&RGST&<D8.!./60&+=60&UV?C&W0&06.+&2!&"#;%+0)+&7+&D!)#6"2!:8+..+%&+.&7 !D!%&7+&D(6%/0+&7!0%&
un polynucléaire. C : marquage anti-D(6%/0+&FE&%8#&2+%&"2!:8+..+%&7 80&"!./+0.&RGST&<mutation exon 38).
W0&06.+&2!&"#;%+0)+&7 80&1#6%&!D!%&7+&D(6%/0+&+0&Q6#D+&7+&Banane. D : marquage anti-P-selectine sur des
"2!:8+..+%& .;D6/0C& W0& 06.+& 80& D!#:8!1+& "80)./Q6#D+& )6##+%"607!0.& !8=& 1#!082+%& @C& X : marquage anti-
.8B82/0+& %8#& 7+%& "2!:8+..+%& .;D6/0& !5+)& 2!& "#;%+0)+& 7 80& !00+!8& 7+& D/)#6.8B82+s caractéristique. F :
marquage de%&1#!082+%&7+0%+%&%8#&7+%&"2!:8+..+%&.;D6/0&I&2 !/7+&7 80&!0./)6#"%&!0./-CD63.

1.3.1.1.3 Ultrastructure plaquettaire et microscopie électronique

!" #$%&'(%)!*" +)" ',(*-+)" +-" ./$**0s sanguin en microscopie optique, l,$12)/34*0$!" +)2" &'45-)**)2" )!"
microscopie électronique permet de visualiser ',)!2)%1')"+)"',-'*/42*/-#*-/)"&'45-)**40/)6"7,-*0'024*0$!"+)"'4"
microscopie électronique à balayage (scanning electron microscopy 8 9 :;"&)/%)*"+,4##(+)/"<"'4"2-/.4#)"+)2"
&'45-)**)2")*")!"&4/*0#-'0)/"+,(*-+0)/"')-/"#=4!>)%)!*"+)".$/%)?"',(%0220$!"+)".0'$&$+)2")*"')-/"(*4')%)!*6"

74"%0#/$2#$&0)"(')#*/$!05-)"<"*/4!2%0220$!"@: A;"&)/%)*"+)"2$!"#B*("+,)..)#*-)/"+)2"$12)/34*0$!2")!"#$-&)"
et de %)**/)")!"(30+)!#)"')2"+(.0#0*2"5-4!*0*4*0.2")!">/4!-')2"C"$-"+)!2)2 ainsi que les anomalies des principales
structures internes des plaquettes6"D)**)"*)#=!05-)")2*"+,40'')-/2"-!"+)2"*)2*2"+)"/(.(/)!#)"&$-/"')"+04>!$2*0#"+-"
syndrome des plaquettes grises (Islam and Alamelu, 2011) (Figure 10). 7,(*-+)"+)"',-'*/42*/-#*-/)"&'45-)**40/)
en MET peut être complétée par de2"0%%-!$%4/5-4>)2"-*0'024!*"+)2"10'')2"+,$/6"D)**)"*)#=!05-)"#$%&')E)"
réservée aux laboratoires spécialisés permet de visualiser directement dans les plaquettes la localisation de
',4!*0>F!)"#01')"+)"',4!*0#$/&2"-*0'02(6"

30
Enfin, ',utilisation de microscope (')#*/$!05-)" <" +$-1')" .402#)4-E" @+-4'" G)4%;" &)/%)*" +,)..)#*-)/" '4"
reconstruction de plaquettes et de mégacaryocytes en trois dimensions. Ces microscopes associent un faisceau
focalisé +,0$!2" /(4'024!*" +)2" #$-&)2" -'*/4.0!)2" )*" '4" *)#=!$'$>0)" +)2" %0#/$2#$&)s électroniques à balayage
permettant une acquisition numérique de chaque coupe réalisée. Le traitement des données obtenues permet la
visualisation des éléments observés en trois dimensions.

Figure 10 : Plaquettes sanguines en microscopie électronique à transmission

A gauche, plaquettes témoins en coupe transversale où !"#$%&'($")*&+,&+$ -$%+.*&#/&$0&$#"1)+&'2$3+-#' &*$
45$ 0&$ 6'& 6'&*$ 3+-#' &*$7$&($ 0'$*8*(91&$/-#- :/' -:+&$ "',&+(. A droite ;$ % -6'&((&*$ 0!'#$ %-(:&#($-((&:#($ 0'$
syndrome des plaquettes grises où !"#$ #"(&$ '#&$ -)*&#/&$ 0&$ 3+-#' &*$ 4$ 0-#*$ 0&$ #"1)+&'*&*$ % -6'&((&*$
(Images, Anita Eckly, UMR S949).

1.3.1.2 !"#"$%!$%&'("#)*!$%!"$)+,-).(!"$%!$./0&-,"#)"!$'1(-)(1!

1.3.1.2.1 Temps de saignement

!" &4/4''F')" +)" ',)E4%)!" #'0!05-)?" +)" ',0!*)//$>4*$0/)" +)2" &4*0)!*2" )*" 2-/*$-*" +)" ',(*41'022)%)!*" +-" 2#$/)"
hémorragique selon les recommandations des sociétés savantes (ISTH, International Society of Thrombosis
and Haemostasis) $-"+)"',H/>4!024*0$!":$!+04')"+)"'4"94!*("@H:9;, le temps de saignement est le seul test
clinique réalisé in vivo +02&$!01')"&$-/"')"+(&02*4>)"+)2"*=/$%1$&4*=0)26"D)"*)2*"(34'-)"')"*)%&2"+,4//I*"+-"
saignement après une incision calibrée <"',$/)0'')"@(&/)-3)"+)"J-K);?"2-/"',434!*-bras et sous pression contrôlée
de 40 mm Hg (méthode Ivy-incision) ou triple ponction simultanée (Ivy-trois points) de la peau. Le temps
+,4//I*"+-"240>!)%)!*")2*"%)2-/(")*"#$//)2&$!+"<"'4"#0!(*05-)"+)".$/%4*0$!"+-"#'$-"&'45-)**40/)"4-"#$-/2"+)"

31
',=(%$2*42)" &/0%40/)6" Selon la technique utilisée, les valeurs normales varient entre 2 et 4 minutes pour
',(&/)-3)"+)"J-K)?")!*/)"L")*"M"%0!-*)2"&$-/"'4"*)#=!05-)"+,N3O-trois points et entre 4 et 8 minutes pour la
*)#=!05-)"+,N3O-incision. Cependant, ce test invasif est peu sensible (en particulier en cas de thrombopathie
modérée ou de maladie de Willebrand), peu spécifique et +(&)!+"1)4-#$-&"+)"',$&(/4*)-/6 En conséquence,
depuis 2010 la Haute Autorité de Santé recommande de ne plus réaliser ce test pour le dépistage des
&4*=$'$>0)2"+)"',=(%$2*42)"&/0%40/)"@G0$'$>0) +)2"4!$%4'0)2"+)"',=(%$2*42)"LPQP;6

1.3.1.3 !-'"$%/,22.3"(,+$'.)43!##)(1!

Ce test de dépistage alternatif réalisé in vitro est disponible depuis 1995 (Kundu et al., 1995). Un petit
automate : le « platelet function analyser » (PFA-100 puis PFA-LPP;" &)/%)*" +,(34'-)/" ')2" #4&4#0*(2" +)2"
plaquettes à occlure un micro-capillaire de 150 R%" +)" +04%F*/)" /)#$-3)/*" +,-!)" %4*/0#)" de collagène en
&/(2)!#)" +,SJT" $-" +,4+/(!4'0!). Un allon>)%)!*" 20>!0.0#4*0." +-" *)%&2" +,$##'-20$!" &)/%)*" +,$/0)!*)/" ')"
+04>!$2*0#" 3)/2" -!)" 4!$%4'0)" +)" ',=(%$2*42)" &/0%40/)" )!" ',412)!#)" +)" &/02)" +,42&0/0!)6" D)&)!+4!*?" #)**)"
*)#=!05-)"4"+)"!$%1/)-2)2"'0%0*)2"<"&/)!+/)")!"#$%&*)"+4!2"',0!*)/&/(*4*0$!"+)2"/(2-'*4*2 :

- une sensibilité et une spécificité limitées (respectivement 80% et 60%, (Karger et al., 2007)) pour le
diagnostic des anomalies modérées +)"',=(%$2*42)"&/0%40/).
- -!" *)%&2" +,$##'-20$!" &4/"+(.0!0*0$!" 4llongé en cas de thrombopénie inférieure à 80 000 plt/µL ou
+,=(%4*$#/0*)"0!.(/0)-/)"<"UPV"(Harrison, 2005).
- une incapacité à discriminer entre les pathologies plaquettaires et les maladies de Willebrand.
- une insensibilité pour le dépistage des maladies du pool vide (Sladky et al., 2012).

Dans ce contexte, le PFA-100 reste un automate de dépistage intéressant à utiliser en routine. En effet, il
!,)2*"&42"0!3420."#$%%)"')2"%(*hodes de *)%&2"+)"240>!)%)!*"10)!"5-,0'"!) permette pas dans certains cas
+)"2*4*-)/"2-/"'4"&/(2)!#)"+,-!)"*=/$%1$&4*=0)"#=)W"-!"&4*0)!*6

1.3.1.4 Agrégation plaquettaire

74" *)#=!05-)" +)"/(.(/)!#)"&$-/" ',(*-+)"+)2".$!#*0$!2"&'45-)**40/)2" /)2*)" <" #)"X$-/" ',4>/(>4*0$n plaquettaire

réalisée in vitro par technique photométrique. La technique a relativement peu évolué depuis sa mise au point
en 1962. Le principe est resté le même : une suspension plaquettaire, un PRPc (plasma citraté riche en
plaquettes obtenu après centrifugation à 250 g pendant 15 minutes du sang total prélevé sur tube citrate 0.129
M) ou des plaquettes lavées (préparées selon Cazenave et al (Cazenave et al., 2004) (Cazenave et al., 1983)),
est %02)"2$-2"4>0*4*0$!"<"UY"ZD"&-02"')2"&'45-)**)2"2$!*"2*0%-'()2"&4/"-!"4>)!*"4>/(>4!*"2&(#0.05-)"+,-!)"3$0)"
+,4#*034*0$!" )!*/40!4!*" ')-/" 4>>'-*0!4*0$!" $-" ')-/" 4>/(>4*0$!6" J)2" #$-/1)2" /)&/(2)!*4*03)2" de la cinétique
+,4>/(>4*0$!"2$!*"4'$/2"$1*)!-)2")*"&)/%)**)!*"+,4&&/(#0er son caractère irréversible, sa vitesse, son amplitude
à un temps donné ainsi que la présence du changement de forme des plaquettes (Figure 11).

32
Figure 11 : <"'+)&$(8%:6'&$0!-3+.3-(:"#$0&*$% -6'&((&*$='1-:#&*$&#$>?>/$-%+9*$*(:1' -(:"#$%-+$ &$/" -39#&$
@$ +&%+.*&#(&$ &$ (&1%*$ 0&$ -(&#/&5$ A5$ -$ ,. "/:(.$ &($ B$ !-1% :('0&$ 0!-3+.3-(:"#$ -%+9*$ C$ 1:#'(&*D$ E#$ #"(&$
également une diminution de la transmission lumineuse pendant le temps de latence qui correspond au
/=-#3&1&#($0&$F"+1&$0&*$% -6'&((&*$6':$0&,:&##&#($*%=.+:6'&*$-,-#($0&$*!-3+.3&+.
(Cazenave et al., 1983)

T$-/"#=45-)"4>$!02*)?"-!"&/$.0'"+,4>/(>4*0$!"*O&05-)"+$0*"I*/)"$12)/3(")!"',412)!#)"+,4!$%4'0)"&'45-)**40/e.
7)2"&/0!#0&4')2"(3$'-*0$!2"*)#=!$'$>05-)2"+-"2O2*F%)"&$/*)!*")22)!*0)'')%)!*"2-/"')2"*)#=!05-)2"+,(34'-4*0$!"
de la turbidimétrie du milieu réactionnel où les systèmes électroniques sont devenus irremplaçables. Par
ailleurs, les principaux développements ont porté sur les méthodes de préparation des plaquettes ainsi que sur
la disponibilité de nouveaux agonistes extrêmement spécif05-)2" +)2" 3$0)2" +,4#*034*0$!. Ainsi dès 1972,
Mustard JF (Mustard et al., 1972) propose une technique de lavage des plaquettes qui permet une étude fine
+)"'4"3$0)"+,4#*034*0$!"+(&)!+4!*)"+)"',SJT")*"#)'4"&)!+4!*"-!)"+-/()"+)"M"<"[="5-4!+"')2"&'45-)**)2"2$!*"
conservées à 37°C. Selon ce protocole mis à jour par JP Cazenave en 1983 puis en 2004 (Cazenave et al.,
2004), les plaquettes sont suspendues dans un milieu tamponné iso-osmotique à pH 7.30 contenant du glucose,
+)"',4'1-%0!)?"+)2"0!=010*)-/2"+)"',4#*034*0on plaquettaire (PGI2 )*"4&O/42);")*"+-"#4'#0-%"@L"%:;6"7,4&O/42)"
)E*/40*)"+)"&$%%)2"+)"*)//)">)/%()2"+(>/4+)"')2"*/4#)2"+,SJT"/)'4/>-()2"4-"#$-/2"+-"'434>)"et responsables
+)"'4"+(2)!2010'024*0$!"+)2"&'45-)**)2"<"'4"2*0%-'4*0$!"&4/"',SJT"@(*4*"/(./4#*40/)) (Baurand et al., 2005).

\$-2" +02&$2$!2" +$/(!434!*" +,-!)" 14**)/0)" +,4>$!02*)2" +0*2" +)" &/)%0F/)" 0!*)!*0$!" 5-0" #$%&/)!+" ',SJT?" ')"
#$''4>F!)?" ',4#0de arachidonique et la ristocétine (Dawood et al., 2012) (Cattaneo et al., 2013) permettant
',$1*)!*0$!"+)"*/4#(2"+,4>/(>4*0$!"*O&05-)2 (Figure 12).

33
Les agrégations réalisées en PRPc correspondent à un système in vitro artéfactuel où la concentration en
#4'#0-%"@+)"',$/+/)"+-"R:;")2*"+0%0!-()"&4/"/4&&$/*"4-"%0'0)-"&=O20$'$>05-)6"74"2*0%-'4*0$!"+)2"&'45-)**)2"
&4/" ',SJT" @M µM) favorise alors la synthèse de TXA2 et la dégranulation conduisant à une agrégation
irréversible en double vague (Mustard et al., 1975). Le collagène (2.5 µg/mL) entraine une agrégation forte et
0//(3)/201')"+(&)!+4!*)"+)"'4"]T^N")*"+)"',0!*(>/0!)"C2_Q6"7,4#0+)"4/4#=0+$!05-)"@Q mM) permet également
une agrégation rapide et irréversible dépendante cette fois de la voie de synthèse du TXA2 et de son récepteur
&'45-)**40/)6" 7)2" 4>/(>4*0$!2" 0!+-0*)2" &4/" ',4#0+)" 4/4#=0+$!05-)" 2$!*" 0!=01()2" &4/" -!)" &/02)" +,42&0/0!)" 5-0"
bloque la COX-1 de manière irréversible Enfin, la ristocétine )!*/40!)?")!"&/(2)!#)"+, JAS?"-!)"4>>'-*ination
des plaquettes indépendante du calcium et de la GPIIb-IIIa et évalue la capacité de la GPIbC à lier le VWF.

En plaquettes lavées, la concentration en calcium de 2 mM (proche de la concentration physiologique) entraine

une agrégation réversible aprè2"2*0%-'4*0$!"&4/"',SJT")!"&/(2)!#)"+)".01/0!$>F!)"#4/")'')")%&I#=)"'4".$/%4*0$!"
de TXA2 )*"'4"+(>/4!-'4*0$!"+)2"&'45-)**)26"7)"#$''4>F!)")*"',4#0+)"4/4#=0+$!05-)")!*/40!)!*"-!)"4>/(>4*0$!"
complète et irréversible identique à celle observée en PRPc. Les agglutinations induites par la ristocétine ne
sont pas utilisables )!"&'45-)**)2"'43()2")!"/402$!"+)"',412)!#)"+)"^`a6"

En complément de ces agonistes de première intention, de nombreuses molécules ont été développées afin de
stimuler de manière exclusive certains récepteurs. Nous citerons deux exemples largement utilisés au
laboratoire :

- Le « collagen related peptide » (CRP) permettant une stimulation directe de la GPVI plaquettaire est
-!"$-*0'"0!+02&)!241')"+4!2"',(*-+)"+)2"+(.0#0*2")!"#)**)">'O#$&/$*(0!).
- Le peptide mimétique du TXA2 b" cdeeQf" 5-0" &)/%)*" +)" +02#/0%0!)/" ',412)!#)" +)" /(&$!2)" +)2"
&'45-)**)2"<"-!)"2*0%-'4*0$!"&4/"',4#0+)"4/4#=0+$!05-)"+-)"<"-!)"&/02)"+,42&0/0!)"$u à une anomalie du
récepteur TBXA2R.

G0)!" 5-,(*4!*" #$!20+(/(" #$%%)" ')" g Gold Standard h?" '4" *)#=!05-)" +,4>/(>$%(*/0)" 4" +)2" #$!*/40!*)2"
importantes qui limitent sa mise en place hors de laboratoires spécialisés :

- D,)2*"-!)"*)#=!05-)"%4!-)'')"!(#)220*4!*"-!)")E&)/*02)"0%&$/*4!*).
- Les échantillons sanguins doivent être traités dans les 4h suivant le prélèvement.
- La numération du PRPc doit être supérieure à 150 000 plt/µL pour pouvoir interpréter les tests
@+$!!()2"+)"34'0+4*0$!"+)"%(*=$+)"+-"'41$/4*$0/)"+,(*-+)"+)2".$!#*0$!2"&'45-)**40/)2"+)"', a9"S'24#);.
- Chaque agrégation nécessite un volume de 300 µL de PRPc ce qui limite la réalisation des tests en
particulier chez les nouveau-nés.
- Les patients doivent être à jeun.
- Peu de standardisation existe actuellement au niveau français ou international.
- Aucune évaluation externe de la qualité n,)2*"+02&$!01').

34
Figure 12 : <"'+)&*$#"+1- &*$0!-3+.3-(:"#*$% -6'&((-:+&*
<"'+)&*$ 0!-3+.3-(:"#*$ (8%:6'&*$ ")*&+,.&*$ &n PRPc et en plaquettes lavées après stimulation par divers
agonistes classiquement utilisés pour le dépistage des thrombopathies congénitales. (AA : acide
arachidonique).
D!après Cazenave et al (Cazenave et al., 1983).

7,)!2)%1')"+)"ces limitations explique la réticence de nombreux laboratoires non spécialisés à proposer cette
4!4'O2)"+)"&/)%0F/)"0!*)!*0$!"&$-/"',)E&'$/4*0$!"+)2"*=/$%1$&4*=0)2"#$!2*0*-*0$!!)'')26"T'-20)-/2"&-1'0#4*0$!2"
/(#)!*)2" &/(#$!02)!*" #)&)!+4!*" -!)" #$!+-0*)" <" *)!0/" &$-/" ',)E&'$/4*0$!" .$!#*0$!!elle des thrombopathies
(Cattaneo et al., 2013) (Cattaneo et al., 2009) (Centre de référence des pathologies plaquettaires, agrégation
plaquettaire, standardisation méthodologique, mai 2008). La prise en compte de ces recommandations par les
'41$/4*$0/)2" +)3/40*" &)/%)**/)" <" ',43)!0/" +)" +(3)'$&&)/" '4" /(4'024*0$n locale de ces tests 434!*" ',$/0)!*4*0$!"
éventuelle des patients vers les centres spécialisés.

1.3.1.5 Etude des plaquettes en cytométrie en flux

En complément des études effectuées en agrégométrie, le développement des anticorps monoclonaux et de la

cytométrie en flux permettent dorénavant de quantifier de manière simple et rapide les principales
glycoprotéines plaquettaires %402" (>4')%)!*" +,)..)#*-)/" #)/*40!2" *)2*2" .$!#*0$!!)'2" $-" -!)" (34'-4*0$!" +)"
',4#*03410'0*("+)"#)/*40!)2">'O#$&/$*(0!)2"&'45-)**40/)2.

35
Des k0*2" #$%%)/#04-E" 2$!*" +02&$!01')2" 4.0!" +,)..)#*-)/" '4 quantification des principales glycoprotéines
plaquettaires : la GPIIb-IIIa, le complexe GPIb-V-IX et la GPIa-IIa (Kit Platelet GP Screen Biocytex©). Ces
/(4#*0.2"#$%%)/#04-E"&)/%)**)!*"(>4')%)!*"+,(34'-)/"'4"34/04*0$!"+)"',)E&/)220$!"%)%1/4!40/)"(Schober et
al., 2003) des récepteurs tels que la GPIIb-IIIa ou le complexe GPIb-V-IX au cours du proces2-2"+,4#*034*0$!"
plaquettaire. Par ailleurs, des kits contenant des billes de calibration ont également été développés afin de
5-4!*0.0)/"*=($/05-)%)!*"!,0%&$/*)"5-)'"/(#)&*)-/"&'45-)**40/)"@i0*"T'4*)')*"D4'01/4*$/?"G0$#O*)Ej;6"D)"K0*")2*"
en particulier adaptable à quantification de la GPVI dont des anticorps commerciaux sont dorénavant
également disponibles (Clone 1G5, Diagnostica Stago©). La quantification de ces récepteurs est devenue un
outil indispensable au diagnostic rapide des maladies de Glanzmann, de Bernard-Soulier ou encore au
+(&02*4>)" +)2" +(.0#0*2" )!" ]T^N6" J)" &'-2?" ',-*0'02ation de ces techniques est bien plus souple que les tests
+,4>/(>4*0$!"&'45-)**40/). En effet, les tests sont réalisables 8h après le prélèvement, sont effectués sur sang
total citraté ou PRPc et ne nécessitent que quelques microlitres de sang.

Les techniques cytométriques 2$!*"(>4')%)!*"4+4&*()2"<"'4"/(4'024*0$!"+)"#)/*40!2"*)2*2".$!#*0$!!)'2"40!20"5-,<"

-!)"%)2-/)"+)"',4#*03410'0*("+)"#)/*40!)2">'O#$&/$*(0!)2"&'45-)**40/)26"7,-*0'024*0$!"+)"',4!*0#$/&2"TSD-1 dirigé
contre le site de liaison au f01/0!$>F!)"+)"',0!*(>/0!)"CIIb_3 activée permet une évaluation rapide des capacités
fonctionnelles de la glycoprotéine (Shattil et al., 1995). Les tests +,)E&$20*0$!" +)" '4" T-selectine après
stimulation des plaquettes (Johnston et al., 1987) (34'-)!*"'4"2(#/(*0$!"+)2">/4!-')2"C6"74"5-4!*0.0#4*0$! de
',)E&$20*0$!"du CD63 permet une première appréciation de la sécrétion des granules denses (Mirlashari et al.,
1996). De très nombreuses autres applications sont actuellement disponibles (étude de la liaison du
.01/0!$>F!)?"*)2*2"+,)E&$20*0$!"+)2"&=$2&=$'0&0+)2"4!0$!05-)2?"(*-+)"+)2"4>/(>4*2"')-#$-plaquettaires, etc) mais
celles-ci ne seront pas détaillées dans la suite de ce document (Michelson, 2013)(Chapter 29).

1.3.1.6 Etude de la sécrétion

Un complément aux explorations effectuées en agrégométrie et en #O*$%(*/0)")!".'-E"#$!202*)")!"',)E&'$/4*0$!"

des capacités de sécrétion des plaquettes. On peut ainsi distinguer deux grands types +,)E4%)!2 : le dosage
+0/)#*"+-"#$!*)!-">/4!-'40/)"$-"',(*-+)".$!#*0$!!)'')"+-"&/$#)ssus de sécrétion en lui-même.

7,)E&'$/4tion du contenu des granules C" passe par le dosage par technique 7N9S" +)" '4" _-TG (_-
thromboglobuline) et du PF-4 (Platelet Factor-4) dans les surnageants obtenus après stimulation des plaquettes
'$/2" +)2" *)2*2" +,4>/(>4*0$! (Takahashi et al., 1988). Cependant le diagnostic des anomalies des granules C"
comme le syndrome des plaquettes grises repose plutôt sur la mise en éviden#)"+)"',412)!#)"+)">/4!-')"C en
microscopie électronique ou en immunofluorescence. Le dosage des nucléotides plaquettaires (ATP et ADP)
/(4'02(")!"#=/$%4*$>/4&=0)"'05-0+)"=4-*)"&)/.$/%4!#)"@kT7D;")2*"/)'4*03)%)!*"&)-"/(&4!+-"10)!"5-,0'"2$0*"-!"
outil spécifique, rapide et reproductible pour la caractérisation des anomalies de ces organelles. 7,SJT"(*4!*"
majoritairement concentré dans les granules l, un rapport ATP/ADP supérieur à 4 (valeurs normales du
laboratoire : 1.1-L6L;"2)/4"4'$/2")!".43)-/"+,-!)"4!$%4'0)"+)2">/4!-')2"l. Le dosage des nucléotides associé au
dosage de la sérotonine plaquettaire par technique ELISA ou HPLC permet ainsi de poser le diagnostic de

36
maladie du pool vide liée à un déficit qualitatif ou quantitatif en granules denses plaquettaires (Mumford et al.,
2015).

Plutôt que de réaliser le dosage direct du contenu granulaire, la plupart des laboratoires préfère effectuer une
exploration des capacités sécrétoires des plaquettes. Le « test à la mépacrine » permet par exemple une
évaluation +)2"#4&4#0*(2"+,0!#$/&$/4*0$!")*"+)"2(#/(*0$!"+)2"&'45-)**)26 La mépacrine (Gawaz et al., 1993), un
%4/5-)-/" .'-$/)2#)!*" +(/03(" +)" ',4#/0+0!)" $/4!>)?" )2*" 0!#$/&$/()" +4!2" ')2 plaquettes grâce au même
transporteur que la sérotonine (SERT). La mépacrine captée par les granules denses est ensuite sécrétée grâce
à la stimulation des plaquettes par divers agonistes. La fluorescence plaquettaire peut ainsi être quantifiée par
cytométrie en flux avant et après stimulation. Cependant, bien que ce test puisse permettre une évaluation de
la sécrétion des granules denses, il possède au moins deux inconvénients majeurs : la fluorescence disparait
rapidement après le marquage des plaquettes et le marquage non spécifique est souvent important perturbant
40!20"',0!*)/&/(*4*0$!"+)2"/(2-'*4*26"

Le principe de la lumi-4>/(>$%(*/0)"/)&$2)"2-/"',(*-+)"20%-'*4!()"+)"',4>/(>4*0$!"&'45-)**40/)")*"+-"+$24>)"+)"
',SAT"/)'4/>-("+4!2"')"%0'0)-")E*/4#)''-'40/)"*$-*"4-"'$!>"+-"&/$#)22-2"+,4>/(>4*0$!"(Feinman et al., 1977)
(Cattaneo, 2009)6" 7,SAT" 2(#/(*(" )2*" #$!3)/*0" )!" adénylate de luciférine en présence de luciférine et de
%4>!(20-%6"7,adénylate +)"'-#0.(/0!)")2*")!2-0*)"*/4!2.$/%("&4/"',$EO>F!)")!"$EO'-#0.(/0!)")*"&/$+-0*"+)"'4"
lumière facilement quantifiable. Cette technique largement répandue permet la mise en évidence des anomalies
globales de la sécrétion sans différencier à elle-seule les déficits liés à une anomalie primaire de sécrétion des
déficits qualitatifs ou quantitatifs en granules l.

Enf0!?"',(*-+)"+)"',0!#$/&$/4*0$!")*"+)"2(#/(*0$!"+)"2(/$*$!0!)"/4+0$%4/5-()"(Holmsen et al., 1973) est encore

4#*-)'')%)!*" #$!20+(/()" #$%%)" '4" *)#=!05-)" +)" /(.(/)!#)" &$-/" ',(34'-4*0$!" +)2" #4&4#0*(2" +)" 2(#/(*0$!"
plaquettaire. De la sérotonine marquée au tritium ou au carbone 14 mise en présence de plaquettes est
rapidement incorporée dans les granules l. Les plaquettes sont stimulée2" <" ',40+)" +,4>$!02*)2 comme le
collagène ou la thrombine. La quantité de sérotonine libérée dans le milieu peut ensuite être quantifié)"<"',40+)"
+,-!" #$%&*)-/" 4+4&*(. Cette technique permet à la .$02" +,(34'-)/ les capacités des plaquettes à capter la
sérotonine ainsi que leur capacité de sécrétion (Mumford et al., 2015). Cette technique intéres24!*)"!,4-*$/02)"
pourtant pas à faire la +0..(/)!#)")!*/)"')2"l-SPD liés à un défaut de stockage de la sérotonine dans les granules
+)!2)2")*"')2"l-SPD liés à un déficit primaire de sécrétion.

1.3.1.7 Biologie moléculaire

La généralisation des techniques de biologie moléculaire permet dorénavant la recherche de mutations des
>F!)2"#$+4!*"&$-/"')2"&/$*(0!)2"+,0!*(/I*6" !")..)*?"'4"#$//('4*0$!")!*/)"-!)"%-*4*0$!">(nétique, une anomalie
protéique, et un phénotype précis offre désormais la possibilité de boucler la boucle de la compréhension de
la physiopathologie de certaines thrombopathies. Deux grandes stratégies sont actuellement appliquées dans
le génotypage des thrombopathies b" -!" 2(5-)!m4>)" #01'(" &4/" %(*=$+)" +)" 94!>)/" )!" #42" +,4!$%4'0)"

37
.$!#*0$!!)'')"*O&05-)"+,-!)"&4*=$'$>0) ou une stratégie plus généraliste utilisant les nouvelles techniques de
séquençage à haut débit dans les autres cas.

74"%02)")!"(30+)!#)"+,4nomalies fonctionnelles typiques <"',40+)"+)2"*)#=!05-)2"#0*()2"+4!2"')2"&4/4>/4&=)2"

précédents orientera le génotypage vers un ou des gènes bien connus pour être responsables du phénotype
&'45-)**40/)"$12)/3(6"D,)2*"!$*4%%)!*"')"#42 dans la maladie de Glanzmann où -!)"412)!#)"+,4>/(>4*0$! quel
5-)"2$0*"',0!+-#*)-/"@<"&4/*"'4"/02*$#(*0!);"doit faire suspecter cette thrombopathie et entrainer un séquençage
systématique des gènes ITGA2B et ITGB3.

Dans les cas plus complexes, notamment quand les anomalies fonctionnelles sont atypiques, une stratégie plus
généraliste doit être envisagée en utilisant les nouvelles techniques de séquençage à haut débit. Si plusieurs
patients apparentés &/(2)!*)!*"')"%I%)"&/$.0'"%$/&=$'$>05-)"$-".$!#*0$!!)'?"-!"2(5-)!m4>)"+,)E$%)"ou de
génome sera la méthode de choix pour la recherche de gènes candidats potentiellement impliqués dans la
pathologie. \$-2"43$!2"+,40'')-/2"$&*("&$-/"#)**)"%(*=$+)"+)"2(5-)!m4>)"&$-/"/)#=)/#=)/"')2">F!)2"0%&'05-(2"
dans la maladie du pool vide non syndromique mise en évidence dans une famille comportant trois membres
4**)0!*26"7)2"/(2-'*4*2"2)/$!*"&/(2)!*(2"+4!2"'4"*/$020F%)"&4/*0)"+)"#)"+$#-%)!*6"S"',0!3)/2)?"20"une anomalie est
%02)")!"(30+)!#)"#=)W"-!"&4*0)!*"02$'(?"')"2(5-)!m4>)"+,-!"&4!)'"+)">F!)s de susceptibilité sera plutôt envisagé.
Cette dernière stratégie est celle que nous avons choisie 43)#"!$2"#$''F>-)2"+)"', a9"G/)*4>!)")*"', a9"D)!*/)"
S*'4!*05-)"&$-/"#$!+-0/)"-!)"(*-+)"+,(&0+(%0$'$>0)"%$'(#-'40/)"2-/"'4"./(5-)!#)"+)2"%-*4*0$!2"+)"QY">F!)2"
d,0!*(/I*"+4!2"'4"&$&-'4*0$!"+)2"+$!!)-/2"+)"24!>"/(#-2(2"&$-/"*=/$%1$&(!0)"@ *-+)"SGD"4#*-)'')%)!*")!"
cours). D$%&*)"*)!-"+)"',0!3)2*022)%)!*".0!4!#0)/")*"+)"',)E&)/*02)"!(#)2240/)"<"',-*0'024*0$!"+)"#)2"!$-3)'')2"
technologies de séquençage à haut débit, des plateformes de séquençage se développent et centralisent ces
4!4'O2)26" D,)2*" ')" #42" !$*4%%)!*" )!" S!>')*)//)" 43)#" ')" &/$X)*" du consortium BRIDGE (projet BPD pour
bleeding platelet disease, (Cambridge-Biomedical-Research-Centre)) qui vise à identifier de nouveaux gènes
responsables de throm1$&4*=0)2"&4/"2(5-)!m4>)"+,)E$%)6" !"a/4!#)?"')2"#)!*/)2"2&(#04'02(2"+4!2"',(*-+)"+)2"
*=/$%1$&4*=0)2"2$!*"/)>/$-&(2"2$-2"',(>0+)"+-"D)!*/)"+)"n(.(/)!#)"+)2"T4*=$'$>0)2"T'45-)**40/)s (CRPP) qui
#)!*/4'02)"')2"(#=4!*0''$!2"+,SJ\"&/$3)!4!*"+)2"&4*0)!*2"4**)0!ts de thrombopathies afin de séquencer en masse
ces ADN à la recherche de mutations connues ou inconnues. Cette approche a un double objectif :

- Offrir la possibilité de rechercher les mutations génétiques chez tous les patients atteints de
thrombopathies congénitales.
- D$%&4/)/"')2">(!$*O&)2"+)"&4*0)!*2"&/(2)!*4!*"')2"%I%)2"4!$%4'0)2".$!#*0$!!)'')2"%402"+$!*"',$/0>0!)"
géographique est différente afin de mettre en évidence de nouveaux gènes responsables de
thrombopathies.

Nous disposons donc actuellement de très nombreux outils diagnostiques qui permettent la mise en évidence
+,4!$%4'0)2" .$!#*0$!!)'')2" &'45-)**40/)2" 2&(#0.05-)26" D)&)!+4!*?" '4" 2*4!+4/+024*0$!" +)2" %(*=$+)2"
+,)E&'$/4*0$!" +)2" *=/$%1$&4*=0)2" /)2*)" 4#*-)'')%)!*" '0%0*()" (Gresele et al., 2014). Des travaux récents
(Gresele and Subcommittee on Platelet, 2015) tentent de proposer une approche consensuelle pour

38
',)E&'$/4*0$!"+)2"&4*=$'$>0)2"&'45-)**40/)2"5-0"%(/0*)/40*"+,I*/)"%02)")!"4&&'0#4*0$!"+4!2"',)!2)%1')"+)2"#)!*/)"
spécialisés. Avec les *)#=!05-)2"4#*-)'')%)!*"+02&$!01')2"<"', a9"S'24#)?"!$-2")224O$!2"+)"!$-2"*)!0/"à ces
recommandations (Figure 13).

Figure 13 : G(+-(.3:&$0:-3#"*(:6'&$%+./"#:*.&$%-+$'#$3+"'%&$0&$(+-,-: $0'$/"1:(.$0&$*(-#0-+0:*-(:"#$0&$ !HGIB$

et -%% :/-) &$-'$ -)"+-(":+&$0&$ !JKG$L *-/&

39
1.3.2 Présentation des principales thrombopathies

Les thrombopathies congénitales correspondent donc à un groupe de pathologies hétérogènes associant un

syndrome hémorragique cutanéomuqueux de sévérité très variable à une ou des anomalie(s) fonctionnelle(s)
plaquettaire(s) et dans certains cas, à des anomalies morphologiques et/ou une thrombopénie. Toutes les
fonctions plaquettaires peuvent être touchées (adhésion, activation, agrégation, rôle pro-coagulant), les
anomalies morphologiques peuvent porter sur la taille des plaquettes, le cytosquelette ou les organelles intra-
cellulaires et la thrombopénie, quand elle est présente, peut être extrêmement sévère ou tout à fait modérée.
Notons que nous ne traiterons pas dans ce chapitre les thrombopénies constitutionnelles pour lesquelles des
anomalies fonctionnelles ou morphologiques des plaquettes ne sont pas retrouvées à savoir : les thrombopénies
+-)2"<"4!$%4'0)2"+)"',4!KO/0!)"JLe (OMIM : 188000) et les amégacaryocytoses congénitales associées aux
anomalies du récepteur MPL (OMIM : 604498).

Malgré les nombreux outils actuellement disponibles, plus de 50% des thrombopathies restent à ce jour non
étiquetées (Balduini et al., 2012, Quiroga et al., 2007, Gresele et al., 2014)(Figure 14)

Figure 14 : Fréquences observées des différentes thrombopathies et thrombopénies constitutionnelles

étiquetées et non étiquetées en 2012
(Balduini et al., 2012).

Avec les connaissances actuelles, plusieurs types de classification des thrombopathies peuvent être envisagés.
Il est ainsi possible de différencier ces pathologies suivant la fonction plaquettaire perturbée (adhésion,
activation, agrégation) (Nurden et al., 2012), suivant leur appartenance ou non à un syndrome (Balduini et al.,
2013) $-"10)!")!#$/)"2-034!*"')"%$+)"*/4!2%0220$!"@4-*$2$%05-)"+$%0!4!*?"4-*$2$%05-)"/(#)220."$-"'0("<"',o;6"

40
D)&)!+4!*?" 4-#-!)" +)2" #'4220.0#4*0$!2" &/$&$2()2" !,)2*" &4/.40*)%)!*" 4+4&*()" <" ',)!2)%1')" +)2" pathologies
identifiées à ce jour. Nous proposons dans ce document de présenter ces pathologies de manière alternative en
nous appuyant sur la fonction des protéines affectées étant entendu que des chevauchements existent pour
certaines entités. Nous détaillerons donc les thrombopathies liées à une anomalie des facteurs de transcription,
des récepteurs plaquettaires, des protéines de la structure plaquettaire et enfin des acteurs des voies de
signalisation intracellulaire. En nous appuyant sur une série de revues récentes et quelques publications
princeps, nous tenterons de brosser le tableau des principales thrombopathies pour lesquelles les mutations des
gènes ont été identifiées comme étant responsables de ces pathologies. Deux types de thrombopathies feront
',$1X)*"+,-!)"&/(2)!*4*0$!"2(&4/()")*"&'-2"+(*40''()"/)2&)#*03)%)!*"+4!2"'4"+)-E0F%)")*"*/$020F%)"&4/*0)"+)"#)"
document : les anomalies du récepteur P2Y12 et les maladies du pool vide.

1.3.2.1 Thrombopathies dues à des mutations des facteurs de transcription

Les facteurs de transcription (FT) sont des protéines intra-#)''-'40/)2"5-0"/(>-')!*"',)E&/)220$!"+)".4%0'')2"+)"

>F!)26"N'2"0!*)/30)!!)!*")!*/)"4-*/)"+4!2"',4#*034*0$!"$-"'4"/(&/)220$!"+)">F!)2"2&(#0.05-)2"+)"'0>!()2"4-"#$-/2"
de la différenciation des cellules souches en cellules spécialisées. Les FT se fixent sur des séquences
spécifiques localisées dans les promoteurs des gènes ou les régions cis-régulatrices associées. Ils modulent
',4##F2" +)2" #$%&')E)2" +)" */4!2#/0&*0$!" 4-E" &/$%$*)-/2" +)2" >F!)2" )!" 4>0224!t sur les modifications
(&0>(!(*05-)2"+)"',SJ\"@%(*=O'4*0$!"+)"',SJ\"$-"4#(*O'4*0$!"+)2"=02*$!)2;6"D$%%)"#)2"aA"2$!*"0%&'05-(2"
+4!2"'4"+0..(/)!#04*0$!"#)''-'40/)")*"2$!*"/4/)%)!*"2&(#0.05-)2"+,-!)"2)-')")*"%I%)"'0>!()?"')2"4!$%4'0)2"+)"#)2"
protéines connues pour être responsables de thrombopathies congénitales sont également susceptibles
+,4->%)!*)/"')"/025-)"+)"+(3)'$&&)/"+)2"=(%$&4*=0)2"%4'0>!)26"

Les thrombopathies liées à des anomalies des FT ne peuvent que difficilement être reliées à une anomalie
fonc*0$!!)'')"02$'()6" !")..)*?"#$%%)"')2"aA"/(>-')!*"',)E&/)220$!"+)"&4!)'2"+)">F!)2?"')2"4!$%4'0)2"&)-3)!*"
entrainer une insuffisance de production plaquettaire, une production de plaquettes morphologiquement
anormales et/ou des anomalies fonctionnelles. Dans ce contexte, nous avons choisi de traiter ces pathologies
de manière séparée.

1.3.2.1.1 Anomalies de RUNX1

Le gène RUNX1 localisé en 22q22.12 code pour la sous--!0*("C"+-"#$%&')E)"+)"*/4!2#/0&*0$!"=(*(/$+0%(/05-)"

DGa"@D$/)"10!+0!>".4#*$/;"0!+02&)!241')"<"',(*41'022)%)!*"+)"',=(%4*$&$pF2)"+(.0!0*03)6"(Osato, 2004). Cette
sous--!0*(" C" &$/*)" ')" 20*)" +)" '0402$!" <" ',SJ\" &4/" ',0!*)/%(+040/)" +,-! domaine de 128 acides aminés très
#$!2)/3("+4!2"',(3$'-*0$!"@+$%40!)"/-!*;"5-0"2)"'0)"4-E"2(5-)!#)2"5'-PYGPYGGT-3' de manière spécifique.
La sous--!0*("_"#$+()"&4/"')">F!)"DGaG"4->%)!*)"',4..0!0*("+)"'4"2$-2--!0*("C"&$-/"',SJ\6"D)">F!)"4"(*("
largement étu+0("+4!2"')"#4+/)"+)"',)E&'$/4*0$!"+)2"')-#(%0)2"40>-ës myéloblastiques (LAM) et fait partie des
critères majeurs de la dernière classification de ces pathologies (Classification des hémopathies malignes OMS
2008) en définissant les LAM dites « CBF ». Les anomalies congénitales de RUNX1 sont responsables de

41
thrombopathies avec prédisposition aux leucémies aiguës FDP/AML (OMIM b"ePQUff;6"7,0!4#*034*0$!"*$*4')"
+-">F!)"+4!2"-!"%$+F')"%-/0!")!*/40!)"+,40'')-/2"'4"%$/*"in utero par hémorragie intracrânienne (Wang et al.,
1996) 4'$/2" 5-)" ',0!4#*034*0$!" +4!2" ')2" 2$-/02" 4+-'*)2" &/$3$5-)" -!)" 0!hibition de la maturation des
mégacaryocytes (Ichikawa et al., 2004). Dans le cadre des thrombopathies congénitales, les mutations de
nc\oQ"*$-#=)!*")22)!*0)'')%)!*"')"+$%40!)"+)"'0402$!"<"',SJ\"/-!*")*")!*/40!)!*">(!(/4')%)!*"-!)"=4&'$-
insuffisance (Michaud et al., 2002). Il a été également suggéré que quelques mutations sont responsables de la
2O!*=F2)"+,-!)"&/$*(0!)"<")..)*"dominant négatif (Matheny et al., 2007). Par ailleurs, plus récemment, Bluteau
D et al (Antony-Debre et al., 2012) $!*"%$!*/("5-)"nc\oQ"/(>-'40*"',)E&/)220$!"+)2">F!)2"MYH9 (codant
pour la chaine lourde de la myosine 2A) et MYH10 (codant pour la chaine lourde la myosine 2B) au cours de
la mégacaryopoïèse. La thrombopénie observée serait ainsi liée à une absence de répression du gène MYH10
)*"<"+0%0!-*0$!"+)"',)E&/)220$!"+)"%O$20!)"LS"4-"#$-/2"+)2"2*4+)2"*4/+0.2"+)"+0..(/)!#04*0$!6"D)**)"+(/(>-'4*0$!"
entraine une diminution de la ploïdie et une altération de la formation des proplaquettes. Biologiquement, ces
mutations provoquent une thrombopénie sans macrocytose, associée à un déficit fonctionnel plaquettaire
apparenté aux pools vides. Celui-#0" 2)" #4/4#*(/02)" &4/" -!" +(.0#0*" +,4>/(>4*0$!" )!" &/(2)!#)" +)" .401')2"
#$!#)!*/4*0$!2"+)"#$''4>F!)"$-"+,4#0+)"4/4#=0+$!05-e. Cliniquement, les patients présentent généralement un
syndrome hémorragique modéré à transmission autosomique dominante associée à un risque accru de
développer des myélodysplasies ou leucémie aiguës (+ 40%) (Song et al., 1999).

1.3.2.1.2 Anomalies de GATA-1

Le gène GATA-1 localisé en Xp11.23 code pour la protéine GATA-1 faisant partie de la famille des FT GATA
5-0" 2)" .0E)!*" +)" %4!0F/)" 2&(#0.05-)" 2-/" '4" 2(5-)!#)" M,-GATA-U,6" D,)2*" -!" aA" 0!+02&)!241')" &$-/" '4"
différenciation et la maturation des lignées érythroïdes et mégacaryocytaires. GATA-1 possède deux domaines
)!" +$0>*" +)" q0!#" 5-0" &)/%)**)!*" +,-!)" &4/*" ',0!*)/4#*0$!" 43)#" ',SJ\" )*" +,4-*/)" &4/*" ',0!*)/4#*0$!" 43)#" 2$!"
cofacteur la protéine FOG1 (Friend of GATA). Deux types de thrombopathies congénitales affectant
également la lignée érythroïde ont été décrits. Les mutations V205M et D218G (Nichols et al., 2000) (Freson
et al., 2001) )!*/40!)!*"-!)"4!$%4'0)"+)"',0!*)/4#*0$!"+)"]SAS-1 avec son cofacteur FOG-1. Biologiquement,
la thrombopathie (OMIM : 300367) est caractérisée par une macrothrombopénie associée à une
dysérythropoièse avec ou sans anémie. Les anomalies fonctionnelles plaquettaires seraient caractérisées par
une anomalie de la GPVI associée à une diminution de réponse au collagène (Songdej and Rao, 2015). Une
autre mutation affectant uniquement la liaison de GATA-Q"43)#"',SJ\"@nLQer) a été rapportée pour être
/)2&$!241')"+,-!)"4-*/)"*=/$%1$&4*=0)"#$!>(!0*4')"'0()"<"',o"422$#0()"<"-!)"1(*4-thalassémie (XLTT, OMIM :
305371) (Tubman et al., 2007). Biologiquement, la pathologie est caractérisée par une anémie microcytaire,
une macrothrombopénie curieusement associée à la présence de plaquettes grises. Cliniquement, Phillips et al
(Phillips et al., 2007) rapportent en plus du syndrome hémorragique cutanéomuqueux '4" &/(2)!#)" +,-!)"
&=$*$2)!2010'0*(?" +,-!" =0/2-*02%)?" +,-!)" 2&'(!$%(>4'0)" 40!20" 5-)" +,43$/*)%)!*2" 2&$!*4!(26" !.0!" +,4-*/)2"
mutations de GATA-1 ont été rapportées pour être responsables du syndrome XLANP (X-linked anemia with
or without neutropenia and/or platelet abnormalities, OMIM : 300835), mais la thrombopathie liée à un déficit

42
5-4!*0*4*0.")!">/4!-')2"C")*"l"(Hollanda et al., 2006) est inconstante dans les rares cas décrits. Par ailleurs, le
diagnostic différent0)'" 43)#" ',4!(%0)" +)" Blackfan-Diamond est actuellement discuté (Sankaran et al.,
2012).

1.3.2.1.3 Anomalies de FLI1

FLI1 est un FT membre des ETS (E-twenty-six) qui contrôlent )!*/)"4-*/)"',)E&/)220$!"+)2">F!)2" ITGA2B
(codant pour la GPIIB), GPIBA @#$+4!*"&$-/"'4"]TN1C;? GP9 (codant pour la GPIX) et c-MPL (récepteur à la
thrombopoïétine) (Songdej and Rao, 2015). Ce FT est codé par le gène FLI1 localisé en11q23.3. Les délétions
partielles du bras long du chromosome 11 incluant le locus FLI1 sont responsables de deux thrombopathies à
transmission autosomique dominante : le syndrome de Jacobson (OMIM : 147791) et le syndrome de Paris-
Trousseau. Dans les deux cas, la th/$%1$&4*=0)"/(2-'*)"+,-!"+(.4-*"+)"%4*-/4*0$!"%(>4#4/O$#O*40/)"(Favier et
al., 2003) et est caractér02()"&4/"'4"&/(2)!#)"+)"&'45-)**)2">(4!*)2"&$/*4!*"&4/.$02"-!">/4!-')"C">(4!*"(Laleye
et al., 2002). Le syndrome de Jacobson se différencie du syndrome de Paris-A/$-22)4-"&4/"',4++0*0$!"+,-!"
retard mental, +,4!$%4'0)"#4/+045-)?"/(!4')? intestinale et génitale. La réflexion actuelle réside sur le fait que
#=)W"',k$%%)?"',=4&'$-insuffisance liée à la délétion du bras long du chromosome 11 suffit à entrainer la
pathologie alors que les modèles murins hétérozygotes FLI1 +/- ne présentent aucune pathologie (Hart et al.,
2000). Très récemment, une %-*4*0$!"=$%$WO>$*)"#6fYPDsA"4"(*("%02)")!"(30+)!#)"#=)W"+)-E")!.4!*2"+,-!)"
meme famille consanguine (Stevenson et al., 2015)6"D)**)"%-*4*0$!")!*/40!)"'4"2-12*0*-*0$!"+)"',4/>0!0!)"ULd"
'$#4'02()"+4!2"')"20*)"+)"'0402$!"+)"a'NQ"<"',SJ\")*")!*/40!)"-!)"*=/$%1$&4*=0)"similaire au syndrome de Paris-
Trousseau mais à transmssion autosomique récessive.

1.3.2.1.4 Anomalies de GFI1B

GFI1B est un FT codé par le gène GPI1B (localisé en 9q34.13) qui comporte six doigts de Zinc permettant sa
'0402$!"<"',SJ\")*"-!"+$%40!)"/(&/)22)-/"+)"*O&)"9\S]"(Moroy, 2005). Ce FT est exprimé essentiellement
dans les progéniteurs érythroïdes et mégacaryocytaires et agit comme répresseur transcriptionnel dans les
dernières étapes de la différenciation mégacaryocytaire (Foudi et al., 2014). Très récemment, deux mutations
localisées dans la séquence codant pour un doigt de Zinc ont été mises en évidence et seraient responsables de
'4">(!(/4*0$!"+,-!)"&/$*(0!)"*/$!5-()"<")..)*"+$%0!4!*"!(>4*0."(Stevenson et al., 2013) (Monteferrario et al.,
2014). Ces mutations entrainent une thrombopathie à transmission autosomique dominante (OMIM :187900)
5-0"2,4&&4/)!*)"4-"2O!+/$%)"+)2"&'45-)**)2">/02)26" !")..)*?"$!"&)-*"$12)/3)/"#=)W"')2"&4*0)!*2"'4"&résence
+,-!)" %4#/$*=/$%1$&(!0)" %$+(/()" #4/4#*(/isée par une absence de granule C" +4!2" '4" %4X$/0*(" +)2"
thrombocytes. Par ailleurs, une tendance à développer une fibrose médullaire classiquement rapportée dans les
syndromes des plaquettes grises a également été identifiée chez les patients.

43
1.3.2.1.5 Anomalies de HOXA11

Le FT HOXA11 est codé par le gène HOXA11 localisé en 7p15.2 et fait partie des gènes homeobox
0!+02&)!241')2"4-E"&/)%0F/)2"(*4&)2"+)"+(3)'$&&)%)!*"+)"',)%1/O$!6"J4!2"'4"'0>!()"=(%4*$&$p(*05-)?"#)"aA"
serait exprimé uniquement aux stades les plus précoces. Les mutations du gène HOXA11 sont responsables
+,-!)"thrombopénie syndromique amégacaryocytaire caractérisée par une thrombopénie majeure, une fusion
radio-#-10*4')")*"-!"/025-)"4##/-"+,0!2-..024!#)"%(+-''40/)">'$14')"@H:N: : 142958) (Thompson and Nguyen,
2000). Cette pathologie extrêmement rare se rapproche des syndromes à transmission autosomique récessive
TAR (Thrombocytopenia-absent radius, OMIM : 274000) qui trouvent leur origine dans la présence de
%-*4*0$!2" &$!#*-)'')2" +-" >F!)" nG:[S" #$+4!*" &$-/" -!)" &/$*(0!)" 0%&'05-()" +4!2" ',(&0224>)" 4'*)/!4*if et
',4+/)224>)"+)2"Sn\%"(Albers et al., 2012).

1.3.2.2 Anomalies de la structure des plaquettes

!" ',412)!#)" +,4#*034*0$!?"')2" &'45-)**)2" 24!>-0!)2" /)2*)!*"&=O20$'$>05-)%)!*" +4!2"-!"(*4*"+)"/)&$2"$t"'es

/(2)/3)2" +)" %)%1/4!)2" /)&/(2)!*()2" &4/" ')" 2O2*F%)" #4!4'0#-'40/)" $-3)/*"2$!*" )!#=u22()2" <"',0!*(/0)-/" +)"'4"
#)''-')6" !"#42"+,4!$%4'0)"+)2"&/$*(0!)2"+-"#O*$25-)')**)?"')2".$/#)2"5-0"%40!*0)!!)!*"'4".$/%)"+02#$p+)"+)2"
plaquettes sont altérées conduisant à des anomalies morphologiques souvent associées à une macrocytose
plaquettaire.

Par ailleurs, les déficits qualitatifs ou quantitatifs en organelles plaquettaires sont responsables de
*=/$%1$&4*=0)2"422$#0()2"')"&'-2"2$-3)!*"<"+)2"+(.0#0*2"+,4#*034*0$!"+)s plaquettes. Les mutations de NBEAL2
responsables, comme les anomalies du FT GFI1B, de syndromes des plaquettes grises seront donc traitées dans
cette partie. Les maladies du pool vide (l-SPD) liées à des anomalies qualitatives ou quantitatives des granules
l .)/$!*"',$1X)*"+,-!)"&/(2)!*4*0$!"+(*40''()"+4!2"'4"*/$020F%)"&4/*0)"+)"#)"%4!-2#/0*6

1.3.2.2.1 Anomalies de la myosine 2A

Le gène MYH9 localisé en 22q13.1 code pour la chaine lourde de la myosine non musculaire de type IIA. Les
mutations du gène sont responsables de plusieurs entités auparavant séparées : ',4!$%4'0)"+)":4O-Hegglin,
')2"2O!+/$%)2"+)"9)142*04!?"+)"a)#=*!)/"+, &2*)0!"40!20"5-)"#)/*40!2"2O!+/$%)2"+,S'&$/*6"9-0*)"<"'4"%02)")!"
évidence de mutations du gène MYH9, ces différentes entités ont été regroupées sous le nom de syndrome
MYH9 depuis 2000 (OMIM : 160775) (Seri et al., 2000). Ce syndrome à transmission autosomique dominante
est la cause la plus fréquente de macrothrombopénie et est caractérisé par un VPM largement augmenté (en
%4X$/0*("2-&(/0)-/"<"QM".7;"422$#0("<"'4"&/(2)!#)"+,4%42"+)"%O$20!)"&$'O%(/02()"+4!2"')2"')-#$#O*)26"9)'$!"'4"
'$#4'024*0$!"+)"'4"%-*4*0$!?"')"2O!+/$%)"&)-*"2,4##$%&4>!)/"+)"',4&&4/ition progressive de surdité, de cataracte
)*" +,0!2-..024!#)" /(!4')6" !" &4/*0#-'0)/?" ')2" %-*4*0$!2" +-" +$%40!)" %$*)-/" 20*-(" )!" \-terminal entrainent
>(!(/4')%)!*"-!)"*=/$%1$&(!0)"&/$.$!+)"#$//('()"<"'4"2(3(/0*("+-"2O!+/$%)"=(%$//4>05-)")*"<"',4&&4/0*0$!"
des manifestations extra-hématologiques dans les tissus qui expriment également la myosine 2A (Pecci et al.,

44
2014). Le diagnostic repose sur la mise en évidence de la macrothrombopénie associée à une absence de
changement de forme plaquettaire objectivable 4-"#$-/2"+)2"*)2*2"+,4>/(>4*0$! réalisés in vitro6"7,-*0'024*0$!"
de modèles murins Knock-in a permis de reproduire la pathologie humaine liée à des mutations ponctuelles
associant une macrothrombopénie et des manifestations extra-=(%4*$'$>05-)2" /)*/$-3()2" #=)W" ',k$%%)"
(Zhang et al., 2012)6"D)&)!+4!*?"'4"#$//('4*0$!">(!$*O&)v&=(!$*O&)"2-/"',4&&4/0*0$!"des manifestations extra-
hématologiques observées #=)W"',k$%%)"!,4"&$-/"',0!2*4!*"&42"&-"I*/)"%02)")!"(30+)!#)"+4!2"#)2"%$+F')2"
animaux.

1.3.2.2.2 Anomalie de la filamine A

Le gène FLNA '$#4'02(")!"o5L["#$+)"&$-/"'4".0'4%0!)"S?"-!)"&/$*(0!)"5-0"&)/%)*"',4!#/4>)"+)2"/(#)&*)-/2"

membranaires comme le complexe GPIb-V-No"4-"#O*$25-)')**)"+,4#*0!)"(Falet et al., 2010). Les anomalies de
la filamine A sont responsables de plusieurs maladies appelées filaminopathies (OMIM : 300017) caractérisées
par des anomalies cardiaques, cérébrales et osseuses (Hehr et al., 2006) (Kyndt et al., 2007). Cependant, la
%02)")!"(30+)!#)"/(#)!*)"+,-!)"%-*4*0$!"!$!-sens dans le gène FLNA )!*/40!4!*"'4"&/$+-#*0$!"+,-!)"&/$*(0!)"
tronquée suggère que certaines mutations de la filamine A sont responsables de thrombopathies isolées,
caractérisées par une macrothrombopénie et un syndrome hémorragique modéré (Nurden et al., 2011b).

1.3.2.2.3 !"#"$%&'()*(+#("!,!+$&*(-.

Le gène TUBB1 '$#4'02(")!"LP5QU6UL"#$+)"&$-/"',02$.$/%)"_Q"+)"'4"*-1-'0!)")E&/0%()"%4X$/0*40/)%)!*"&4/"')2"

plaquettes sanguines. Une mutation hétérozygote (p.R318W) de ce gène a été mise en évidence dans une seule
.4%0'')")*"2)%1')"/)2&$!241')"+,-!)"%4#/$*=/$%1$&(!0)"@H:N: : 612901) (Kunishima et al., 2009) liée à une
+(2$/>4!024*0$!"+)"',422)%1'4>)"+)"%0#/$*-1-')2"4-"#$-/2"+)"'4".$/%4*0$!"+)2"&/$&'45-)**)2"(Kunishima et al.,
2014). Aucune donnée sur -!" (3)!*-)'" &=(!$*O&)" =(%$//4>05-)" +)2" &4*0)!*2" &$/*)-/2" +)" '4" %-*4*0$!" !,4"
cependant été rapportée.

1.3.2.2.4 !"#"$%&'()*(+/0-actinine

Le gène ACTN1 '$#4'02(")!"Qd5Ld6Q"#$+)"&$-/"',C-4#*0!0!)"Q?"-!)"&/$*(0!)"'0()"4-E"%0#/$.0'4%)!*2"+,4#*0!)"

qui permet leur ancrage à la membrane plasmique. Plusieurs mutations ponctuelles mises en évidence par deux
équipes en 2013 (Kunishima et al., 2013) (Gueguen et al., 2013) conduisent à une macrothrombopénie à
transmission autosomique dominante qui ne semble pas associée à un syndrome hémorragique particulier.
S-#-!)"4!$%4'0)".$!#*0$!!)'')"!,4"+,40'')-/2"(*("%02)")!"(30+)!#)"'$/2"+)2"(&/)-3)2"+,4>/(>4*0$!"&'45-)**40/)6"
Ces données ont été confirmées récemment par Bottega et al (Bottega et al., 2015) qui ont identifié des
mutations du gène ACTN1 dans environ 4% des macrothrombopénies de leur cohorte de 128 patients.

45
1.3.2.2.5 Mutations de la protéine WAS

Le gène WAS localisé en Xp11.22 code pour la protéine WAS qui est exprimée uniquement dans la lignée
=(%4*$&$p(*05-)")*"5-0"&4/*0#0&)"<"'4"&$'O%(/024*0$!"+-"#O*$25-)')**)"+,4#*0!)6"T'-20)-/2"*O&)2"+)"%-*4*0$!2"
ont été mis en évidence et donnent naissance à deux pathologies de sévérité différente6"S"',0!3)/2)"+)2"4-*/)2"
thrombopathies liées à une anomalie des protéines du cytosquelette, ces pathologies sont caractérisées par la
&/(2)!#)"+,-!)"microthrombopénie. Les mutations non-sens, les insertions/délétions (INDEL) et les mutations
complexes entrainent le syndrome de Wiskott-Aldrich (OMIM : 301000) (Massaad et al., 2013) qui associe à
la microcytose plaquettaire, un déficit immunitaire sévère et une prédisposition aux maladies auto-immunes et
4-E"=(%$&4*=0)2"%4'0>!)26" !"',412)!#)"+)"*/40*)%)!*"&4/"4''$>/)..)"+)"#)''-')2"2$-#=)2"=(%4*$&$p(*05-)2"$-"
de thérapie génique, ce syndrome es*"%$/*)'"+4!2"',)!.4!#)"+4!2"'4"&'-&4/*"+)2"#42"(Boztug et al., 2010). La
forme modérée de la pathologie, le syndrome XLT (OMIM : 313900), est lié à la présence de mutations faux-
sens et se limite à une microthrombopénie associée à un syndrome hémorragique modéré (Ochs, 2009).

1.3.2.2.6 Anomalie des 12#&!+*'(0

Le syndrome des plaquettes grises (GPS) est connu au minimum depuis les années 70 mais la découverte des
gènes impliqués dans la pathologie est extrêmement récente. En plus des mutations de GFI1B présentées
précédemment, le gène NBEAL2 (Albers et al., 2011) (Gunay-Aygun et al., 2011) (Kahr et al., 2011) a
également été décrit pour être responsable de GPS. NBEAL2, localisé en 3p21.31 code pour une protéine
0!+02&)!241')"<"'4"10$2O!*=F2)"+)2">/4!-')2"C"+$!*"')"/B')")E4#*"/)2*)"<"#)"X$-/"0!+(*)/%0!(6"7)2"%-*4*0$!2"du
gène sont r)2&$!241')2" +,-!)" *=/$%1$&4*=0) à transmission autosomique récessive (OMIM: 614169)
caractérisée par une thrombopénie modérée à VPM légèrement augmenté mais surtout par une absence ou
5-420" 412)!#)" +)" >/4!-')2" C" +4!2" ')2" &'45-)**)2" +)2" &4*0)!*26" 7)" 2O!+/$%)" =(%$//4>05-)" 422$#0(" )2*"
géné/4')%)!*" %$+(/(" %402" ',(3$'-*0$!" +)" '4" &4*=$'$>0)" 3)/2" '4" .01/$2)" %(+-''40/)" majore le phénotype
hémorragique dû à la sévérité de la thrombopénie au cours de la vie des patients. A ce jour, aucune différence
&=(!$*O&05-)"%4X)-/)"!,4"&-"I*/)"(*41'0)")!*/)"'es GPS dus à des mutations de GFI1B et des mutations de
NBEAL2.

1.3.2.3 Anomalies des récepteurs plaquettaires

7,)!2)%1')" +)2" &4*=$'$>0)2" &'45-)**40/)2" &/(2)!*()2" #0-dessous entraine des anomalies fonctionnelles des
plaquettes sanguines objectivables lors des test2"+,4>/(>4*0$!"&'45-)**40/)6"D)/*40!)2"&4*=$'$>0)2"2$!*"422$#0()2"
à des anomalies de la morphologie plaquettaire et/ou à une thrombopénie

1.3.2.3.1 Anomalies du complexe GPIb-V-IX : Syndrome de Bernard-Soulier

Les anomalies du complexe GPIb-V-IX entrainent une pathologie à transmission essentiellement autosomique
récessive : le syndrome de Bernard-Soulier (OMIM : 231200). Cette thrombopathie est caractérisée chez
',k$%%) par une macrothrombopénie (en moyenne 60 000 plt/µL (Savoia et al., 2011) avec présence de

46
plaquettes géantes et un syndrome hémorragique cutanéomuqueux souvent sévère. La pathologie touche
environ une personne sur un million (Balduini et al., 2013) et est liée à des mutations dans les gènes codant les
sous-unités GP !"# $GPIBA, localisé en 17p13.2), GPIb%# $GPIBB, localisé en 22q11.21) et/ou GPIX (GP9
localisé en 3q21.3&'#()*)+,#-)./.01+#.1)*2/+.#3,#45+,#*16/+.#71)8#3/#9:;#+</#=.=#6=*80.,#>#*,#?1)8'#@/#78=A,+*,#
6,#*,A#/+1-/30,A#4=+=.0B),A#,A.#8,A71+A/!3,#6<)+,#60-0+).01+#C108,#6,#3</!A,+*,#6<,D78,AA01+#6,#3/#78otéine
à la membrane plaquettaire ,.#/)#+0C,/)#E1+*.01++,3#6<)+,#/!A,+*,#6</443).0+/.01+#0+6)0.,#7/8#3/#80A.1*=.0+,.
@<absence du complexe entraine 3/#A)778,AA01+#6,#3<0+.,8/*.01+#,+.8,#3/#9: !"F#3/#E03/-0+,#,.#3,#*G.1AB),3,..,#
6</*.0+,#B)0#-/0+.0,+.#+18-/lement les plaquettes au repos dans une forme discoïde (Cranmer et al., 2005) et
serait donc impliquée dans la macrocytose plaquettaire. Dans sa forme classique, seuls les patients porteurs de
deux mutations du même gène sont symptomatiques. Ceci implique B)<,+# 3</!A,+*,# 6, consanguinité, les
malades sont généralement hétérozygotes composites. Les personnes apparentées aux patients BSS et porteurs
6<)+,#A,)3,#-)./.01+#+,#A1+.#+0#.281-!17=+0B),s ni symptomatiques mais une macrocytose plaquettaire est
fréquemment observée.

:3)A#8=*,--,+.F#)+,#E18-,#61-0+/+.,#6,#3/#.281-!17/.20,#/#=.=#6=*80.,#6</!186#6/+A#6,A#E/-033,A#6)#A)6#6,#
3< ./30,#48H*,#>#3/#-0A,#,+#=C06,+*,#6<)+,#78,-058,#-)./.01+#du gène GPIBA : *'IJIKLM#.8/+AE18-/+.#3</3/+0+,#
en position 172 en valine (Miller et al., 1992). Cette forme de BSS mono-allélique dite « Bolzano » est
*/8/*.=80A=,#7/8#3/#78=A,+*,#6<)+,#-/*81.281-!17=+0,#73)A#-16=8=,#B),#6/+A#3,A#E18-,s de BSS bi-alléliques.
@<expression membranaire du complexe GPIb-V-IX +<,A.#3/#73)7/8.#6)#.,-7A#B),#3=458,-,+.#0+E=80,)8,#/)D#
valeurs normales observées dans la population générale (Noris et al., 2012). Le syndrome hémorragique est
majoritairement modéré et limité à des épistaxis et à des gingivorragies mais peut parfois être complètement
/!A,+.'#N,7)0A#3<06,+.0E0cation de la mutation Bolzano, trois autres mutations du gène GPIBA (p.Asn57His,
p.Tyr70Asp et p.Leu73Phe) et une mutation du gène GPIBB (p.Arg42Cys) provoquant toutes des formes de
BSS mono-alléliques ont été mises en évidence.

O+#PQJRF#PJJ#E/-033,A#1+.#=.=#06,+.0E0=,A#6/+A#3,#-1+6,#7/8#3,#*1+A18.0)-#0+.,8+/.01+/3#71)8#3<=.)6,#6,A#STS
bi-alléliques (Savoia et al., 2014). Au sein de ces familles, 45 mutations touchent le gène GPIBA, 38 le gène
GPIBB, et 28 le gène GP9. Ces mutations sont réparties essentiellement dans les domaines extracellulaires des
781.=0+,A#,.#.1)*2,+.#78=E=8,+.0,33,-,+.#3,A#8=401+A#80*2,A#,+#3,)*0+,AF#-/0A#6</).8,A#A0.,A#7,)C,+.#=galement
être affectés.

U+#7,).#,+E0+#+1.,8#B),#6/+A#*,8./0+,A#V1+,A#4=148/720B),AF#3/#E8=B),+*,#6<)+,#-)./.01+#7/8.0*)3058,#7,).#W.8,#
E18.,-,+.#/)4-,+.=,'#K<,A.#3,#*/A#+1./--,+.#A)8#3<X3,#6,#3/#Y=)+01+#1Z la mutation c.265A>G du gène GPIBB
a été identifiée chez 13 patients appartenant à 7 familles à priori sans consanguinité. La reconstruction de
3</8!8,# 4=+=/3140B),# 8,-1+./+.# ># 3/# JJème génération a permis de mettre en évidence un effet fondateur

47
8,-1+./+.#>#3/#*131+0A/.01+#6,#3<X3,#S1)8!1+#7/8#3,A#*131+s français établis sur les comptoirs commerciaux
situés à Goa en Inde en 1678 (Lanza et al, poster ISTH, 2012) (Figure 15).

Figure 15 : !"!#$%&'&()*%+,-#$.#/$0(1+#'1/$233$.#$)4+)#$.#$)($5&-'+*'
Les patients atteints de syndrome de Bernard-Soulier partagent tous un ancêtre commun : une femme
*!+%+'(+!#$.#$6*($#'$7'.#$(!!+8&#$#'$9:;<$/-!$)#$"(1#(-$=)#$5*//+%'*)>?$ $@#11#$&0*,-#A$9B$C(D+))#/$C!('E(+/#/$
&1(+#'1$0!&/#'1#/$/-!$)4F)#?$

Enfin, certaines mutations de 3/# 9: !"# ,+.8/0+,nt une pathologie plaquettaire proche de la maladie de
Willebrand de type 2B : la maladie pseudo-Willebrand ou Willebrand plaquettaire. Cette thrombopathie à
transmission autosomique dominante identifiée en 1982 (Weiss et al., 1982) est caractérisée par la présence
6<)+,#-)./.01+#4/0+#6,#E1+*.01+#B)0#/)4-,+.e 3</EE0+0.=#6,A#73/B),..,A#71)8#3,#VWF et entraine une clairance
accrue des multimères de haut p106A#-13=*)3/08,#/0+A0#B)<)+,#-/*81.28ombopénie. Le diagnostic repose sur
3/#-0A,#,+#=C06,+*,#6<)+,#hyperagglutination induite par la ristocétine à faible concentration (0,5 mg/mL) et
+=*,AA0.,#6,A#.,A.A#6</443).0+/.01+#*810A=A#).ilisant les plaquettes des patients et un plasma témoin.

48
1.3.2.3.2 Anomalies de la GPVI

Les anomalies de GPVI (OMIM : 605546) sont généralement mises en évidence lors 6,A#=78,)C,A#6</48=4/.01+#
73/B),../08,# /)# *1)8A# 6,# 3<,D7318/.01+# 6,# 7/.0,+.A# 78=A,+./+.# )+# AG+681-e hémorragique très modéré. On
1!A,8C,#/318A#)+,#60-0+).01+#C108,#)+,#/!A,+*,#6</48=4/.01+#0+6)0.,#7/8#3,#*133/45+,#/0+A0#B),#7/8#3,A#/41+0A.,A#
directs de la GPVI (CRP et convulxine). Ces résultats sont généralement associés à une diminution
6<,D78,AA01+#6e la GPVI membranaire. La majorité des déficits en GPVI décrits >#*,#?1)8#*2,V#3<[1--,#A1+.#
des déficits acquis, 30=A#>#3/#78=A,+*,#6</).1-anticorps anti-GPVI, à des anomalies de signalisation en aval du
récepteur (Arthur et al., 2007) ou à un processus de clivage du domaine extracellulaire par des métallo-
protéases de type ADAMT10. Cependant, quelques cas de mutations familiales ont été récemment décrits
(Hermans et al., 2009) (Matus et al., 2013). Il a par ailleurs été rapporté (Nurden et al., 2004) une association
6<)+# 6=E0*0.# ,+# 9:; # ,+# 78=A,+*,# 6<)+# AG+681-,# 6,A# 73/B),..,A# 480A,s qui amplifierait le potentiel
hémorragique de la thrombopathie.

1.3.2.3.3 Anomalies !"#$%&'()*%&!"+,,-./ : Maladie de Glanzmann

Les déficits qualitatifs ou quantitatifs en GPIIb-IIIa conduisent à un syndrome hémorragique majeur sans
thrombopénie appelé Thrombasthénie de Glanzmann (GZ) dont la prévalence est estimée à environ 1/1
000 000 dans la population générale. Nous savons dorénavant que cette thrombopathie est liée des mutations
des gènes codant les deux sous-unités de la GPIIb-IIIa. En août 2015, 255 mutations du gène ITGA2B et 164
mutations du gène ITGB3 1+.#=.=#6=*80.,A#6/+A#3/#30..=8/.)8,#,.#3<,+A,-!3,#6,A#61++=,A#A1+.#*133,*.=es dans la
!/A,# 6,# 61++=,A# 0+.,8+/.01+/3,# 6,# 3< */2+# T*2113# 1E# \,60*0+,# /.# \1)+.# T0+/0 (Mount-Sinai-School-of-
Medicine). Globalement, les grandes délétions dans la séquence de ces deux gènes sont rares contrairement
aux mutations non-sens, aux mutations de type INDEL de petite taille et aux mutations décalant la phase de
lecture qui donnent naissance à des protéines tronquées ou non fonctionnelles (Nurden et al., 2011a).
K,7,+6/+.F#>#*,#?1)8F#/)*)+,#*188=3/.01+#,+.8,#3,#.G7,#6,#-)./.01+#,.#3,#72=+1.G7,#2=-188/40B),#1!A,8C=#+</#
pu être mise en évidence (George et al., 1990) (Nurden et al., 2012). Seuls les travaux publiés par M. Fiore
suggèrent que les anomalies du gène ITGB3 confèrent un phénotype particulièrement hémorragique (Fiore et
al., 2012). Les maladies de GZ sont classées en trois .G7,A#6=7,+6/+.#)+0B),-,+.#6,#3<,D78,AA01+#8=A06),33,#
6,# 3<0+.=480+,# ># 3/# A)8E/*,# 73/B),../08,]# 3,A# 7/.0,+.A# ,D780-/+.# -10+A# 6,# I^# 6,# 9: !-IIIa sont considérés
comme des patients GZ de type I, les patients exprimant entre 5 et 20% de GPIIb-IIIa sont atteints de maladie
de GZ de type II et les rares patients exprimant plus de 20% de GPIIb-IIIa sont considérés comme GZ variants.
@,A#7/.0,+.A#9_#C/80/+.A#*1+A,8C,+.#61+*#)+,#,D78,AA01+#8=A06),33,#6,#3<0+.=480+,#+18-/3,-,+.#A)EE0A/+.,#71)r
0+6)08,#3/#E0D/.01+#6)#E0!80+145+,#,.#3</48=4/.01+#73/B),../08,'#K,7,+6/+.F#A/+A#/!1308#3<,D78,AA01+#-,-!8/+/08,#
de la protéine, les mutations GZ variants perturbent 3</*.0C/.01+#6,#3<0+.=480+,#(Chen et al., 1992), la stabilité
de la liaison récepteur/ligand (Bajt and Loftus, 1994) (Honda et al., 1998) ou la transduction du signal en aval
du récepteur (Wang et al., 1997). Les recherches /*.),33,A#A,#E1*/30A,+.#6<)+,#7/8.#A)8#3<=.)6,#6,#*,A#C/80/+.A#
B)0#7,8-,.#3<06,+.0E0*/.01+#6,A#7/8.,+/08,A#-13=*)3/08,A#8,A71+A/!3,A#6,#3</*.0C/.01+#6,A#0+.=480+,A#(Nurden et

49
al., 2015) ,.# 6</).8,# 7/8.# sur la mise en évidence de nouvelles formes de la pathologie associant une
macrothrombopénie modérée et une transmission autosomique dominante (Gresele et al., 2009).

1.3.2.3.4 Anomalies du récepteur au thromboxane A2

Les mutations du gène codant pour le récepteur au TXA2 (gène TBXA2R localisé en 19p13.3) entrainent la
78=A,+*,#6<)+#AG+681-,#2=-188/40B),#-16=8=#>#.8/+A-0AA01+#/).1A1-0B),#61-0+/+.,#$U\ \]#J``QaQ&'#(#
*,#?1)8#3,A#B)/.8,#-)./.01+A#-0A,A#,+#=C06,+*,#>#3<=./.#2=.=81VG41.,#,+.8/0+,+.#)+,#0+*/7/*0.=#6,A#73/B),..,A#
des patients ># /48=4,8# ,+# 78=A,+*,# 6</*06,# /8/*2061+0B),# ,.# )+,# /48=4/.01+# E18.,-,+.# 6iminuée après
A.0-)3/.01+#7/8#3</+/314),#6)#Mb(2 : U46619 (Mumford et al., 2013) (Nisar et al., 2014).

Les mutations du récepteur P2Y12 sont également responsables de maladies plaquettaires entrainant chez les
patients un phénotype hémorragique hétérogène. Ces anomalies seront traitées en détails dans la deuxième
partie de ce manuscrit.

Par ailleurs, il existe de nombreux autres récepteurs plaquettaires (récepteurs à la sérotonine SERT, récepteur
>#3/#C/A178,AA0+,F#8=*,7.,)8#>#3<(N:#:Pc1, récepteur canal P2X1 ,.*'&#/0+A0#B),#6</).8,A#43G*1781.=0+,A ("I%JF
"d%JF V!3 ,etc.) qui pourraient potentiellement être impliquées dans des thrombopathies. Cependant, à ce
?1)8F#/)*)+,#/+1-/30,#6,A#45+,A#*16/+.#*,A#781.=0+,A#+</#=.=#-0A,#,+#=C06,+*,#*2,V#6,A#7/.0,+.A'

1.3.2.4 Anomalies des protéines de signalisation

1.3.2.4.1 Anomalies de la kindlin-3

Les mutations des gènes codant pour les molécules impliquées dans la transduction du signal en amont de
3</*.0C/.01+ 6,# 3<0+.=480+,# " !%e# 61++,+.# +/0AA/+*,#># 6,A# .281-!17/.20,A# /)# 72=+1.G7,# 2=-188/40B),#.85A#
proche de celui observé chez les patients atteints de maladie de GZ. Les mutations du gène FERMT3 localisé
en 11q13.1 (OMIM : 612840) codant pour la kindlin-e# 0+60A7,+A/!3,# ># 3</*.0C/.01+# 6,# 3<0+.=480+,# A1+.#
dorénavant connues pour être responsables de la pathologie LAD-3 (leukocytes adhésion deficiency type 3)
(Svensson et al., 2009). Cette pathologie à transmission autosomique récessive associe un syndrome
hémorragique majeur de type GZ (30=#>#)+#6=E0*0.#6</*.0C/.01+#6,A#0+.=480+,A) à un déficit immunitaire.

1.3.2.4.2 Anomalie de CalDAG-GEFI

Très récemment, une mutation (c.G742T) du gène RASGRP2 (Canault et al., 2014) codant pour le facteur
6<=*2/+4,# K/3N(9-GEFI a été mise en évidence chez trois enfants 6<)+,# -W-,# E/-033,# *1+A/+4uine
78=A,+./+.# )+# AG+681-,# 2=-188/40B),# 0-718./+.'# K,..,# /+1-/30,# /!130.# 3</*.0C/.01+# 6,# 3/# 9M:/A,# Y/!J#
+=*,AA/08,#>#3</*.0C/.01+#6,#3<0+.=480+,#"IIb%e'#@,A#=78,)C,A 6</48=4/.01+#73/B),../08, réalisées in vitro mettent
en évidence une diminution 6</-730.)6,#6</48=4/.01+#/785A#A.0-)/.01+#6,A#73/B),..,A 7/8#3<ADP tandis que la
réponse à une stimulation par un peptide agoniste de PAR-1 ou par le collagène semble impactée plutôt quand
6,#E/0!3,A#*1+*,+.8/.01+A#6</41+0A.,A#A1+.#).030A=,A.

50
1.3.2.4.3 0&123#%!" !"#$%4151*2! gamma de la sous-unité catalytique de la protéine kinase dépendante
!"#$0678"9%4151*2!":" !"#3"41;4-unité catalytique de la PKA)

Très récemment également, une mutation du gène PRKACG localisé en 9q21.11 a été mise en évidence chez
deux enfants 0AA)A#6<)+e famille consanguine et présentant un syndrome hémorragique assez sévère (score de
3<U\T#6,#e#1)#R&'#@/#7/.213140,#>#.8/+A-0AA0on autosomique récessive (OMIM : 176893) se présente sous la
E18-,#6<)+,#-/*81.281-!17=+0,#-/?,)8,#/AA1*0=,#>#)+#6=E0*0.#6</*.0Cation plaquettaire. Celui-ci est mis en
=C06,+*,#7/8#)+#6=E0*0.#6<,D71A0.01+# du pool de GPIIb-IIIa intra-*,33)3/08,F#)+#6=E0*0.#6<,D71A0.01+#6,#3/# P-
selectine et une réduction de la mobilisation du calcium intracellulaire après stimulation des plaquettes
(Manchev et al., 2014).

1.3.2.4.4 0&123#%!" !"#$0&18'32%&"<

Les mutations du gène TMEM16F localisé en 12q12 et codant pour la scramblase Anoctamin-6 entraine une
thrombopathie à transmission autosomique récessive connue sous le nom de syndrome de Scott (OMIM :
262890) (Suzuki et al., 2010)'# K,..,# 781.=0+,# ?1),# )+# 8f3,# ,AA,+.0,3# 6/+A# 3</*B)0A0.01+# 6)# */8/*.58,# 781-
*1/4)3/+.# 6,A# 73/B),..,A# /)# *1)8A# 6,# 3</*.ivation plaquettaire. En effet, ,33,# 7,8-,.# 3<,D71A0.01+# 6,A#
phosphatidylsérines vers le milieu extracellulaire par un mécanisme de migration dépendant du calcium
(Munnix et al., 2003). Les patients atteints de syndrome de Scott présentent généralement un syndrome
hémorragique modéré et le diagnostic repose sur 3/#-0A,# ,+# =C06,+*,# 6</+1-/30,s de consommation de la
prothrombine et surtout 6<)+# 6=E0*0.# 6<,D71A0.01+# 6,A# 721A72130706,A# /+01+0B),A# /785A# une stimulation
puissante des plaquettes par un peptide agoniste de PAR1 associé au collagène et/ou la convulxine.

51
1.4 Problématique de la thèse

Nous venons dans cette première partie de dresser un état des connaissances sur les plaquettes sanguines ainsi
que sur les outils actuellement disponibles pour le diagnostic des différents types de thrombopathies connues.

N/+A#*,#*1+.,D.,F#3,#3/!18/.108,#6<=.)6,#6,A#E1+*.01+A#73/B),../08,A#6,#3<OgT#(3A/*,#,.#3<)+0.=# hTOY\#UMR
TiRi#A1+.#8=4)3058,-,+.#A1330*0.=A#71)8#E/08,#3,#60/4+1A.0*#,.#3/#*/8/*.=80A/.01+#6,A#/+1-/30,A#6,#3<2=-1A./A,#
primaire dues à une pathologie plaquettaire. Nous sommes alors confrontés à trois types de situation :

- Nous mettons en évidence des anomalies morphologiques et/ou fonctionnelles typiques de

thrombopathies bien caractérisées et le génotypage des patients met en évidence une mutation connue.
DanA#*,#*/A#3<1!?,*.0E#6)#3/!18/.108,#,A.#6,#6=C,3177,8#)+,#A.8/.=40,#60/4+1A.0B),#,EE0*0,+.,#,.#78=*0A,#
pour conduire au diagnostic rapide de ces maladies.
- Nous mettons en évidence des anomalies plaquettaires typiques mais le génotypage du patient met en
évi6,+*,# )+,# -)./.01+# +1+# 6=*80.,# 6<)+# 45+,# 6=?># 06,+.0E0='# N/+A# *,# */AF# 3/# */8/ctérisation de la
thrombopathie passera par une étude des effets de la mutation, à la fois sur les plaquettes du patient
mais aussi dans un modèle cellulaire ou animal adapté.
- Nous mettons en évidence des anomalies plaquettaires atypiques qui ne peuvent pas être reliées à une
.281-!17/.20,#!0,+#=.0B),.=,'#@,#3/!18/.108,#*/8/*.=80A,#/)#-0,)D#3/#7/.213140,#73/B),../08,#>#3</06,#
6</+/3GA,A# -187213140B),A# ,.# E1+*.01++,33,A# A7=*0/30A=,A et recherche des gènes candidats
potentiellement responsables de la pathologie.

Nous sommes donc amenés à étudier des thrombopathies très différentes, mais nous nous limiterons pour ce
mémoire de thèse 6<)+0C,8A0.=# aux travaux les plus avancés effectués au laboratoire depuis 2013. Nous
78=A,+.,81+A#3<=.)6,#6,#6,)D#48/+6A#.G7,A#6,#7/.213140,s plaquettaires :

- Les anomalies du récepteur P2Y12 : nous avons récemment identifié trois nouvelles mutations du
récepteur P2Y12 dans trois familles différentes.
- Les maladies du pool vide : nous développerons en particulier la stratégie adoptée pour rechercher les
gènes impliqués dans une forme de maladie du pool vide non syndromique identifiée chez trois
-,-!8,A#6<)+,#E/-033,#6,#A0D#7,8A1++,A.

52
2 Diagnostic des thrombopathies liées à des anomalies du
récepteur P2Y12 et caractérisation des variants du récepteur
identifiés au laboratoire

2.1 Le récepteur P2Y12

Le récepteur P2Y12 est un RCPG composé de 342 acides aminés et portant deux ponts disulfures
extracellulaires qui lient 3,A#*GA.=0+,A#,+#71A0.01+#Ja#,.#PaQ#6<)+,#7/8.#,.#3,A#*GA.=0+,A#,+#71A0.01+#ia#,.#JaI#
6</).8,#7/8.'#@/#781.=0+,#,A.#*16=,#7/8#3,#45+,#P2RY12 localisé sur le bras court du chromosome 3 et qui ne
*1-718.,#B)<)+#A,)3#,D1+#*16/+. (Cattaneo, 2011b). Le récepteur porte par ailleurs deux sites de glycosylation
dans son domaine N-terminal et deux sites de phosphorylation sur les boucles intracellulaires 2 et 3 (Figure
16).

Figure 16 : Structure linéaire du récepteur P2Y12

(Cattaneo et al, Blood, 2011) (Cattaneo, 2011b).

Le récepteur a été cristallisé récemment à la fois dans une conformation où il est lié à un agoniste (le 2
Methylthio-ADP) (Zhang et al., 2014a) et dans une conformation où il est lié à un antagoniste non
+)*3=1.060B),#$3<(_NJP`e&#(Zhang et al., 2014b) (Figure 17).

53
Ces travaux récents ont montré que le site de liaison des agonistes nucléotidiques était en grande partie différent
de celui 7,8-,../+.#3/#30/0A1+#6<)+#/+./41+0A.,#+1+#+)*3=1.060B),#*1--,#3<(_NJP`e'#O+#,EE,.F#3/#30/0A1+#6<)+#
agoniste tel que le 2MeSADP fait intervenir 3 régions du récepteur :

- @/#30/0A1+#6)#*j)8#/6=+G30B),#,A.#,EE,*.)=,#7/8#3<0+.,8-=60/08,#6,A#/*06,A#/-0+=A#A)0vants : Y105,
F106, L155, S156 et N159
- @,#+1G/)#80!1A,#A<0+A58,#48H*,#>#3<0+.,8/*.01+#/C,*#3,A#/*06,A#/-0+=A#kJaiF#[J`aF#MJde#,.#kJaR
- Le groupement phosphate se lie grâce aux acides aminés R256, K280, Y259, R19 et R93.

N,#A1+#*f.=F#3<(_NJP`e#A,#30,#,AA,+.0ellement au récepteur grâce aux acides aminés: Y105, F252, R256,

Y259, L276 et K280.

Figure 17 : Représentation en trois dimensions du récepteur P2Y12 cristallisé

E'$0!&/#'@#$.4-'$('1(%*'+/1#(AZD1283) (à gauche) (Zhang et al., 2014b)A$#1$#'$0!&/#'@#$.4-'$(%*'+/te (2
MeSADP)(à droite) (Zhang et al., 2014a).

54
2.2 Le récepteur P2Y12 /)#*1)8A#6,#3</*.0C/.01+#6,A#73/B),..,A

@<(N:#,A.#)+#6,A#780+*07/)D#/41+0A.,A#A13)!3,A#A=*8=.=A#7/8#3,A#73/B),..,A#/)#*1)8A#6,#3,)8#/*.0C/.01+'#@18AB),#
3<(N:#*1+.,+)#6/+A#3,A#48/+)3,A#6,+A,A#,A.#A=*8=.=F#03#A,#lie à la fois au récepteur P2Y1 et au récepteur P2Y12.
Le récepteur P2Y1 entraine une mobilisation de calcium intra-cellulaire et initie le changement de forme des
plaquettes. Le récepteur P2Y12 ,+.8/0+,#/318A#)+,#3,C=,#6,#3<0+20!0.01+#73/B),../08,#0+6)0., par la prostacycline
(PGI2) 7816)0.,#7/8#3<,+61.2=30)-#C/A*)3/08,#,.#E/*030.,#/0+A0#3</*.0C/.01+#73/B),../08,##0+6)0.,#7/8#3,A#/).8,A#
agonistes solubles (TXA2F#.281-!0+,F#A=81.1+0+,&'#O+#,EE,.F#3/#30/0A1+#6,#3<(N:#/)#8=*,7.,)8#:Pc12 entraine
une activatio+#6,#3/#781.=0+,#9"i hétérotrimérique couplée au récepteur. La sous-)+0.=#"i inhibe alors 3<(K et
,+.8/0+,#)+,#60-0+).01+#6,#3<(\:#*G*30B),#$(\:*&#0+.8/*,33)3/08,#(Hechler and Gachet, 2011) ce qui facilite
3</*.0C/!030.=#6,A#73/B),..,A'#@/#60-0+).01+#6,#3<(\:*#,+.8/0+,#/318A#)+,#0+20!0.01+#6,#3/#:k(#B)0#-16)3,#
3<=./.#6,#721A7218G3/.ion de la protéine VASP (VAsodilator Stimulated Phosphoprotein). En parallèle, la sous-
)+0.=#%lm#/*.0C,#3/#: ek#B)0#7/8.0*07,#>#3</*.0C/.01+#6,A#0+.=480+,A#"IIb%e#,.#/)D#-=canismes de sécrétion (Figure
18).

Figure 18 : G*+#/$.4(@1+8(1+*'$#'$(8()$.#/$!&@#01#-!/$HBI1 et P2Y12

55
2.3 Diagnostic des anomalies du récepteur P2Y12

Les anomalies du récepteur P2Y12 peuvent être objectivées in vitro 48H*,#>#6,A#.,A.A#6</48=4/.01+ plaquettaire
réalisés en PRPc ou en plaquettes lavées. En effet, une absence ou un déficit fonctionnel du récepteur P2Y12
entraine une diminution très importante et caractéristique 6,#3</-730.)6,#6,#3</48=4/.01+#73/B),../08,#0+6)0.,#
7/8# 3<(N: même si celui-ci est utilisé à de fortes concentrations (> 10µM). En particulier, en PRPc, les
/48=4/.01+A# 0+6)0.,A# 7/8# 3<(N:# 8,A.,nt réversibles (Cattaneo, 2011a). La stimulation des plaquettes par le
collagène à faible concentration (1.25 µg/mL) entraine la plupart du temps et en particulier en cas de défaut
sévère, des agrégations réversibles.

@,#61A/4,#6<(\:*#73/B),../08,#dans différentes conditions de stimulation des plaquettes 7,8-,.#3<=C/3)/.01+#

de la fonctionnalité de la signalisation en aval du récepteur P2Y12. O+#,EE,.#3,#+0C,/)#6<(\:*#intracellulaire
est régulé par une balance entre deux types de récepteurs couplés aux protéines G. La PGI2 (ou la PGE1) via
son récepteur couplé à une protéine Gs ,+.8/0+,#)+,#/*.0C/.01+#6,#3<(K#,.#)+,#/)4-,+./.01+#6,#3<(\:*#/318A#
B),#3<(N:F#,+#A.0-)3/+.# 3,# 8=*,7.,)8# :Pc12 couplé à une protéine G"i, 0+20!,# 3<(K# ,.#0+6)0.#3/#60-0+).01+#
6<(\:*#0+.8/*,33)3/08,'#O+#*/A#6</+1-/30,#6,#.8/+A6)*.01+#6)#A04+/3F#3/#A.0-)3/.01+#6,A#73/B),..,A#7/8#3<(N:#
en présence de PGE1 +<,+.8/0nera pas la 60-0+).01+#6<(\:*#0+.8/*,33)3/08, qu,#3<1+#1!A,8C,#*3/AA0B),-,+.
sur des plaquettes témoin. (Figure 19)'#@<0+*1+C=+0,+.#-/?,)8#6,#*,..,#.,*2+0B),#8=A06,#6/+A#3<1!304/.01+ de
60A71A,8# 6<)+# C13)-,# 6,# A)A7,+A01+# 73/B),../08,# A)EE0A/+.# 71)8# 8=/30A,r les tests. En effet, pour chaque
*1+*,+.8/.01+#6<(N:#.,A.=,F#e#>#R#-@#6,#A)A7,+A01+#73/B),../08,#>#eQQ 000 plt/µL sont nécessaires.

Le test VASP (Aleil et al., 2005) qui repose sur 3/#B)/+.0E0*/.01+#6,#3<=./.#6,#721A7218G3/.01+#6,#3/#781.=0+,#

;(T:#,A.#)+,#/3.,8+/.0C,#0+.=8,AA/+.,#/)#61A/4,#608,*.#6,#3<(\:*'#O+#,EE,.F#3/#721A7218G3/.01+#6,#;(T:#,A.#
sous la dépendance de la PKA, elle-même activée par la présence AMPc. La stimulation des plaquettes par
3<(N:#en présence de PGE1 ,+.8/0+,#)+,#60-0+).01+#6<(\:*F#et par voie de conséquence la quantité de VASP
phosphorylée est modifiée (Figure 19). Ce change-,+.# 6<=./.# 6,# 721A7218G3/.01+# ,A.# /318A# quantifiable en
cytométrie en flux. On obtient un indice de réactivité plaquettaire (PRI) proportionnel au *2/+4,-,+.#6<=./.#
de phosphorylation de la protéine. Ce test utilisé classiquement pour évaluer la réponse au traitement des
patients traités par antiagrégant plaquettaire de la classe des thienopyridines (antagonistes irréversibles du
récepteur P2Y12) peut être également utilisé pour mettre en évidence une anomalie importante de transduction
du signal chez les 7/.0,+.A#A)A7,*.=A#6<W.8,#718.,)8s 6<)+,#/+1-/30,#6)#8=*,7.,)8' N/+A#*,#*/AF#3<0+60*,#6,#
réactivité plaquettaire sera alors fortement diminué (valeurs normales du PRI sur des plaquettes témoins : 69%-
100%).

Les études de liaison de différents ligands (ADP, 2-methylthio-ADP (2MeSADP), analogues nucléotidiques
radiomarqués), aux récepteurs P2Y12 7,8-,..,+.# /318A# 6,# -,..8,# ,+# =C06,+*,# )+# 6=E/).# 6<,D78,AA01+# 6)#
récepteur sur les plaquettes des patients et/ou de c/8/*.=80A,8# 3</+1-/30,# 1!A,8C=,. Ces tests peuvent être
effectués sur des plaquettes fraiches provenant des patients, sur des membranes plaquettaires ou sur des cellules

56
exprimant 3,#8=*,7.,)8#6<0+.=8W.'# Pendant longtemps, la manière la plus précise de quantifier les récepteurs
P2Y12 A)8#3,A#73/B),..,A#A/+4)0+,A#=./0.#6<).030A,8#3,#P\,T(N: radiomarqué au 32P, au 33P ou au 3H, un agoniste
non sélectif du récepteur P2Y12 JQQ#E10A#73)A#7)0AA/+.#B),#3<(N:F#en présence de MRS2179, un antagoniste
spécifique du récepteur P2Y1 (Baurand et al., 2001)'#K,7,+6/+.F#3,#6=C,3177,-,+.#8=*,+.#6<)+#6=80C=#.80.0=#6)#
cangrelor, un analogue nucléotidique antagoniste sélectif du récepteur P2Y12 : le 3[H]PSB-0413 (El-Tayeb et
al., 2005) permet de réaliser une quantification précise du récepteur P2Y12 à la surface des plaquettes (Ohlmann
et al., 2013). Les différentes techniques de saturation et de compétition utilisant ce radioligand pour la
*/8/*.=80A/.01+#6,A#C/80/+.A#-0A#,+#=C06,+*,#/)#3/!18/.108,#1+.#E/0.#3<1!?,.#6<)+,#7)!30*/.01+#/*.),33,-,+.#A1)A#
presse et présentée en annexe 2.

Figure 19 : Régulation de la ,-('1+1&$.4 JH@$+'1!(@#))-)(+!#$#1$.#$)4&1(1$.#$0K*/0K*!L)(1+*'$.#$)($0!*1&+'#$

G 3H$(0!M/$/1+D-)(1+*'$.#/$0)(,-#11#/$0(!$)4 NH$*-$)($H6O1 (ou PGI2)
Le traitement des plaquettes par des antagonistes du récepteur P2Y12 (thienopyridines : ticlopidine,
clopidogrel ; ou antagoniste réversible du récepteur : AR-P:QQR9JST$+'K+"#$)4(@1+*'$.#$)4 NH?

57
2.4 Les différents mutations décrites pour le récepteur P2Y12

Bien que le récepteur P2Y12 +</0.#=.=#*31+=#B)<,+#PQQJ#7/8#[13317,.,8#9#,.#A1+#=B)07,#(Hollopeter et al., 2001),

3<,D0A.,+*,#6,#*,#8=*,7.,)8#>#3<(N:#=./0.#E18.,-,+.#A)A7,*.=,#6,7)0A#73)A#)+,#60V/0+,#6</++=,. En effet, il avait
déjà été montré en 1990 que la ticlopidine, le premier antiagrégant plaquettaire de la classe des thienopyridines,
inhibait A=3,*.0C,-,+.# 3<,EE,.# 6,# 3<(N:# A)8# 3n0+20!0.01+# 6,# 3<(K sans affecter la mobilisation de calcium
intracellulaire (Gachet et al., 1990) (Defreyn et al., 1991). Peu de temps après, M. Cattaneo (Cattaneo et al.,
1992) publia le premier cas de thrombopathie congénitale */8/*.=80A=,#7/8#)+#6=E0*0.#6</48=4/.01+#0+6)0.#7/8#
3<(N:#/AAocié à un syndrome hémorragique et dont les caractéristiques étaient super71A/!3,A#>#3<,EE,.#6<)+#
traitement antiplaquettaire par les thiénopyridines. Ces deux publications apportaient des arguments importants
,+#E/C,)8#6,#3<2G71.25A,#6,#6,)D#8=*,7.,)8A#>#3<(N:#60A.0+*.A#>#3/#A)8E/*,#6,A#73/B),..,AF#3<)+ responsable de
3<0+20!0.01+#6,#3/#E18-/.01+#6<(\:*F#6=E,*.),)D#*2,V#*,8./0+A#7/.0,+.A#,. inhibé par les thienopyridinesF#3</).8,#
responsable de la mobilisation du calcium intracellulaire (Gachet et al., 1995).

Nous savons dorénavant que les déficits congénitaux en récepteur P2Y12 sont responsables de thrombopathies
le plus souvent modérément hémorragiques en situation non traumatique. Deux grands types de mutations du
gène P2RY12 peuvent être différenciés ]#3,A#-)./.01+A#,+.8/0+/+.#)+,#/!A,+*,#6<,D78,AA01+#6,#3/#781.=0+,#>#3/#
surface de la cellule et les mutations affectant la fonction du récepteur, soit dans sa capacité de liaison de
3<(N:F#A10.#6/+A#A/#*/7/*0.=#>#.8/+A6)08,#3,#A04+/3'#@,A#78,-058,A#-)./.01+A#06,+.0E0=,A#*188,A71+6,+.#>#6,A#
mutations entrainant un décalage du cadre de lecture et la génération 6<)+,# 781.=0+,# .81+B)=,# 1)# ># 6,A#
-)./.01+A#6)#*161+#6<0+0.0/.01+#6,#3/#.8/+A*807.01+#/!1).0AA/+.#>#)+,#/!A,+*,#.1./3,#6,#781.=0+,]#la mutation
p.Gln98fs (Conley, 2001) chez un patient décrit dès 1992 par M. Cattaneo (Cattaneo et al., 1992), la mutation
p.Phe240fs (Hollopeter et al., 2001) chez un patient décrit dès 1995 par A. Nurden (Nurden et al., 1995), la
mutation p.Thr126fs (Fontana et al., 2009), et la mutation p.Gly12fs (Dawood et al., 2009)'#(#3<0+C,8A,F#3,A#
mutations faux-senA#7)!30=,A#+,#7,8.)8!,+.#7/A#1)#7,)#3<,D78,AA01+#-,-!8/+/08,#6)#8=*,7.,)8'#O33,A#/EE,*.,+.#
+=/+-10+A#3,A#*/7/*0.=A#6,#30/0A1+#6,#3<(N:#>#*,#8=*,7.,)8#1)#3/#.8/+A6)*.01+#6)#A04+/3#,+#/C/3#6,#*,3)0-ci. Les
mutations p.Arg256Gln et p.Arg265Trp mises en évidence chez le même patient (Cattaneo et al., 2003)
entrainent une absenc,# 6<0+20!0.01+# 6,# AG+.25A,# 6<(\:*# ,+# */A# 6,# A.0-)3/.01+# 6)# 8=*,7.,)8# 7/8# 3<(N:'#
Y=*,--,+.F#3,A#61++=,A#*80A./33148/720B),A#1+.#6</033,)8A#*1+E08-=#3<0-718./+*,#6,#*,..,#/840+0+,#PId#71)8#
3/#30/0A1+#6,A#481)7,-,+.A#721A72/.,A#6,#3<(N:#6/+A#A1+#A0.,#6,#30/0Aon au récepteur P2Y12 (Zhang et al.,
2014a). La mutation homozygote p.Pro258Thr (Remijn et al., 2007) entraine également un syndrome
hémorragique modéré mais la quantification des récepteurs P2Y12 et la signalisation en aval de celui-*0#+<1+.
pas été étudiées. En 2009, une mutation hétérozygote p.Lys174Glu (Daly et al., 2009) a été identifiée chez un
7/.0,+.#/..,0+.#6,#-/3/60,#6,#o033,!8/+6#6,#.G7,#J'#@/#3GA0+,#JaR#A,8/0.#,+#,EE,.#+=*,AA/08,#>#3/#30/0A1+#6,#3<(N:#
,+#A./!030A/+.#3<0+.,8/*.01+#8=*,7.,)8l304/+6'#@/#B)/+.0E0*/.01+#6)#+1-!8,#6,#A0.,A#6,#30/0A1+#/#6</033,)8A#-1+.8=#
une diminution de 50% du nombre de récepteur P2Y12 à la surface des plaquettes du patient. Enfin, en 2014,
une mutation dans le motif DRY (Millar and Newton, 2010) présent sur la deuxième boucle intracellulaire du

58
récepteur (p.Arg122Cys) (Patel et al., 2014) /#=.=#-0A,#,+#=C06,+*,#*2,V#)+#7/.0,+.#=4/3,-,+.#718.,)8#6<)+#
polymorphisme du récepteur à la thrombine PAR1. Ce motif DRY extrêmement conservé dans la famille des
RCPG est indispensable dans le maintien du récepteur et des protéines G qui y sont couplées sous forme
inactive. La mutation décrite par Patel et al emtrainerait 6<)+,#7/8.#)+#6=E/).#6<,D78,AA01+#6)#8=*,7.,)8#30=#>#
une anomalie du trafic intra-*,33)3/08,# ,.# 6</).8,# 7/8.# un défaut d</*.0C/.01+# 6,# 3/# 781.=0+,# 9"i couplée au
récepteur P2Y12.

2.5 Les variants du récepteur P2Y12 identifiés et caractérisés au laboratoire

O+.8,# PQJP# ,.# PQJIF# ,+# /7730B)/+.# )+,# A.8/.=40,# 60/4+1A.0B),# !/A=,# A)8# 3/# 78=A,+*,# 6<)n syndrome
hémorragique associé >#)+#6=E0*0.#781E1+6#6</48=4/.01+s 0+6)0.,A#7/8#3<(N:#>#.1).,A#3,A#*1+*,+.8/.01+A#.,A.=,A#
(2.5, 5, 10, 20 et 100 µM), nous avons mis en évidence trois nouvelles mutations du récepteur P2Y12 dans trois
familles différentes non apparentées. La mutation p.His187Gln .81)C=,#>#3<=./.#21-1VG41.,#*2,V#6,)D#E858,A#
0AA)A#6<)+,#E/-033,#*1+A/+4)0+,#/#E/0.#3<1!?,.#6<)+,#*/8/*.=80A/.01+#*1-735.,#>#3/#E10A#A)8#3,A#73/B),..,A#6,A#
7/.0,+.A#-/0A#/)AA0#6/+A#)+#-1653,#*,33)3/08,#6</A.81*G.1-,#2)-/0+#+<,D780-/+.#7/A#3, récepteur P2Y12 >#3<=./.#
natif. Les deux autres mutations (p.Phe95Ser et p.Tyr259Cys) .81)C=,A#>#3<=./.#2=.=81VG41.,#1+.#=.=#>#*,#?1)8#
uniquement étudiées sur les plaquettes fraiches des patients. (Figure 20)

2.5.1 Mutation p.His187Gln du récepteur P2Y12

En collaboration avec nos collègues italiens (équipe du Pr Marco Cattaneo) et allemands (équipe du Pr Barbara
_0,4,8&F#+1)A#/C1+A#-0A#,+#=C06,+*,#*2,V#6,)D#E858,A#6<18040+,#.)8B),#,.#/77/8.,+/+.#>#)+,#E/-033,#*1+A/+4)0+,#
$3</8!8,#4=+=/3140B),#,A.#78=A,+.=#,+#/++exe 3) une anomalie sévère du récepteur P2Y12. Le propositus a été
étudié dans les laboratoires de Milan et Freiburg alors que son frère, le patient III-1 a été entièrement caractérisé
6/+A#+1.8,#3/!18/.108,'#@<,+A,-!3,#6,#*,..,#=.)6,#/#E/0.#3<1!?,.#6<)+,#publication collaborative en 2015 qui est
présentée en annexe 3. La majorité des techniques utilisées sont ainsi présentées dans la partie « Methods » de
*,.#/8.0*3,'#h1)A#6=./033,81+A#6/+A#3/#A)0.,#6,#*,#*2/70.8,F#3<,+A,-!3,#6,A#61++=,A#*1+*,8+/+.#3,#7/.0ent III-1
ainsi que les expériences de reproduction de la mutation dans des cellules dépourvues de récepteur P2Y 12 à
3<=./.#+/.0E : cellules 13.21.N1.

59
Figure 20 : Structure linéaire (à gauche) et tridimensionnelle du récepteur P2Y12 et localisation des trois
mutations identifiées au laboratoire
U4K+/1+.+'#$9<;$0#!D#1$)($/1("+)+/(1+*'$.-$@V-!$(.&'L)+,-#$.#/$)+%('./$0(!$&1(")+//#D#'1$.#$)+(+/*'$KL.!*%M'#?$
La tyrosine 259 participe à la stabilisation du groupement phosphate. La phénylalanine 95 est proche de la
@L/1&+'#$Q;$,-+$#/1$+'.+/0#'/(")#$W$)4(@1+*'$0K(!D(@*)*%+,-#$.#/$D&1("*)+1#/$(@1+C/$.#/$1K+#'*0L!+.+'#/?

2.5.1.1 Etude des plaquettes du patient III-1

Le patient III-JF# H4=# 6,# Ia# /+A#318A# 6,# A1+# ,D7318/.01+# >#3<OgT# (3A/*,#8/7718.e une histoire hémorragique
modérée associant épistaxis récurrenteA# 6/+A# 3<,+E/+*,F# 40+40C188/40,A# ,.# A/04+,-,+.A# ,D*,AA0EA# /785A#
,D.8/*.01+#6,+./08,'# 3#/#*,7,+6/+.#A)!0#)+,#*08*1+*0A01+#6/+A#3<,+E/+*,#A/+A#*1-730*/.01+#7,80-opératoire. La
numération plaquettaire (224 000 plt/µL, VPM= 10.3 E@&F#3<,D/-,+#6)#E81..0A#A/+4)0+#,.#3,#!03/+#6,#*1/4)3/.01+#
+<1+.#-0A#,+#=C06,+*,#/)*)+,#/+1-/30,#7/8.0*)3058,'#@,#.,-7A#6<1**3)A01+#73/B),../08,#$:g(-100) était allongé
uniquement avec la cartouche ADP suggérant une ano-/30,# 6,# 3<2=-1A./A,# 780-/08,'# @,A# /48=4/.01+A#
plaquettaires réalisées en PRPc et en plaquettes lavées A1+.#6</-730.)6,#E18.,-,+.#60-0+)=,#/785A#A.0-)3/.01+#
7/8#3<(N:#B),33,#B),#A10.#3/#*1+*,+.8/.01+#6</41+0A.,#).030A=,'#()*)+,#/).8,#/+1-/30,#6</48=4/.01+ +</#7)#W.8,#
mis en évidence ni en PRPc ni en plaquettes lavées avec les agonistes et les concentrations ici utilisées (Figure
21).

60
@<=.)6,#6,#3/#A04+/30A/.01+#,+#/C/3#6)#8=*,7.,)8#A<,A.#-1+.8=,#=4/3,-,+.#.85A#7,8.)8!=,'#O+#,EE,.F#3,#.,A.#;(T:#
a mis en éC06,+*,#)+,#/!A,+*,#.1./3,#6<0+20!0.01+#6,#3/#721A7218G3/.01+#6,#3/#781.=0+,#;(T:#/785A#A.0-)3/.01+#
7/8#3<(N:#*1--,#3,#-1+.8,#3<0+60*,#6,#8=/*.0C0.=#73/B),../08,#1!.,+) : 1% (valeurs normales : 69% - 100%).
N,#-W-,F#3,#61A/4,#6,#3<(\:*#0+.8/*,33)3/08,#-1+.8,#.85A#*3/08,-,+.#)+,#/!A,+*,#6<0+20!0.01+#6,#AG+.25A,#
6<(\:*# /785A# A.0-)3/.01+# 6,A# 73/B),..,A# 6)# 7/.0,+.# $78=/3/!3,-,+.# ,D71A=,A# ># 3/# :9O 1&# 7/8# 3<(N:# ># 3/#
concentration de 100 µM (Figure 22).

@<,+A,-!3,#6,#*,A#8=A)3./.A#+1)A#/#*1+6)0.A#>#8,*2,8*2,8#)+,#-utation du gène codant pour le récepteur P2Y12.

Le séquençage du gène P2RY12 +1)A#/#7,8-0A#6,#-,..8,#,+#=C06,+*,#3/#78=A,+*,#6<)+,#-)./.01+#E/)D-sens
21-1VG41.,#*'`RaML(#*1+6)0A/+.#>#3/#A)!A.0.).01+#6,#3<20A.060+,#J`a#7/8#)+,#43)./-0+,'#@/#-W-,#-)./.01+#
ho-1VG41.,# /# =.=# 8,.81)C=,# *2,V# 3,# 78171A0.)A'# @<20A.060+,# J`a# ,A.# 31*/30A=,# ?)A.,# /)-dessus du domaine
transmembranaire n°5 (Figure 20) et les études cristallographiques récentes ont montré son importance pour
la liaison des ligands tels que le 2MeSADP dans le site actif du récepteur. En particulier, la modélisation du
8=*,7.,)8#-).=#78171A,#B),#3/#A)!A.0.).01+#6,#3<20A.060+,#J`a#7/8#)+,#43)./-0+,#7,8.)8!,#3/#30/0A1+#6)#304/+6#
au site actif en abolissant les liaisons hydrogènes nécessaires à la stabilisation 6,# 3<0+.,8/*.01+# 6)# *1)73,#
récepteur/ligand.

Figure 21 : Agrégations plaquettaires réalisées chez le patient III-1 et chez un témoin du jour
A, agrégations plaquettaires !&()+/&#/$#'$H5H@$(0!M/$/1+D-)(1+*'$0(!$)4 NH$XYA$9Z$#1$9ZZ[JT$@K#\$)#$0(1+#'1$
III-1 (courbes rouges) et un témoin du jour (courbes bleues). B, agrégations plaquettaires réalisées en
0)(,-#11#/$)(8&#/$(0!M/$/1+D-)(1+*'$0(!$)4 NH$XY$#1$9ZZ[JT$@K#\$)#$0(1+#nt III-1 (courbes rouges) et un témoin
.-$]*-!$X@*-!"#/$")#-#/T?$PA$0!&/#'1(1+*'$.#/$(D0)+1-.#/$D(^+D()#/$.4(%!&%(1+*'/$*"1#'-#/$0*-!$)#/$.+CC&!#'1/$
agonistes testés au laboratoire sur les plaquettes du patient III-9$#1$/-!$)#/$0)(,-#11#/$.4-'$1&D*+'$.-$]*ur.

61
Nous avons par la suite effectué une quantification du récepteur à la surface des plaquettes du patient ainsi
B)<)+,# =.)6,# 6,# 3</EE0+0.=# 6,# 60EE=8,+.A# 304/+6A# 71)8# 3,# 8=*,7.,)8# -).='# :1)8# *,3/# +1)A# /C1+A# 8=/30A=# 6,A#
expériences de saturation et de co-7=.0.01+# ).030A/+.# )+# 6=80C=# .80.0=# 6<)+# /+./41+0A.,# A=3,*.0E# 6)# 8=*,7.,)8#
P2Y12 : le 3[H]PSB-0413. Les expériences de saturation effectuées en utilisant des concentrations croissantes
6,# 304/+6# 8/601-/8B)=# ,+# 78=A,+*,# 6<)+,# *1+*,+.8/.01+# *1+A./+.,# 6<(N:# +<1+.# 7/A# -1+.8=# 6,# 6=E0*0.#
6<,D78,AA01+#6)#8=*,pteur (540 sites par plaquette chez le témoin du jour, 693 sites par plaquette chez le patient
III-1) (valeurs normales : 425 +/- 50 sites par plaquettes (Ohlmann et al., 2013)'#K,7,+6/+.F#3</)4-,+./.01+#6,#
la constante de dissociation (Kd) mise en évidence chez le patient (19 nM versus 5,5 nM chez le témoin du
?1)8&#A)4458,#)+,#60-0+).01+#6</EE0+0.=#6)#8=*,7.,)r pour le radioligand (Figure 23).

Figure 22 : N*/(%#$.#$)4 JH@$#'$!(.+*-immunologie chez les plaquettes témoins (bleues) et les plaquettes du
patient III-1 (rouge)
O'$ 0!&/#'@#$ .#$ 0)(+'$1L!*.#$ XH_TA$ )#/$ 0)(,-#11#/$ (-$!#0*/$ D*'1!#'1$ -'$ '+8#(-$"(/()$ .4 JH@$ 1!M/$ "(/?$ En
0!&/#'@#$.4+'K+"+1#-!$.#$)4(@1+8(tion plaquettaire (PGE1,5x10-4M), on remarque une augmentation importante
.#$)4 JH@$.('/$)#/$0)(,-#11#/$1&D*+'/$#1$)#/$0)(,-#11#/$.-$0(1+#'1$777-1. Après stimulation des plaquettes par
)4 NHX100 [JTA$)($,-('1+1&$.4 JH@$/4#CC*'.!#$.('/$)#/$0)(,-#11#/$1&D*+'$D(+/$!#/1#$/1(")#$.('/$)#/$0)(,-#11#/$
.-$0(1+#'1?$O'$0!&/#'@#$.4-'$+'K+"iteur du récepteur P2Y12 (AR-C69931MX, 2.5x10-4M) et après stimulation
0(!$)4 NHA$*'$!#1!*-8#$.('/$)#/$0)(,-#11#/$1&D*+'$#1$)#/$0)(,-#11#/$.-$0(1+#'1A$-'#$@*'@#'1!(1+*'$.4 JH@$
équivalente à la condition PGE1 seule. Pour chaque @*'.+1+*'A$)#$.*/(%#$.#$)4 JHc en radio-immunologie a
&1&$!&()+/&$W$)4(+.#$.-$`+1$@*DD#!@+() : (cAMP [125I] RIA KIT, Institute of isotope, Budapest, Hongrie) selon
les recommandations du fabriquant.

62
Figure 23: Expérience de saturation effectuée sur des plaquettes témoin (à gauche) et sur des plaquettes du
patient III-1 (à droite)
U#/$#^0&!+#'@#/$*'1$&1&$!&()+/&#/$#'$0!&/#'@#$.4-'#$@*'@#'1!(1+*'$C+^#$.4 NH$X9$DJT$#1$.#$@*'@#'1!(1+*'/$
croissantes de [3H]PSB-0413 (0,4 nM à 80 nM). La constante de dissociat+*'$Xa.T$0#!D#1$.4&8()-#!$)4(CC+'+1&$
du récepteur pour le radio ligand. La liaison maximale (Bmax) permet de quantifier le nombre de sites de
liaison du [3H]PSB-0413 à la surface des plaquettes.

Les expériences de compétition entre le radioligand et des concentrations croissantes de ligands froids (ADP
ou de 2-\,T(N:&# 1+.# 7,8-0A# 6<=C/3),8# 3</EE0+0.=# 6,A# 304/+6A# 71)8# *,# 8=*,7.,)8'# @</)4-,+./.01+# 6,A#
*1,EE0*0,+.A#6<0+20!0.01+#$k0&#6,#3<(N:#$k0témoin= 34,1 µM, Kipatient= 174,7 µM) et du 2-MeSADP (Kitémoin=
23,6 nM, Kipatient=186 nM) pour le récepteur P2Y12 mesurés sur les plaquettes du patient par rapport aux
73/B),..,A#.=-10+#*1+E08-,#)+,#60-0+).01+#6</EE0+0.=#6,A#304/+ds pour le récepteur (Figure 24).

Les données obtenues sur les plaquettes du patient au cours des expériences de saturation et compétition
-1+.8,+.#61+*#B),#3/#-)./.01+#*'`RaML(#,A.#8,A71+A/!3,#6<)+,#60-0+).01+#6</EE0+0.=#6)#8=*,7.,)8#71)8#3<(N:#
,.#3,#P\,T(N:#A/+A#6=E0*0.#6<,D78,AA01+#6)#8=*,7.,)8#A)8#3/#-,-!8/+,#6,A#73/B),..,A'#K,A#8=A)3./.A#Aemblent
61+*#*1+E08-,8#3,A#61++=,A#*80A./33148/720B),A#B)/+.#>#3<0-730*/.01+#6,#3<20A.060+,#J`a#6/+A#3/#A./!030A/.01+#6,#
3<0+.,8/*.01+#6,A#304/+6A#6/+A#3,#A0.,#6,#30/0A1+#6)#8=*,7.,)8#:Pc12.

63
Figure 24 : Expérience de compétition entre une concentration fixe de [ 3H]PSB-0413 (20 nM) et des
@*'@#'1!(1+*'/$@!*+//('1#/$.4 NH$XW$%(-@K#T$*-$.#$BJ#3 NH$XW$.!*+1#T$
U#/$@*#CC+@+#'1/$.4+'K+"+1+*' D#/-!&/$!#C)M1#'1$)4(CC+'+1&$.-$!&@#01#-!$0*-!$@K(,-#$)+%('.?$H*-!$)4ADP et le
BJ#3 NHA$*'$'*1#$-'#$.+D+'-1+*'$.4(CC+'+1&$.-$!&@#01#-!$0*-!$)#$)+%('.$&1-.+&$)*!/$.#/$#^0&!+#'@#/$!&()+/&#/$
sur les plaquettes du patient (en bas) en comparaison des plaquettes témoin (en haut).

64
2.5.1.2 Reproduction de la mutation p.His187Gln dans un modèle cellulaire adapté : cellules 1321N1

Afin de montrer que la mutation p.His187Gln du récepteur P2Y12 est bien responsable de la diminution de
3</EE0+0.=#6)#8=*,7.,)8#71)8#A,A#304/+6A#,.#B),#*,33,-ci abolit la transduction du signal en aval du récepteur,
+1)A#/C1+A#8,7816)0.#3/#-)./.01+#6/+A#6,A#*,33)3,A#JePJhJ#0AA),A#6</A.81*G.1-,#2)-/0+#,.#6=71)8C),A#6,#
récepteur P2Y12 >#3<=./.#+/.0E'#h1)A#/C1+A#/0+A0#4=+=8=#6,)D#*31+,A#6,#*,33)3,A : un clone exprimant le récepteur
sauvage (cellules WTD12) et un clone exprimant le récepteur muté (cellules CATC3) (Figure 25). Le protocole
de transfection est détaillé dans l</++,D,#R de ce document.

Figure 25 : J&1K*.#$.#$1!('/C#@1+*'$0#!D#11('1$)4*"1#'1+*'$.#$@#))-)#/$9RB9b9$(L('1$+'@orporé le plasmide

pcDNA3 portant le cDNA du récepteur P2Y12 sauvage (cellules WTD12) ou muté (cellules CATC3)
U($0!&/#'@#$.#$)4 5b$D#//(%#!$($&1&$8&!+C+&#$0(!$5_-HP5$#'$-1+)+/('1$.#/$(D*!@#/$/0&@+C+,-#/$.#$)4 5bD$.-$
récepteur P2Y12 (NES1 et NES2) présentées en annexe 4.

O+# 3</!A,+*,# 6</+.0*187A# -1+1*31+/)D# /+.0-P2Y12 60A71+0!3,A# ,.# C/306=AF# 3<,D78,AA01+# 6)# 8=*,7.,)8# ># 3/#
membrane des cellules 1321N1 ne peut être étudiée que grâce à des expériences de saturation décrites dans
3</++,D,#P#6,#*,#61*)-,+.'#@,A#.,A.A#8=/30A=A#-1+.8,+.#B),#3,#8=*,7.,)8#6<0+.=8W.#$A/)C/4,#1)#-).=&#,A.#!0,+#
78=A,+.#>#3/#A)8E/*,#6,A#*,33)3,A#.8/+AE,*.=,A'#@/#B)/+.0E0*/.01+#7,8-,.#6,#78=*0A,8#B),#3,A#+0C,/)D#6<,D78,AA01+#
6)#8=*,7.,)8#A1+.#6,#3<1868,#6,#`IQQ#A0tes pour les récepteurs sauvages et 3400 sites pour les récepteurs mutés
(Figure 26&'#K,7,+6/+.#/)*)+,#60EE=8,+*,#6</EE0+0.=#6)#8/601304/+6#71)8#3,A#6,)D#.G7,A#6,#8=*,7.,)8A#=.)60=A#
+</#=.=#-0A,#,+#=C06,+*,#/)#*1)8A#6,#*,..,#,D7=80-,+./.01+'#:1)8#-=-108,F# lors des études plaquettaires la
60EE=8,+*,#6</EE0+0.=#6)#8/601304/+6#71)8#3,#8=*,7.,)8#A/)C/4,#=./0.#,+C081+#R#E10A#A)7=80,)8,#>#3</EE0+0.=#6)#

65
radioligand pour le récepteur muté. Par ailleurs, le Kd de ce radioligand pour le récepteur est généralement
comprise entre 3 et 10 nM en fonction du système utilisé (Ohlmann et al., 2013).

Figure 26 : Expérience de saturation effectuée sur des cellules 1321N1 transfectées avec le récepteur P2Y 12
sauvage (à gauche) et sur des cellules 1321N1 transfectées avec le récepteur muté (à droite)
Les expériences ont été réalisées en 0!&/#'@#$.4-'#$@*'@#'1!(1+*'$C+^#$.4 NH$X9$DJT$#1$.#$@*'@#'1!(1+*'/$
croissantes de [3H]PSB-0413 (0,4 nM à 80 nM). Ces tests montrent que les cellules transfectées avec le
récepteur sauvage (WTD12) ou avec le récepteur muté (CATC3) expriment bien le récepte-!$.4+'1&!c1$W$)($
membrane.

Afin de confirmer les résultats obtenus sur les plaquettes des patients et montrer que la présence de la mutation
c.847T>A ,+.8/0+,#!0,+#)+,#60-0+).01+#6</EE0+0.=#6,A#304/+6A#$(N:#,.#P\,T(N:&#71)8#3,#8=*,7.,)8F#+1)A#
avons réalisé des expériences de compétition. Les résultats obtenus sur trois expérimentations différentes
confirment les données obtenues sur les plaquettes fraiches du patient III-1. En effet, on note une diminution
6</EE0+0.=#-16=8=,#6,#3<(N:#71)8#3,#8=*,7.,)8#*1--,#3,#-1+.8,#3</)4-,+./.01+#6)#k0#1!.,+)#A)8#3,A#*,33)3,A#
transfectées avec le récepteur muté (Ki= 6,3µM) en comparaison du Ki obtenu sur les cellules transfectées
avec le récepteur sauvage (Ki= 2,3 µM). Cette différence est bien plus marquée pour le 2MeS(N:#7)0AB)<,3le
est de 10000 fois. (Figure 27&'#@</EE0+0.=#6)#P\,T(N:#71)8#3,#8=*,7.,)8#-).=#A,-!3,#61+*#!0,+#0+E=80,)8,#>#
son affinité pour le récepteur sauvage. Les raisons précises des différences observées entre les plaquettes et les
cellules transfectées ne sont cependant pas tout à fait comprises et peuvent être liées à des différences
6<,+C081++,-,+.#-,-!8/+/08,#,.#6,#781.=0+,A#/AA1*0=,A'#

66
Figure 27 : Expérience de compétition entre une concentration fixe de [ 3H]PSB-0413 (20 nM) et des
@*'@#'1!(1+*'/$@!*+//('1#/$.4 NH$XW$%(-@K#T$*-$.#$BJ#3 NH$XW$.!*+1#T$XbdRT$
U#/$@*#CC+@+#'1/$.4+'K+"+1+*' D#/-!&/$!#C)M1#'1$)4(CC+'+1&$.-$!&@#01#-!$0*-!$@K(,-#$)+%('.?$H*-!$)4 NH$#1$)#$
BJ#3 NHA$*'$'*1#$-'#$.+D+'-1+*'$.4(CC+'+1&$.-$!&@#01#-!$0*-!$)#$)+%('.$&1-.+&$)*!/$.#/$#^0&!+#'@#/$!&()+/&#/$
sur les cellules 1321N1 transfectées avec le récepteur muté (Cellules CATC3, en bas) en comparaison des
cellules 1321N1 transfectées avec le récepteur sauvage (Cellules WTD12 en haut).

:1)8#*1-73=.,8#3,A#0+C,A.04/.01+AF#+1)A#/C1+A#A1)2/0.=#C=80E0,8#3<,EE,.#6,#3/#-)./.01+#A)8#3/#.8/+A6)*.01+#6)#
signal en aval du récepteur'#h1)A#/C1+A#61+*#8=/30A=#)+,#=.)6,#6,#3<0+20!0.01+#6,#3/#AG+.25A,#6<(\:*#6/+A#3,A#
*,33)3,A# .8/+AE,*.=,A# /785A# /*.0C/.01+# 6,# 3<adénylate cyclase par la forskoline puis inhibition de celle-ci en
A.0-)3/+.#3,A#*,33)3,A#7/8#3<(N:#,+#78=A,+*,#1)#,+#/!A,+*,#6<)+#/+./41+0A.,#A=3,*.0E#6)#8=*,7.,)8#:Pc12 : 3<(Y-
C69931MX.

Les résultats présentés dans la figure 28 *1+E08-,+.#3</!A,+*,#6,#.8/+A6)*.01+#6)#A04+/3#,+#/C/3#6)#8=*,7.,)8#

muté aprèA#/*.01+#6,#3<(N:'#O+#,EE,.F#3<0+20!0.01+#6,#AG+.25A,#6<(\:*#1!A,8C=,#A)8#3,A#*,33)3,A#,D780-/+.#3,#
8=*,7.,)8#A/)C/4,# ,.#A1+#!31*/4,# 7/8#3</+./41+0A.,# A=3,*.0E# +,# A1+.# 7/A#8,.81)C=A# A)8# 3,A# *,33)les portant le
récepteur muté.

67
Figure 28 : e-('1+C+@(1+*'$.#$)4 JH@$#'$!(.+*+DD-'*)*%+#$/-!$.#/$@#))-)#/$9RB9b9$f_N9B$1!('/C#@1&#/$(8#@$
le récepteur P2Y12 sauvage (noir) et sur des cellules 1321N1 CATC3 transfectées avec le récepteur P2Y12
muté (blanc)
En présence de forskoline, on rema!,-#$-'#$(-%D#'1(1+*'$.#$)4 JH@$.('/$)#/$.#-^$1L0#/$.#$@#))-)#/?$ 0!M/$
/1+D-)(1+*'$.#/$@#))-)#/$0(!$)4 NHA$)($,-('1+1&$.4 JH@$/4#CC*'.!#$-'+,-#D#'1$.('/$)#/$@#))-)#/$1!('/C#@1&#/$
(8#@$ )#$ !&@#01#-!$ /(-8(%#?$ O'$ 0!&/#'@#$ .4-'$ +'K+"+1#-!$ .-$ !&@#01#-!$ HBI 12 (AR-C69931MX) et après
/1+D-)(1+*'$0(!$)4 NHA$*'$!#1!*-8#$/-!$)#/$.#-^$1L0#/$@#))-)(+!#/$-'#$@*'@#'1!(1+*'$.4 JH@$&,-+8()#'1#$W$)($
@*'.+1+*'$C*!/`*)+'#$/#-)#?$H*-!$@K(,-#$@*'.+1+*'A$)#$.*/(%#$.#$)4 JH@$#'$!(.+*+DD-'*)*%+#$($&1&$!&()+/&$W$
)4(+.#$ .-$ `+1$ commercial : cAMP [ 125I] RIA KIT (Institute of isotope, Budapest, Hongrie) selon les
recommandations du fabricant.

2.5.1.3 Etude de la mutation p.His187Gln : conclusion

h1)A#/C1+A#61+*#-0A#,+#=C06,+*,#3/#78=A,+*,#6<)+,#-)./.01+#21-1VG41.,#6)#8=*,7.,)8#:Pc12 qui entraine

chez les patients un syndrome hémorragique modéré caractérisé de manière biologique par une diminution très
0-718./+.,# 6,# 3</-730.)6,# 6,A# /48=4/.01+A# 0+6)0.,A# 7/8# 3<(N:# ># .1).,A# 3,A# *1+*,+.8/.01+A# .,A.=,A'# K,..,#
mutation diminue fortement les capacités de liaison des ligands testés (ADP et 2MeSADP surtout) au récepteur
muté et entraine une absence de transduction du signal en aval du récepteur après stimulation de celui-ci par
son ligand naturel ]#3<(N:'#K,A#8=A)3./.A#1!.,+)A#>#3/#E10A#A)8#3,A#73/Buettes du patient III-1 et sur des cellules
JePJhJ#.8/+AE,*.=,A#/C,*#3,#8=*,7.,)8#-).=#A)4458,+.#=4/3,-,+.#)+#8f3,#6,#3<20A.060+,#J`a#6/+A#3,#*2/+4,-,+.#
6,#*1+E18-/.01+#+=*,AA/08,#>#3</*.0C/.01+#6,#3/#781.=0+,#90#/AA1*0=,#/)#8=*,7.,)8'#@,A#61++=,A#1!.,+),A au
*1)8A# 6,# 3/# 8,7816)*.01+# 6,# 3/# -)./.01+# 6/+A# 3,A# *,33)3,A# JePJhJ# E1+.# 3<1!?,.# 6<)+# -/+)A*80.# ,+# *1)8A# 6,#
rédaction.

68
2.5.2 Mutation p.Tyr259Cys du récepteur P2Y12

2.5.2.1 Etude plaquettaire chez le propositus : patient CJP

h1)A# /C1+A# =.)60=# /)# 3/!18/.108,# 3,# */A# 6<)+ patient de 37 ans ayant présenté un syndrome hémorragique
-16=8=#6</77/80.01+#8=*,+.,#*/8/*.=80A=#7/8#3/#A)8C,+),#8=*060C/+.,#,.#A71+./+=e 6<)+#2=-/.1-,#6)#481A#18.,03'#
K,# 78171A0.)A# $Kp:&# 8/7718.,# =4/3,-,+.# /)# *1)8A# 6,# A/# C0,# 3</77/80.01+# E8=B),+.,# 6<=70A./D0A# B)0# +<1+.#
*,7,+6/+.# ?/-/0A# -1.0C=# 6,# 780A,# ,+# *2/84,# 7/8.0*)3058,'# @18A# 6,# 3<,D7318/.01+# !013140B),F# 3/# +)-=8/.01+#
plaquettaire (358 000 plt/µL, VPM= 8.7 fL&#,.#3<1!A,8C/.01+#6)#E81..0A#A/+4)0+#*1318=#/)#\99#=./0,+.#A/+A#
anomalie particulière. Le bilan de coagulation ,.#3<,D7318/.01+#6)#E/*.,)8#Willebrand étaient également dans
3,A# C/3,)8A# +18-/3,A'# @,# .,-7A# 6<1**3)A01+# 73/B),../08,# 8=/30A=# A)8# :g(-100 était sans anomalie après
utilisation des cartouches ADP et adrénaline. Le temps de saignement réalisé avec la technique Ivy était
cependant allongé à 15 minutes (valeur normale inférieure à 8 min).

Les agrégations plaquettaires réalisées en PRPc chez ce patient mettent en évidence une diminution importante
6,#3</-730.)6,#6</48=4/.01+#/C,*#78=A,+*,#6,#6=A/48=4/.01+#,+#*/A#6,#A.0-)3/.01+#6,A#73/B),..,A#7/8#3<(N:#
B),33,#B),#A10.#3/#*1+*,+.8/.01+#6</41+0A.,#).030A=,'#@,A#/48=4/.01+A#0+6)0.,A#7/8#3,A#/).8,A#0+6)*.,)8A#=./0,+.#
sans anomalie. Les agrégations réalisées en plaquettes lavées montrent également une diminution très
0-718./+.,#6,#3</-730.)6,#6</48=4/.01+#*2,V#3,#7/.0,+.#/785A#A.0-)3/.01+#7/8#3<(N:#/)D#*1+*,+.8/.01+A#6,#IF#
10 et 20 µM (Figure 29).

O+#3</!A,+*,#6,#73/B),..,A#E8/0*2,A#,+#B)/+.0.=#A)EE0A/+.,#71)8#8=/30A,8#)+,#=.)6,#6,#3<(\:*F#3,A#8=A)3.ats des
.,A.A#6</48=4/.01+#1!.,+)A#*2,V#*,#7/.0,+.#1+.#-1.0C=#3,#A=B),+q/4,#6)#45+,#P2RY12. Le séquençage du gène
+1)A#/#7,8-0A#6,#-,..8,#,+#=C06,+*,#3/#78=A,+*,#6<)+,#-)./.01+#2=.=81VG41.,#*'JQad(L9#/*.),33,-,+.#+1+#
décrite dans les bases de données internationales telles que ENSEMBL ou PUBMED. Cette mutation faux-
sens entraine la substitution de la tyrosine 259 par une cystéine (p.Tyr259Cys) (Figure 20&'#N</785A#3,A#=.)6,A#
cristallographiques effectuées récemment par Zhang et al (Zhang et al., 2014a), cette tyrosine serait un des
8=A06)A#0+60A7,+A/!3,A#>#3/#A./!030A/.01+#6,#3/#30/0A1+#6,A#481)7,-,+.A#721A72/.,A#/)#*1)8A#6,#3</*.0C/.01+#6)#
récepteur P2Y12 7/8#A,A#/41+0A.,A#.,3A#B),#3<(N:#,.#3,#P\,T(N:'#h1)A#/C1+A#61+*#8=/30A=#318A#6<)+,#deuxième
consultation du patient, une quantification du récepteur P2Y12 ># 3/# A)8E/*,# 6,A# 73/B),..,A# ># 3</06,# 6,A#
expériences de saturation détaillées en annexe 2. Les données obtenues mettent en évidence une diminution
6<,+C081+# IQ^# 6)# +1-!8,# 6,# 8=*,7.,)8A à la surface des plaquettes du patient CJP (282 récepteurs par
plaquette) en comparaison des plaquettes témoin (573 récepteurs par plaquette). (Figure 30)

K1--,#3,#-1+.8,+.#3,A#k6#1!.,+)AF#/)*)+,#60EE=8,+*,#6</EE0+0.=#6)#8/601304/+6#71)8#3,#8=*,7.,)8#+</#pu être
mise en évidence entre les plaquettes du patient et les plaquettes témoin. Ces données suggèrent que la mutation
7'MG8PIiKGA# ,+.8/0+,# A10.# )+,# /!A,+*,# 6<,D78,AA01+# 6)# 8=*,7.,)8# -).=# ># 3/# -,-!8/+,# *,33)3/08,F# A10.# )+,#
incapacité du récepteur muté à lier le [3H]PSB-0413 utilisé dans cette expérience. Dans les deux cas, il semble

69
3140B),# B)<)+,# -)./.01+# 2=.=81VG41.,# ,+.8/0+,# )+,# ,D78,AA01+# 8=A06),33,# 6)# 8=*,7.,)8# 6<,+C081+# IQ^# ,+#
comparaison de plaquettes témoin

Figure 29 : Agrégations plaquettaires réalisées chez le patient CJP et chez un témoin du jour
A g$(%!&%(1+*'/$0)(,-#11(+!#/$!&()+/&#/$#'$H5H@$(0!M/$/1+D-)(1+*'$0(!$)4 NH$XYA$9ZA$BZ$#1$9ZZ µM) chez le
patient CJP (courbes rouges) et un témoin du jour (courbes bleues). B : agrégations plaquettaires réalisées
#'$0)(,-#11#/$)(8&#/$(0!M/$/1+D-)(1+*'$0(!$)4 NH$XYA$9Z$#1$BZ$[JT$@K#\$)#$0(1+#'1$PhH$X@*-!"#/$!*-%#/T$#1$-'$
témoin du jour (courbes bleues). C g$ (D0)+1-.#/$ D(^+D()#/$ .4(%!&%(1+*'$ *"1#'-#/$ (0!M/$ /1+D-)(1+*'$ .#/$
plaq-#11#/$.-$0(1+#'1$PhH$*-$.-$1&D*+'$.-$]*-!$0(!$)4 NHA$)#$@*))(%M'#A$)4(@+.#$(!(@K+.*'+,-#A$)($!+/1*@&1+'#$
et la thrombine.

O+# 78=A,+*,# 6<)+,# 717ulation hétérogène de récepteurs $IQ^# -).=F# IQ^# A/)C/4,&F# 1)# ,+# 3</!A,+*,# 6,#
récepteur muté exprimé à la membrane, les tests de déplacement effectués lors de la caractérisation de la
mutation p.His187Gln A1+.# 73)A# 60EE0*03,A# ># 0+.,878=.,8'# O+# ,EE,.F# A0# +1)A# A1--,A# ,+# 78=A,+*,# 6<)+# 6=E0*0.#
6<,D78,AA01+F#3,A#,D7=80,+*,A#6,#6=73/*,-,+.#=C/3),8/0,+.#)+0B),-,+.#3,#8=*,7.,)8#A/)C/4,#0AA)#6,#3</3353,#
+18-/3'#T0#+1)A#A1--,A#,+#78=A,+*,#6<)+,#717)3/.01+#2=.=8145+,F#3,#r3H]PSB-0413 se lierait avec une affinité
différente aux deux populations de récepteurs. Dans ce dernier cas, un coefficient de Hill (nH, classiquement
égal à J#6/+A#3,A#,D7=80,+*,A#6,#30/0A1+#,+#78=A,+*,#6<)+,#A,)3,#717)3/.01+#6,#A0.,A#30/+.#3,#304/+6F#C108#/++,D,#
P&#781*2,#6,#6,)D#*1+E08-,8/0.#3<2G71.25A,#6<)+,#61)!3,#717)3/.01+#6,#8=*,7.,)8A'

70
Figure 30 : Expérience de saturation effectuée sur des plaquettes témoin (à gauche) et sur des plaquettes de
CJP (à droite)
U#/$#^0&!+#'@#/$*'1$&1&$!&()+/&#/$#'$0!&/#'@#$.4-'#$@*'@#'1!(1+*'$C+^#$.4 NH$X9$DJT$#1$.# concentrations
croissantes de [3H]PSB-0413 (0,4 nM à <Z$ 'JT?$ i'$ '*1#$ -'#$ .+D+'-1+*'$ .4#'8+!*'$ YZj$ .-$ '*D"!#$ .#$
récepteurs à la surface des plaquettes du patient en comparaison du témoin du jour.

Nous avons par la suite poursuivi la caractérisation des plaquettes du patient en étudiant la signalisation en
aC/3#6)#8=*,7.,)8'#h1)A#/C1+A#8=/30A=#6,A#.,A.A#;(T:#/0+A0#B)<)+,#=.)6,#6,#3/#AG+.25A,#6<(\:*#A,31+#3,A#
protocoles décrits dans le chapitre précédent. Le test VASP réalisé à deux reprises ne montre aucune anomalie
7/8.0*)3058,'#O+#,EE,.F#3<0+60*,#6,#8=/*.0v0.=#73/B),../08,#-,A)8=#+<,A. pas perturbé et est supérieur à 80%. Ce
8=A)3./.# A)4458,# 61+*# B),# 3/# -)./.01+# 78=A,+.,# ># 3<=./.# 2=.=81VG41.,# ,A.# 0+*/7/!3,# 6,# 7,8.)8!,8#
significativement la modification de la phosphorylation de la protéine VASP après stimulation des plaquettes
7/8#3<(N:'#(E0+#6,#-,..8,#,+#=C06,+*,#)+,#/+1-/30,#-16=8=,#6,#.8/+A6)*.01+#6)#A04+/3F#+1)A#/C1+A#7/8#/033,)8A#
8=/30A=#)+,#B)/+.0E0*/.01+#6,#3<(\:*#/785A#A.0-)3/.01+#6,A#73/B),..,A#7/8#3<(N:#>#60EE=8,+.,A#*1+*,+.8/.01+A#
(1, 2.5, 5 et 20 µM). Les résultats obtenus présentés dans la figure 31 mettent en évidence une diminution
-16=8=,#6,#3<0+20!0.01+#6,#3</6=+G3/.,#*G*3/A,#A)8#3,A#73/B),..,A#6)#7/.0,+.'#O+#,EE,.F#/785A#A.0-)3/.01+#6,A#
73/B),..,A#7/8#3<(N:#/)D#*1+*,+.8/.01+A#6,#JF#P'I#,.#I µMF#1+#+1.,#)+,#8=6)*.01+#6,#3<0+20!0.01+#6,#AG+.25A,#
6,#3<(\:*#6<,+C081+#eQ^'#K,..,#60EE=8,+*,#/C,*#3,A#73/B),..,A#.=-10+#A,-!3,#73)A#-16=8=,#/785A#A.0-)3/.01+#
6,A#73/B),..,A#7/8#6,#3<(N:#>#73)A#E18.,#*1+*,+.8/.01+#$PQ s\&'#N/+A#.1)A#3,A#*/AF#3</?1).#6<)+ antagoniste du
récepteur P2Y12 (AR-KdiieJ\b&#8,A./)8,#3,#./)D#!/A/3#=3,C=#6<(\:*#1!.,+),#,+#A.0-)3/+.#A/#7816)*.01+#7/8#
la PGE1 seule (Figure 31).

@<,+A,-!3,# 6,# *,A# 8=A)3./.A# A)4458,# B),# 3/# -)./.01+# 7'MG8PIiKGA 78=A,+.,# ># 3<=./.# 2=.=81VG41.,# 30-0.,# 3/#
transduction du signal en aval du récepteur P2Y12 de manière très modérée. Dans ce contexte, une stimulation
intense du récepteur P2Y12 /C,*#6,#E18.,A#*1+*,+.8/.01+A#6<(N:#+,#7,8-,.#7/A#6,#-,..8,#,+#=C06,+*,#)+,#
anomalie de signalisation en aval du récepteur avec les méthodes classiquement utilisées.

71
Figure 31 : Q-('1+C+@(1+*'$.#$)4 JH@$.('/$)#/$0)(,-#11#/$.-$0(1+#'1$X#'$!*-%#T$#1$.('/$)#s plaquettes témoins
(en bleu)
Les résultats sont exprimés /*-/$)($C*!D#$ .4-'$ !(1+* : AMPc dans les plaquettes stimulées(en présence de
PGE1 + ADP +/- AR-C69931MX)/ AMPc dans les plaquettes inhibées (PGE1 uniquement).

2.5.2.2 Reproduction de la mutation p.Tyr259Cys dans un modèle cellulaire adapté : cellules 1321N1

Nous avons par la suite tenté de reproduire la mutation dans le modèle cellulaire 1321N1 décrit dans le chapitre
78=*=6,+.'#@/#.,*2+0B),#6,#.8/+AE,*.01+#+1)A#/#7,8-0A#6<1!.,+08#6,A#*31+,A#.8/+AE,*.=A#1Z#3<(Yh-#6)#8=*,7.,)8#
P2Y12 est exprimé de manière stab3,'#K,7,+6/+.F#*1--,#+1)A#71)C01+A#+1)A#G#/..,+68,#6</785A#3,A#,D7=80,+*,A#
de saturation réalisées sur les plaquettes du patient, les techniques de saturation utilisant le [ 3H]PSB-0413 ne
+1)A#1+.#7/A#7,8-0A#>#*,#?1)8#6,#B)/+.0E0,8#78=*0A=-,+.#3<,D78,AA01+ du récepteur muté à la surface des cellules.
h1)A#.8/C/0331+A#>#)+,#/).8,#/7781*2,#7/8#3/#.8/+AE,*.01+#6,#8=*,7.,)8#-/8B)=#>#3</06,#6<)+,#A=B),+*,#60.,#
« tag » .,33,# B),# *,33,# 6,# 3<2=-/443).0+0+,# 6)# C08)A# 6,# 3/# 48077,# $[(&# *1+.8,# 3/B),33,# 6,A# /+.0*187A#
monoclonaux commerciaux validés peuvent se fixer pour permetre de repérer les récepteurs transfectés. En
,EE,.F# 3</?1).# 6,# *,..,# A=B),+*,# [(# 6/+A# 3/# 7/8.0,# ,D.8/*,33)3/08,# 6)# 8=*,7.,)8# 7,8-,..8/0.# 6,# C=80E0,8# ,+#
*G.1-=.80,#,+#E3)D#1)#,+#0--)+1E3)18,A*,+*,#3<,D78,AA01+#-,-!8/+/08,#6)#8=*,7.,)8#-).=#1)F#>#3<0+C,8A,F#A1+#
absence ou sa séquestration dans un compartiment cytoplasmique.

72
2.5.2.3 Etude de la mutation p.Tyr259Cys : conclusion

Nous avons mis en évidence chez un patient présentant un syndrome hémorragique modéré la mutation
p.Tyr259Cys affectant un résidu essentiel pour la stabilisation de liaison du groupement phosphate des ligands
du récepteur P2Y12'#K,..,#-)./.01+#78=A,+.,#>#3<=./.#2=.=81VG41.,#,+.8/0+,#)+,#60-0+).01+#6)#+1-!8,#6,#A0.,A#
de liaison du [3H]PSB-QRJe#6<,+C081+#IQ^#A)8#3,A#73/B),..,A#6)#7/.0,+.'#@/#60-0+).01+#6)#+1-!8,#6,#A0.,#6,#
liaison à cet antagoniste peut être due à une absence de récepteur muté exprimé à la surface des cellules ou à
)+,#0+*/7/*0.=#6,#3</+./41+0A.,#>#A,#30,8#/)#8=*,7.,)8'#@/#71)8A)0.,#6,#3<=.)6,#7/AA,8/#7/8#3/#.8/+AE,*.01+#6,#
récepteur comportant un tag HA dans la partie N-.,8-0+/3,#6,#3/#781.=0+,#,.#7,8-,..8/#6,#*1+*3)8,#A)8#3<18040+,#
de la diminution du nombre de site de liaison du [3H]PSB-0413 à la surface des plaquettes du patient et
*1+E08-,8#3<0-730*/.01+#6,#*,..,#/+1-/30,#A)8#3,A#*/7/*0.=A#6)#8=*,7.,)8#-).=#>#0+20!,8#6,#3</6=+G3/.,#*G*3/A,'#

2.5.3 Mutation p.Phe95Ser du récepteur P2Y12

Nous avons mis en évidence au laboratoire une troisième mutation du récepteur P2Y12 78=A,+.,# ># 3<=./.#
2=.=81VG41.,# *2,V# )+,# ?,)+,# E033,# A)0AA,# 6,# Ja# /+A# $kK&# /G/+.# *1+A)3.=# A)0.,# ># 3</77/80.01+# 6<2=-/.1-,A#
spontanés. Les signes cliniques comportaient des gingivorragies fréquentes, des hématomes post-traumatiques
très importants, quelques hématomes spontanés ainsi que des menstruations anormalement longues et
/!1+6/+.,A'#@<,D7318/.01+#8=/30A=,#/)#3/!18/.108,#-1+.8/0.#)+,#+)-=8/.01+#73/B),../08,#A/+A#/+1-/30,#$P``QQQ#
73.ls@&F# /C,*# 78=A,+*,# 6<)+,# /+0A1*G.1A,# 73/B),../08,# -16=8=,# $;:\# +1+# =C/3)/!3,# 7/8# 3</).1-/.,&# A/+A#
73/B),..,# 4=/+.,'# @</+/3GA,# -187213140B),# 6,A# 73/B),..,A# ,EE,*.)=,# ,+# -0*81A*170,# =3,*.81+0B),# >#
.8/+A-0AA01+# /# *1+E08-=# 6</033,)8A# 3/# 78=A,+*,# 6,# 481AA,A# 73/B),..,A# 6,# E18-,# /.G70B),# A/+A# /+1-/30,# 6,#
répartition des granules. La numération globulaire mettait en évidence une anémie modérée microcytaire en
E/C,)8#6<)+#.8/0.#.2/3/AA=-0B),#.8/+A-0A#7/8#3/#-58,#6,#3/#?,)+,#E,--,'#@,#.,-7A#6<1**3)A01+#73/B),../08,#=./0.#
allongé pour les cartouches ADP (141s) et adrénaline (288s). Les .,A.A#6</48=4/.01+#73/B),../08,#8=/30A=A#,+#
:Y:*# 1+.# -0A# ,+# =C06,+*,# )+,# 60-0+).01+# 6</-730.)6,# 6</48=4/.01+# 0+6)0.,# 7/8# 3<(N:# )+0B),-,+.# ># 3/#
concentration de 5 µM qui se normalisait aux concentrations supérieures (10 et 20 µM). Les agrégations
effectuées ,+#73/B),..,A#3/C=,A#1+.#-0A#,+#=C06,+*,#)+,#/+1-/30,#6</48=4/.01+#/785A#A.0-)3/.01+#7/8#3<(N:#>#
toutes les concentrations testées (5, 10, 20 et 100 µM) (figure 32).

73
Figure 32 : Agrégations plaquettaires réalisées chez la patiente KC et chez un témoin du jour
A g$(%!&%(1+*'/$0)(,-#11(+!#/$!&()+/&#/$#'$H5H@$(0!M/$/1+D-)(1+*'$0(!$)4 NH$XYA$9Z$#1$BZ$[JT$@K#\$)($0(1+#'1#$
KC (courbes rouges) et un témoin du jour (courbes bleues). B : agrégations plaquettaires réalisées en
plaquettes )(8&#/$(0!M/$/1+D-)(1+*'$0(!$)4 NH$XYA$9ZA$BZ$#1$9ZZ$[JT$@K#\$)($0(1+#'1#$aP$X@*-!"#/$!*-%#/T$#1$
un témoin du jour (courbes bleues). C g$0!&/#'1(1+*'$.#/$$(D0)+1-.#/$D(^+D()#/$.4(%!&%(1+*'$*"1#'-#/$(0!M/$
stimulation des plaquettes de la patiente KC ou du 1&D*+'$ .-$ ]*-!$ 0(!$ )4 NHA$ )#$ @*))(%M'#A$ )4(@+.#$
arachidonique, la ristocétine et la thrombine.

La mère de la patiente (KT) également explorée ne présentait aucune anomalie plaquettaire particulière ni
6</331+4,-,+.#6)#.,-7A#6<1**3)A01+'#:/8#*1+.8,F#3/#-W-,#/+1-/30,#6</48=4/.01+#/#=.é mise en évidence chez
le père 6,# kK# $k\&# 318A# 6,A# =78,)C,A# 6</48=4/.01+# 8=/30A=,A# ,+# 73/B),..,A# 3/C=,A : une diminution très
0-718./+.,#6,#3</-730.)6,#6,A#/48=4/.01+A#0+6)0.,A#7/8#3<(N:#>#.1).,A#3,A#*1+*,+.8/.01+A#.,A.=,A'#@/#patiente a
par ailleurs deux frères non explorés au laboratoire qui ne rapportent aucune diathèse hémorragique. Nous
avons été informés 8=*,--,+.#B)<)+#6,#*,A#6,)D#E858,A#/#6=C,3177=#)+,#3,)*=-0,#/04)t#3G-721!3/A.0B),#S#
(LAL B).

Devant les anomalies 6</48=4/.01+#1!A,8C=,AF#+1)A#/C1+A#7/8#3/#A)0.,#B)/+.0E0=#3,A#8=*,7.,)8A#:Pc12 présents

à la surface des plaquettes chez la patiente (KC) et chez ses parents (KM et KT). Les résultats obtenus montrent
une diminution modérée du nombre de sites capables de lier le [3H]PSB-0413 à la surface des plaquettes de la
patiente KC (57% du témoin du jour) ainsi que chez son père KM (71% du témoin du jour) (Figure 33). Ce
déficit peut paraitre extrêmement modéré en comparaison du témoin du jour, mais il est important de noter que
ce témoin comportait un nombre de récepteurs P2Y12 (380 sites) à la limite inférieure des valeurs normales

74
(425 +/- 50 sites par plaquettes). Par ailleurs, a)*)+,#60-0+).01+#6</EE0+0.=#6)#8/601304/+6#71)8#3,A#8=*,7.,)8A#
78=A,+.A#+</#7)#W.8,#-0A, en évidence au cours de ces expérimentations.

Figure 33 : O8()-(1+*'$.#$)4(CC+'+1&$k3H]PSB-0413 pour le récepteur P2Y12 du quantification des récepteurs

plaquettaires chez la patiente KC, son père KM et sa mère KT
U#/$ #^0&!+#'@#/$ .#$/(1-!(1+*'$ *'1$&1&$ !&()+/&#/$#'$ 0!&/#'@#$ .4-'#$ @*'@#'1!(1+*'$ C+^#$.4 NH$ X9$ DJT$ #1$.#$
concentrations croissantes de 3H]PSB-Zl9R$XZAl$'J$W$<Z$'JT?$i'$'*1#$-'#$.+D+'-1+*'$.4#'8+!*'$YZj$.-$
nombre de récepteurs à la surface des plaquettes de la patiente en comparaison du témoin du jour.

@<=C/3)/.01+#6,#3/#A04+/30A/.01+#,+#/C/3#/#=.=#8=/30A=,#)+0B),-,+.#>#3</06,#6,A#.,A.A#;(T:#-/0A#3,A#0+60*,A#6,#
réactivité plaquettaire étaient sans anomalie chez les trois membres de la famille (VASP > 70 %).

T)0.,#>#3/#-0A,#,+#=C06,+*,#6</+1-/30,A#6</48=4/.01+#.85A#-/8B)=,A#318A#6,#3<,D7318/.01+#8=/30A=,#,+#73/B),..,A#
lavées et de la diminution modérée du nombre de sites liant le [3H]PSB-0413 chez KC et son père, nous avons
séquencé le gène P2RY12 chez les trois membres de la famille. Une mutation hétérozygote c.584T>C a ainsi
été mise en évidence uniquement chez KC et son père KM. Cette mutation faux-sens entraine la substitution
6,#3/#72=+G3/3/+0+,#,+#71A0.01+#iI#7/8#)+,#A=80+,'#()#*1)8A#6,#3<=.)6,#*80A./3314raphique du récepteur P2Y12,
3,#8=A06)#iI#+</#7/A#=.=#6=*80.#*1--,#=./+.#)+#/*06,#/-0+=#0+60A7,+A/!3,#>#3/#30/0A1+#6,A#304/+6A'#K,7,+6/+.F#

75
*,.# /*06,# /-0+=# ,A.#78,AB),# /6?/*,+.# >#3/# *GA.=0+,# ia# ,.# 3</840+0+,# ie'# @/# *GA.=0+,# ia# /#=.=# 78=*=6,--,+.#
étudiée pou8# A1+# 8f3,# 0+60A7,+A/!3,# 71)8# 3</*.01+# /+.0-agrégante des thienopyridines et en particulier du
clopidogrel (Savi et al., 2006) (Savi et al., 2000) /318A#B),#3</840+0+,#ie#E/0.#7/8.0,#6,A#/*06,A#/-0+=A#0-730B)=A#
dans la stabilisation de liaison du groupement phosphate des agonistes nucléotidiques (Zhang et al., 2014a).
Le [3H]PSB-QRJe#=./+.#)+#6=80C=#.80.0=#6<)+#/+/314),#6,#3<(M: ]#3<(Y-C767085MX, il semble plausible que
la mutation de la phénylalanine 95 perturbe la liaison du radioligand au récepteur. Cette hypothèse expliquerait
la diminution de 50 % du nombre de sites capables de lier le [3H]PSB-QRJe# ,+# 78=A,+*,# 6<)+,# -)./.01+#
2=.=81VG41.,#6)#8=A06)#,+#71A0.01+#iI'#N/+A#*,#*/AF#3<=.)6,#6,#3/#-)./.01+#7':2,iIT,8#7/AA,8/#1!304/.108,-,+.#
par la reproduction de cette anomalie dans notre modèle cellulaire 1321N1 en utilisant un récepteur
« etiqueté u/C,*# 3/# A=B),+*,# [('# @<).030A/.01+# 6</+.0*187A# /+.0-[(# 7,8-,..8/# /318A# 6,# C=80E0,8# 3</68,AA/4,#
-,-!8/+/08,#6)#8=*,7.,)8#,.#3/#B)/+.0E0*/.01+#6,#3<(\:*#/785A#A.0-)3/.01+#6,A#*,33)3,A#/).180A,8/#3<=C/3)/.01+#
de transduction du signal en aval du récepteur.

Par ailleurs, les anomalies plaquettaires observées dans cette famille ne semblent pas être liées uniquement à
une mutation hétérozygote du gène codant le récepteur P2Y12. O+#,EE,.F#3</AA1*0/.01+#6<)+,#%-thalassémie (chez
KT et KC), 6<)+,#-/*81*G.1A, plaquettaire (KT et KC /)#-0+0-)-&#,.#6,#3</77/80.01+#6<)+,#@(@#S#*2,V#3,#
E858,# 6,# kK# $3)0# /)AA0# 718.,)8# 6,# 3/# -)./.01+# 7':2,iIT,8&# A)4458,# 3/# 78=A,+*,# 6</).8,A# /+1-/30,A des
73/B),..,A'# S0,+# B),# 3,# 72=+1.G7,# +,# A10.# 7/A# *1-735.,-,+.# ,+# E/C,)8# 6<)+,# thrombopathie XLLT, le
séquençage du gène GATA-J#/#=.=#,EE,*.)=#*2,V#kK'#K,7,+6/+.F#/)*)+,#-)./.01+#+</#=.=#-0A,#,+#=C06,+*,'#
N/+A#3,#*/A#6,#*,..,#E/-033,F#3,#A=B),+q/4,#6<)+#7anel de gènes connus ou possiblement impliqués dans des
pathologies plaquettaires serait un outil essentiel pour détecter ou exclure une anomalie associée à la mutation
du récepteur P2Y12 déjà mise en évidence.

76
2.6 Diagnostic et caractérisation des anomalies du récepteur P2Y12 :
discussion

En nous basant A)8#3/#-0A,#,+#=C06,+*,#6,#6=E/).A#-/?,)8A#6</48=4/.01+A#0+6)0.,A#7/8#3<(N:F#+1)A#/C1+A#mis

en évidence au laboratoire trois nouveaux variants du récepteur P2Y12 dans trois familles différentes non
apparentées. Il semble donc indispensable actuellement de réaliser un séquençage systématique du gène
P2RY12 chez les patients atteints de syndrome hémorragique modéré et porteurs de ce défaut fonctionnel isolé
et facilement identifiable. En cas de mutation non décrite, il est également nécessaire de réaliser une
!"#$%&'($!")*+),-$&./('0$,$(1)*+) +((+)'"!&',$+)*'"2),+)*1#$ $()#!" ($!""+,)!02+%314 5"),-'02+" +)*-'"($ !%.2)
anti-P2Y12 validés, cette caractérisation passe .'%) ,') %1',$2'($!") *-+6.1%$+" +2) *+) ,$'$2!") 7/$) .+%&+((+"()
*-13',/+%),-+6.%+22$!")*/)%1 +.(+/%)&/(1)'$"2$)7/+)2') '.' $(1)8),$+%),+2),$9'"*24):'%)'$,,+/%2;),-/($,$2'($!")*+)
plaquettes de patient étant limitée, la reproduction des mutations dans un système cellulaire adapté est
indispensable pour confirmer les anomalies de signalisation en aval du récepteur. Autant que possible et afin
de ne pas perturber les propriétés fonctionnelles du récepteur, la reproduction des mutations devrait être
effectuée sans modification structurale du récepteur potentiellement induite .'%),-'<!/()*-/")= tag >4)?-est la
stratégie que nous avons adoptée pour la caractérisation de la mutation p.His187Gln. Les études réalisées ont
permis de montrer que cette mutation entrainait un+) *$&$"/($!") *-'##$"$(1) *+s ligands nucléotidiques
(2MeSADP) .!/%),+)%1 +.(+/%)+()7/-+,,+)'0!,$22'$( complètement la transduction du signal en aval de celui-ci.
@+2) *!""1+2)!0(+"/+2) 2!"() *-'$,,+/%2) +") ' !%*)'3+ ),+2)(%'3'/6) *+) Zhang et al. (Zhang et al., 2014a) qui
précisent que ,-A$2($*$"+)BCD est indispensable à la stabilisation du noyau ribose dans la poche de liaison du
récepteur. Cependant cette étude cristallographique ne conclut pas quant à ,-$&.,$ '($!")*+) +)%12$*/)*'"2),')
transduction du signal qui a été observée au cours de notre étude.

Cependant, pour certaines mutations comme celles touchant les résidus impliqués dans la stabilisation de la
liaison des groupements phosphates (p.Phe95Ser et p.Tyr259Cys) les techniques de transfection devront
nécessairement utiliser des récepteurs marqués par une séquence de type HA. En effet, ces mutations semblent
abolir la liaison de notre radioligand spécifique du récepteur P2Y12 et empêchent ,-13',/'($!")*+),-+6.%+22$!")
du récepteur à la surface des cellules transfectées. @-/($,$2'($!")*+)construction « etiquetées » permet alors de
quantifier les récepteurs à la fois à la surface des cellules et dans le milieu intra- +,,/,'$%+)'3'"()*-+"3$2'9+%)
des études de signalisation. Cependant, il sera au préalable $"*$2.+"2'0,+)*+)31%$#$+%)7/+),-$"(%!*/ ($!")*+),')
séquence HA dans la partie N-terminale de la protéine ne perturbe ni la liaison des ligands au récepteur ni la
transduction du signal en aval de celui-ci.

Enfin, la mise en évidence dans deux familles différentes de syndromes hémorragiques corrélés avec la
présence de mutations hétérozygotes du récepteur P2Y12 (p.Phe95Ser et p.Tyr259Cys) repose la question du
mode de transmission de ce type de thrombopathie. En effet, les anomalies du récepteur P2Y12 sont considérées
comme des thrombopathies à transmission autosomique récessive. Cependant, les données obtenues au

77
laboratoire &!"(%+"()7/+),').'(A!,!9$+).+/()2-exprimer *E2),').%12+" +)*-/"+)&/('($!")8),-1('()A1(1%!FG9!(+4
Cette hypothèse est confortée par les travaux que M. Cattaneo avait effectués dès 1997. Il avait entre autre
montré que les patients porteurs *-/")*1#$ $()&!*1%1)*+),$'$2!")*/)HIeSADP (identifié plus tard comme étant
des porteurs de mutations hétérozygotes du récepteur P2Y12), étaient également caractérisés par un déficit de
sécrétion (Cattaneo et al., 1997). Par ailleurs, dans un contexte où au moins 50% des thrombopathies restent
non diagnostiquées ou non étiquetées;)$,)"-+2().'2)+6 ,/)7/+),+2).'($+"(2).!%(+/%2)*-/"+)&/('($!")A1(1%!FG9!(+)
du récepteur P2Y12 et rapportant une diathèse hémorragique soient également porteurs *-une autre anomalie
*+),-A1&!2('2+).%$&'$%+ voire de la coagulation. ?+.+"*'"(;)+"),-'02+" +)*+)*1pistage systématique de ces
pathologies, la présence de mutation hétérozygote du gène P2RY12 doit être considérée au cours de la prise en
charge de ces patients. En particulier, il est indispensable de réduire au maximum les facteurs de risques
thérapeutiques qui pourraient entrainer une majoration du syndrome hémorragique4) @-/($,$2'($!") *+2)
antiagrégants plaquettaires et des anti-inflammatoires non stéroïdiens doit particulièrement être contrôlée. Pour
+6+&.,+;)"!/2)'3!"2)+/),').!22$0$,$(1)*-1(/*$+%)'/),'0!%'(!$%+),+).'($+"()?J:)'.%E2)/"+).%$2+)*-'2.$%$"+4)@+2)
agrégations plaquettaires réalisée2)+"):K: )1('$+"()7/'2$)"/,,+2)'.%E2)2($&/,'($!").'%),-LM:;),+) !,,'9E"+)+()
,-' $*+)'%' A$*!"$7/+) +)7/$) !"#$%&+),')(%E2)#'$0,+) '.' $(1)*-' ($3'($!")*+2).,'7/+((+2)*'"2)/"+)(+,,+)2$(/'($!"4)
En situation traumatique, un tel phénotype plaquettaire aurait probablement conduit à une hémorragie. Dans
ce contexte, le dépistage *+2).'($+"(2).!%(+/%2)*-/"+)&/('($!")A1(1%!FG9!(+ est indispensable. Il permet de
pouvoir sensibiliser les patients sur la conduite à tenir en '2)*-A1&!%%'9$+;)*+).%13+"$%),+2) ,$"$ $+"2 en cas
*-$"(+%3+"($!") A$%/%9$ ',+) .%!9%'&&1+) !/) /%9+"(+;) +() *+) ,imiter la prise de médicaments risquant de
potentialiser le syndrome hémorragique.

78
3 Recherche des gènes impliqués dans les maladies du pool
vide non syndromiques ( -SPD)

3.1 Définition des N-SPD et stratégie diagnostique

Les maladies du pool vide liées aux granules denses correspondent à un groupe de thrombopathies hétérogènes
caractérisé par un déficit quantitatif ou qualitatif en ces granules. Quel que 2!$(),+)(G.+)*-'"!&',$+;) +2)+"($(12)
sont identifiables par un déficit fonctionnel plaquettaire lié à la diminution de la sécrétion des petites molécules
présentes dans les granules N4 5") .'%($ /,$+%;) ,') *$&$"/($!") *+) 21 %1($!") *-LM:) entraine une réduction de
,-'&.,$#$ '($!")*+),-' ($3'($!").,'7/+(('$%+)*1.+"*'"(+)*/)%1 +.(+/%):HO12. P$+")7/-+"3$%!")HQR)*+2).'($+"(2)
atteints de N-S:M)"+).%12+"(+"().'2)*-'"!&',$+),!%2)*+2)(+2(2)*-'9%19ation plaquettaire (Nieuwenhuis et al.,
1987);),+).%!#$,)*-'9%19'($!") ,'22$7/+&+"()!02+%31)+"):K: ) A+F),+2).'($+"(2)&+()+")13$*+" + :

- /"+)'02+" +)*+)*+/6$E&+)3'9/+)*-'9%19'($!"),!%2)*+),')2($&/,'($!")*+2).,'7/+((+2 pa%),-LM:)TQUIV.

- une absence ou une *$&$"/($!")*+),-'&.,$(/*+)*-'9%19'($!")associée à un allongement du temps de
latence après stimulation des plaquettes par le collagène et en particulier quand une faible
concentration est utilisée (1.25 µg/mL) (Ingerman et al., 1978).
- d+2)'9%19'($!"2)$"*/$(+2).'%),-' $*+)'%' A$*!"$7/+)"!%&',+2)!/)*-'&.,$(/*+)*$&$"/1+ en fonction de
,-$"(+"2$(1)*/)*1#$ $()+")LM:)(Michelson, 2013) (Chapter 50).

5").,'7/+((+2),'31+2;),+2)'"!&',$+2)!02+%31+2)+"):K: )'.%E2)2($&/,'($!")*+2).,'7/+((+2).'%),-LM:)"+)2!"()
pas retrouvées. En effet, ,-LM:)"-+"(%'ine ni la dégranulation des plaquettes ni la génération de TXA2 en
présence de calcium à la concentration de 2 mM (Kinlough-Rathbone et al., 1977) (Cazenave et al., 2004)
+(),-'9%19'($!")+2().'%)*1#$"$($!")%13+%2$0,+4):'%) !"(%+;),+2)'"!&',$+2)*-'9régation induites par le collagène
(1.25 µg/mL) sont classiquement présentes. Le diagnostic repose alors sur la mise en évidence *-une
diminution de la quantité des petites molécules (ADP et/ou sérotonine) contenues normalement dans ces
granules, associée ou non à une absence de granule N en microscopie électronique. 5"#$";),-1(/*+)*+)la
sécrétion permet de compléter la caractérisation du défaut fonctionnel observé en agrégation et
éventuellement mettre en évidence une anomalie des capacités sécrétoires des plaquettes sans déficit
9%'"/,'$%+).%!.%+&+"()*$(4)@+2)+6.,!%'($!"2)*+),')21 %1($!").'22+"()',!%2).'%),-1(/*+)*+),-$" !%.!%'($!")+()
*+),')21 %1($!")*+)21%!(!"$"+)%'*$!&'%7/1+)!/).'%),-1(/*+)*+),')21 %1($!")*-LW:)+"),/&$-agrégométrie.

79
3.2 La découverte des N-SPD

@+)2G"*%!&+)*-X+%&'"2YG-Pudlak, qui associe un déficit quantitatif en granules denses (White and Gerrard,
1976) à un déficit immunitaire et à un albinisme oculo-cutané a été la première entité à être décrite dès 1959
(Hermansky and Pudlak, 1959).

Par la suite, la mise en évidence en 1969 par Holm Holmsen (Holmsen et al., 1969) de deux pools distincts de
nucléotides plaquettaires ayant des fonctions différentes (un pool impliqué dans le métabolisme plaquettaire
+()/").!!,)21 %1(1)$&.,$7/1)*'"2),-'9%19'($!").,'7/+(('$%+V permit ,-$*+"($#$ '($!")*-/"+)*+/6$E&+)+"($(1)*+)N-
SPD. En effet, les déficits dans le pool de nucléotides sécrétés furent rapidement corrélés 8),-+6$2(+" + de N-
SPD sans présentation syndromique -+2()8)*$%+ à minima sans albinisme oculo-cutané associé. Les entités non
syndromiques sont caractérisées par des anomalies plaquettaires isolées liées à un déficit en ADP '$"2$)7/-à
un déficit en sérotonine retrouvé de manière inconstante (Holmsen and Weiss, 1972). La description d-/")
troisième type de N-SPD identifiable grâce à un déficit en ADP et en sérotonine sans absence de granules
denses (White et al., 1975) complexifie encore la description historique de ces pathologies.

@') ,'22$#$ '($!").%!.!21+)8),-époque qui différenciait les formes syndromiques des formes non syndromiques
a relativement peu évolué '/<!/%*-A/$. Les formes syndromiques sont aisément identifiables cliniquement en
%'$2!")*+),').%12+" +)*-/")',0$"$2&+)! /,!-cutané et de déficits immunitaires associés à la thrombopathie.
@-1(/*+)*+2).'($+"(2)'((+$"(2)*+)2G"*%!&+2)*-X+%&'"2YG-Pudlak ou de maladie de Chediak-X$9'2A$)')*-'$,,+/%2)
!"*/$()8),-$*+"($#$ '(ion des gènes responsables de ces pathologies. L),-$"3+%2+;),+2)#!%&+2)"!")2G"*%!&$7/+2)
dont le diagnostic reste actuellement difficile, regroupent des pathologies hétérogènes qui peuvent associer ou
non une absence de granules denses, un déficit en ADP, un déficit en sérotonine voire des anomalies de
sécrétion. L) +)<!/%;),-!%$9$"+)91"1($7/+)*+) +2)thrombopathies non syndromiques reste inconnue.

3.3 Biogénèse et sécrétion des granules denses plaquettaires

3.3.1 Biogénèse des granules denses

L),-$"3+%2+)*+2)9%'"/,+2)Z *!"(),-!%$9$"+)+2()essentiellement ,$1+)8),-appareil de Golgi des mégacaryocytes, les

granules denses plaquettaires semblent trouver leur origine plutôt dans le système endosomal de leur
précurseur médullaire( (Michelson, 2013) Chapter 18). Les travaux réalisés chez les patients atteints de
2G"*%!&+) *-X+%&'2"YG-Pudlak ont mis en évidence des anomalies au niveau des complexes protéiques
BLOCs (Biogenis of lysosome-related organelle complexes) et AP-3 (Adaptator protéin 3) impliqués dans la
biogénèse des organelles dérivées des lysosomes. Trois complexes BLOC ont ainsi été identifiés : BLOC-1,
BLOC-2 et BLOC-3. Le complexe BLOC-B) +2() !&.!21) *-'/) &!$"2) A/$( protéines : Cappucino, Muted,
Dysbindin, Snapin, BLOS-1, BLOS-2, BLOS-3 et la pallidine (Starcevic and Dell'Angelica, 2004). Cette

80
dernière est connue pour interagir avec la syntaxine 13 (Huang et al., 1999), un t-SNARE (Soluble N-
ethylmaleinde-sensitive-factor attachment protein Receptor) essentiel à la fusion des membranes au cours du
.%! +22/2)*-+6! G(!2+4)@+)complexe BLOC-2 est formé de trois protéines (HPS3, 5 et 6) et participerait au
transport et à la maturation des organelles en formation en coopération avec les GTPases RAB32 et RAB38
(Bultema et al., 2012). Le complexe BLOC-3 est lui composé de deux protéines (HPS1 et 4) et interagirait
également avec les GTPases RAB32 et RAB38 +")('"()7/+)#' (+/%)*-1 A'"9+)*/)[M: (Gerondopoulos et al.,
2012). Par ailleurs, les travaux de Ambrosio et al (Ambrosio et al., 2012) effectués sur une lignée
mégacaryocytaire (MEG-01) suggèrent que le complexe AP-3 permet ,-!%$+"('($!")*+)2(%/ (/%+2)*1%$31es des
endosomes tardifs et exprimant les transporteurs VMAT2 et MRP4 vers un compartiment tubulaire dédié à la
maturation des granules denses. Les études effectuées par cette équipe ont également confirmé le rôle des
GTPases RAB32 et RAB38 dans la maturation des granules. Bien que les mécanismes exacts soient encore
inconnus, ces travaux récents permettent petit à petit une identification des différents acteurs impliqués dans
de la biogénèse et la maturation des granules N.

De la même manière, les processus de chargement des petites molécules fortement concentrées dans ces
organelles sont également largement débattus. La sérotonine circulante, produite par les cellules entéro-
chromaffines *+),-$"(+2($")+2()rapidement captée par les plaquettes sanguines via le récepteur membranaire
SERT puis incorporée dans les granules N plaquettaires grâce au transporteur VMAT2 (Carneiro et al., 2008).
Par contre, les mécanismes conduisant à la concentration du calcium dans les granules N ne sont pas connus.
Enfin, le transporteur MRP4 a récemment été décrit comme étant présent sur la membrane des granules N et
est supposé participer au transport des nucléotides ver2),-$"(1%$+/%)*+) +2)!%9'"+,,+2 (Jedlitschky et al., 2012).
Toutefois, les travaux récents de Decouture et al (Decouture et al., 2015) sur des souris déficientes pour MRP4
suggèrent plutôt que le transporteur MRP4 participe essentiellement à la séquestration de ,-LI: )*'"2),+2)
granules N '/) !/%2)*+),-' ($3'($!").,'7/+(('$%+4

3.3.2 S1 %1($!")*+2)9%'"/,+2)*+"2+2)'/) !/%2)*+),-'9%19'($!").,'7/+(('$%+

L+).A1"!&E"+)*-+6! G(!2+)"1 +22$(+)la fusion des membranes granulaires et cellulaires grâce à des interactions
entre des protéines de la famille des SNARE, présentes sur la membrane des granules (v-SNARE) ainsi que
sur la membrane plasmique de la plaquette (t-SNARE) (Masliah-Planchon et al., 2013). Le modèle actuel
.%!.!2+)7/-/") !&.,+6+)#!%&1)+22+"($+,,+ment de trois SNAREs (VAMP8, SNAP-23 et STX11) est nécessaire
à la fusion des membranes granulaires et plasmiques (Golebiewska and Poole, 2015). Cependant, le mécanisme
+6' ()*+)#/2$!")*+2)&+&0%'"+2)"-+st pas encore complètement élucidé. En effet, de nouveaux acteurs, comme
la syntaxine-8 (Golebiewska et al., 2015) ont encore récemment été identifiés comme participant aux
!&.,+6+2)S\LK5).+%&+(('"(),-+6! G(!2+4)5"#$";),+)*13+,!..+&+"()*-/")&!*E,+)&/%$")]^).!/%),').%!(1$"+)
RAB27 et présentant un syndrome hémorragique associé à un déficit relatif en granules denses suggère que la
[W:'2+)KLPHD)+2()'/22$)$&.,$7/1+)*'"2),')21 %1($!")*+2)9%'"/,+2)N)(Jancic et al., 2007).

81
_,) "-+6$2(+) ' (/+,,+&+"() 7/+) .+/) *+) +%($(/*+2) !" +%"'"() ,+2) &1 '"$2&+2) &!,1 /,'$%+2) impliqués dans la
physiologie des granules denses plaquettaires. Cependant, la caractérisation des patients atteints de N-SPD
(essentiellement syndromiques) a .+%&$2)*-$*+"($#$+%) +%('$"2)*+2).%$" $.'/6)' (+/%2).%!(1$7/+2)$"*$2.+"2'0,+2)
à la formation et à la sécrétion de ces organelles. De plus, la culture des mégacaryocytes in vitro et
,-1('0,$22+&+"()*+),$9"1+2) +,,/,'$%+2)'22! $1+2)'/(!%$2+nt dorénavant ,-1(/*+)*+) +2).%!(1$"+2)*!"(),+2 fonctions
exactes restent à ce jour souvent indéterminées.

3.4 Les différents types de maladies du pool vide

?!&&+)"!/2),-'3!"2)3/).%1 1*+&&+"(;),+2) N-SPD peuvent être à minima divisés en deux grands types de
thrombopathies : les formes syndromiques qui ne touchent pas uniquement les plaquettes, et les formes non
syndromiques dont le phénotype se limite à la lignée mégacaryocytaire.

3.4.1 Les N-SPD syndromiques

Trois pathologies ont été décrites à ce jour comme faisant partie des N-SPD syndromiques : la maladie de
Chediak-Higashi, ,+2)2G"*%!&+2)*-X+%&'"2YG-Pudlak et les syndromes de Griscelli.

La maladie de Chediak-Higashi est une pathologie autosomique récessive (OMIM : 214500) due à une
mutation du gène LYST (localisé en 1q42.3) (Barbosa et al., 1996) qui conduit à des anomalies du trafic
vésiculaire et à la formation de granules géants essentiellement dans les mélanocytes et les leucocytes. La
fonction de la protéine LYST reste mal connue, mais les travaux récents de Sapulveda et al (Sepulveda et al.,
2015) 2/99E%+"()7/+) +((+).%!(1$"+).'%($ $.+)8),-'$9/$,,'9+) !%%+ ()+()8),-'22+&0,'9+)*+2)+"*!somes tardifs et
des lysosomes. La pathologie associe une thrombopathie de type N-SPD modérément hémorragique à une
hypo-pigmentation de la peau et un déficit immunitaire. Elle conduit généralement au décès des patients avant
,-`9+)*+)Ba)'"2)2/$(+)'/)*13+,!..+&+"()*-/"+),G&.A!A$2($! G(!2+)&'<+/%+4

@+2)2G"*%!&+2)*-X+%&'"2YG-Pudlak sont des pathologies à transmission autosomique récessive qui affectent

.,/2$+/%2)(G.+2)*-!%9'"+,,+2) +,,/,'$%+2 : les mélanomes, les lysosomes et les granules denses plaquettaires. En
conséquence, le phénotype syndromique observé chez les patients associe un syndrome hémorragique modéré,
un albinisme occulo-cutané, une immunodéficience et parfois une fibrose pulmonaire évolutive. La
thrombopathie est liée à une quasi absence de granules denses plaquettaires objectivable en microscopie
électronique. Ces pathologies sont dues à des mutations des gènes codant les protéines des complexes BLOC
1, 2, 3 et AP-3 présentés dans le chapitre précédent. Au moins neuf gènes (HPS1, HPS4 (Martina et al., 2003),
AP3B1 (Feng et al., 1999), HPS3, HPS5, HPS6 (Di Pietro et al., 2004), DTNBP1 (Li et al., 2003), BLOC1S3
(Morgan et al., 2006), BLOC1S6 (Cullinane et al., 2011) ont ainsi été décrits pour être impliqués dans ces
syndromes et la sévérité de la maladie dépend du gène affecté. En particulier, les syndromes dus à des

82
mutations de HPS1 sont considérés comme les formes les plus graves en raison de la fréquence élevée des
fibroses pulmonaires associées.

Enfin, les mutations du gène codant pour la GTPase RAB27 sont responsables du syndrome de Griscelli
(OMIM : 607624) (Griscelli et al., 1978). Cette pathologie à transmission autosomique récessive associe un
syndrome hémorragique lié à une diminution du nombre de granules denses plaquettaires, un albinisme, une
atteinte neurologique et un déficit immunitaire (Westbroek et al., 2008).

3.4.2 Les formes non syndromiques

@+2)N-SPD non syndromiques sont des thrombopathies dont le phénotype hémorragique cutanéomuqueux est
souvent considéré comme &!*1%1) +") !"*$($!"2) "!") (%'/&'($7/+24) 5") '2) *-$"(+%3+"($!") A$%/%9$ ',+) !/)
*-' $*+"(;) +2).'($+"(2)!"().!/%('"()/")%$27/+)"!")"19,$9+'0,+)*+)2'$9"+&+"(2)$&.!%('"(2)+"9'9+'"().'%#!$2)
le pronostic vital. En réalité, en raison des caractéristiques biologiq/+2) A1(1%!9E"+2) *+2) N-SPD non
syndromiques, le diagnostic de cette pathologie reste difficile et peu standardisé (Mumford et al., 2015). ?-+2()
pourquoi la fréquence de la maladie est à ce jour inconnue &'$2) +%('$"+2)1(/*+2)2/99E%+"()7/+),+2)N-SPD non
syndromiques pourraient correspondre au type de thrombopathie congénitale le plus fréquent (Quiroga et al.,
2007) (Mezzano et al., 2009). Les N-SPD non syndromiques peuvent être dus à une absence ou diminution du
nombre de granules N, à une anomalie qualitative de ces organelles ou à une association de ces deux déficits.
Mais dans tous les cas les mécanismes physiopathologiques et moléculaires qui conduisent à ces anomalies ne
2!"()8) +)<!/%) .'2) !""/24) :'%)'$,,+/%2;) A+F) 7/+,7/+2) .'($+"(2;) ,') *$&$"/($!") */) "!&0%+) *+) 9%'"/,+2) N) +2()
'22! $1+)8)/")*1#$ $()+")9%'"/,+2)Z)+()*!""+)"'$22'" +)8)/"+).'(A!,!9$+)'..+,1+)ZN-SPD qui serait liée à une
*19%'"/,'($!")*+2).,'7/+((+2)+"),-'02+" +)*-' ($3'($!")*+) +,,+2-ci (White et al., 2007).

S+,!"),-+6.1%$+" +)*+)"!(%+),'0!%'(!$%+;),')&'<!%$(1)*+2)N-SPD non syndromiques semblent due à un déficit

isolé en agonistes solubles et en particulier en ADP. Dans ce cas, des transporteurs de nucléotides comme
IK:b)2!"()' (/+,,+&+"()2/2.+ (12)*-c(%+)%+2.!"2'0,+2)*+),').'(A!,!9$+. En effet, une localisation anormale de
la protéine a été mise en évidence chez certains patients porteurs de N-SPD (Jedlitschky et al., 2010).
Cependant, aucune équ$.+)"-')./, à ce jour, mettre en évidence de mutation du gène ABCC4 codant la protéine
MRP4.

Le diagnostic de ces thrombopathies non syndromiques repose sur des anomalies fonctionnelles objectivables
,!%2) *+2) (+2(2) *-'9%19'($!"2;) 2/%) ,') %+ A+% A+) *-/") déficit quantitatif en granules denses en microscopie
électronique et sur la mise en évidence de déficits en petites molécules contenues dans ces granules. En suivant
cette méthodologie diagnostique, le laboratoire cherche actuellement à identifier des profils biologiques
similaires chez des patients porteurs de la pathologie afin de rechercher des anomalies génétiques responsables
des N-SPD observés et bien caractérisés.

83
3.5 Recherche des gènes impliqués dans les maladies du pool vide non
syndromiques avec déficit isolé en ADP

3.5.1 Exploration de la famille S et du propositus SJ

En décembre 2012;)"!/2)'3!"2)+6.,!%1)'/),'0!%'(!$%+)*-A1&!2('2+)2.1 $',$21)*+),-5dS)L,2' +)/")<+/"+)A!&&+)

de 18 ans (SJ) 2/$3$) *+./$2) ,-+"#'" +) .!/%) *+) "!&0%+/6) 1.$2!*+2) *-1.$2('6$2) 'G'"() parfois nécessité une
'/(1%$2'($!")'$"2$)7/+).!/%),-'..'%$($!")*-A1&'(!&+2)2.!"('"12)!/)*$2.%!.!%($!""12)+") '2)*+)(%'/&'($2+2)
minimes. Ce patient a été adressé au laboratoire à la suite *-/"+ triple fracture du crâne !&.,$7/1+) *-/")
hématome et associée à des saignements majeurs et difficilement contrôlables. La prise en charge a nécessité
une hospitalisation de six semaines ainsi que deux reprises chirurgicales complétées par de multiples
transfusions plaquettaires et par des injections de concentrés de facteur VII activé (Novoseven©). Cet accident
a laissé plusieurs séquelles neurologiques chez le patient : une hémiparésie, un strabisme et une fragilité
psychologique qui sera par la suite traitée par antidépresseurs tricycliques. Les explorations biologiques
réalisées au !/%2) *+) ,-1.$2!*+) (%'/&'($7/+ ./$2) 8) *$2('" +) *+) ,-13E"+&+"() "-!"() &$2) +") 13$*+" +) '/ /"+)
anomalie de la numération plaquettaire (230 000 plt/µL, VPM= 9.9 fL), ni *-anomalie de la coagulation
(Temps de Quick, Temps de céphaline activée, exploration du facteur Willebrand dans les limites des valeurs
normales).

@+2)(+2(2)*+)*1.$2('9+)*+2)'"!&',$+2)*+),-A1&!2('2+).%$&'$%+)1('$+"t également sans particularité. Les temps

*-! ,/2$!").,'7/+(('$%+)"-1('$+"().'2)',,!"912 avec les cartouches ADP et adrénaline et le temps de saignement
réalisé par technique Ivy (%!$2).!$"(2)*/%'"(),-+"#'" +)1('$()$"#1%$+/%)8) $"7)&$"/(+24)@')%+ A+% A+)*-'"($ !%.2)
anti-.,'7/+((+2)1('$()19',+&+"()"19'($3+4)@+2)(+2(2)*-agrégation plaquettaire réalisés en PRPc plusieurs mois
'.%E2),-' $*+"()ont mis en évidence /"+)'02+" +)*+)*+/6$E&+)3'9/+)*-'9%19'($!")'.%E2)2($&/,'($!").'%),-LM:)
(2.5 et 5 µM). Les agrégations induites par le collagène (2.5 U9e&@V;) ,-' $*+) '%' A$*!"$7/+) TB&IV) +() ,')
ristocétine (1.25 mg/mL) "-1('$+"()pas perturbées (Figure 34).

Devant cette anomalie limitée, potentiellement liée à une absence de dégranulation des plaquettes après
2($&/,'($!").'%),-LM:;)/")*!2'9+)*+2)"/ ,1!($*+2)+()*+),')21%!(!"$"+).,'7/+(('$%+)')1(1)+##+ (/14)f")*1#$ $()
majeur en ADP a alors été mis en évidence chez le propositus conduisant à un rapport ATP/ADP supérieur à
5 (valeurs normales du laboratoire : 1.2< ATP/ADP<2.2). Un déficit en sérotonine a par ailleurs été objectivé
chez le patient, mais le traitement par antidépresseurs (%$ G ,$7/+2) *!"() ,+) &1 '"$2&+) *-' ($!") .'22+) .'%)
,-$"A$0$($!")*+),')%+ '.(/%+)*+),')21%!(!"$"+)+2()/")#' (+/%) !"#!"*'"()7/$).+/()+6.,$7/+%) +((+)*!""1+4

84
Figure 34 : Agrégations plaquettaires réalisées en PRPc chez le propistus (SJ) et chez un témoin du jour
(CTRL)
!"#$%&'(!)#!*+,-$)#+,./!0'*!1)#2$'++'*!0$!13.1.*,+$*!1#3!)4 56!78 µM /4'/+3#,/'!1#*!0'!0'$9,:-'!;#"$'!
04#"3<"#+,./=! $!%'/+3'!'+!>!03.,+'(!)'*!#"3<"#+,./*!,/0$,+'*!3espectivement par le collagène (2.5 µg/mL) et
)4#%,0'!#3#%&,0./,2$'!7?!-@A!/'!-./+3'/+!1#*!04#/.-#),'!1#3+,%$),:3'=

A la suite de la mise en évidence du déficit en ADP dans les granules denses chez ce patient, nous avons pu
+6.,!%+%),-+"2+&0,+)*+2)&+&0%+2 *+)2')#'&$,,+)8)2'3!$%)2+2)(%!$2)#%E%+2)+()2g/%2)'$"2$)7/+)2+2).'%+"(24)La mère
*/).%!.!2$(/2)%'..!%(+)/")2G"*%!&+)A1&!%%'9$7/+)*'"2),-+"#'" +)+22+"($+,,+&+"()2!/2),')#!%&+)*-1.$2('6$2)
alors que les autres membres de la famille ne présentent à priori pas de manifestation hémorragique
particulière. @-étude en plaquettes lavées réalisée chez le propositus a alors mis en évidence une diminution
modérée *-amplitude agrégation induite par le collagène à 2.5 µg/mL fortement majorée en présence de faible
concentr'($!")*-'9!"$2(+ (1.25 µg/mL). A/ /"+)'"!&',$+)*-'9%19'($!")$"*/$(+).'%),-' $*+)'%' A$*!"$7/+)"-')
pu être observée ,+)<!/%)*+),-+6.,!%'($!" (Figure 35).Par ailleurs, chez la mère du propositus (SH), son frère
TSIV)+()/"+)*+)2+2)2g/%2)TS?XV;),+2)(+2(2)*-'9%19'($!").,'7/+(('$%+2)+##+ (/12)+"):K: )!"()19',+&+"()&!"(%1)
/"+)'02+" +)*+)*+/6$E&+)3'9/+)$"*/$(+).'%),-LM:)TQ)UIV)',!%2)7/+) A+F),+).E%+)TSdV)+() A+F)2')*+/6$E&+)
2g/%)TS?LV;)'/ /"+)'"!&',$+)"-')1(1)&$2+)+")13$*+" +4

Un dosage des nucléotides et de la sérotonine plaquettaire a été réalisé chez les six membres de la famille. Le
déficit en ADP associé à un rapport ATP/ADP > 5 a été confirmé chez le propositus. La même anomalie a été
mise en évidence chez les membres de la famille présentant une absence de deuxième vague *-'9%19'($!")8)
,-LM:) Td$9/%+) hiV4) @+2) *!2'9+2) *+) 21%!(!"$"+) +##+ (/12) "+) &!"(%'$+"() '/ /") *1#$ $() A+F) ,-+"2+&0,+) *+2)
membres de la famille (valeurs normales : 200 j 1200 ng/mL pour 109 plaquettes) hormis chez notre propositus
qui était toujours traité par antidépresseurs tricycliques (valeurs obtenue : 50 ng/mL pour 109 plaquettes).

85
Figure 35 : Agrégations plaquettaires réalisées en plaquettes lavées chez le propositus (SJ, courbes rouges) et
chez un témoin du jour (courbes bleues)
(A) : agrégations après stimulation 1#3! )4 56! 7B=8! C@! '+! 8! C@A! 7DA : agrégations après stimulation des
plaquettes par le collagène (1.25 µg/m et 2.5 µg/mL). (C) E!#"3<"#+,./*!,/0$,+'*!1#3!)4#%,0'!#3#%&,0./,2$'!
(50, 75 et 100 µM). (D) : Agrégations induites par la thrombine 0.1 UI/mL. Sur chaque graphique, les courbes
dont les couleurs sont les plus claires correspondent aux concentrations en agoniste les plus basses, les
couleurs les plus foncées correspondent aux concentrations en agoniste les plus élevées.

@-!02+%3'($!")*+2).,'7/+((+2)*+)SJ)+")&$ %!2 !.$+)1,+ (%!"$7/+)8)(%'"2&$22$!")"-')&!"(%1)'/ /"+)'"!&',$+)

&!%.A!,!9$7/+).,'7/+(('$%+)+()+").'%($ /,$+%),').%12+" +)*+)9%'"/,+2)*+"2+2)+")7/'"($(1)"!%&',+)+()*-'2.+ ()
comparable aux plaquettes témoins (Figure 37).

@-+"2+&0,+)*+2)*!""1+2) ,$"$7/+2)+()0$!,!9$7/+2)%1 !,(1+2)')'$"2$).+%&$2)*+).!2+%),+)*$'9"!2($ )*+)&','*$+)*/)

pool vide non syndromique avec déficit isolé en ADP chez trois membres de cette famille de six personnes :
SJ, SCH et SM.

86
Figure 36 : Dosage des nucléotides plaquettaires
A gauche, chromatogramme du dosage de )4ADP et de )4ATP obtenu en HPLC chez le propositus SJ. A droite :
ratio ATP/ADP obtenu après dosage des nucléotides en HPLC chez les 6 membres de la famille. On note un
déficit majeur en ADP chez le propositus (SJ), $/'!0'!*'*!*F$3*!7GHIA!'+!*./!J3:3'!7G@A!%./0$,*#/+!>!0'*!
rapports 0'!%./%'/+3#+,./!04 K6L 56!J.3+'-'/+!#$"-'/+<* (>4).

Figure 37 : Plaquettes du propositus (SJ) observées en microscopie électronique à transmission

M/!/'!/.+'!#$%$/'!#/.-#),'!$)+3#*+3$%+$3#)'!1#3+,%$),:3'!#;'%!)#!13<*'/%'!0'!"3#/$)'*!N!'+!O!'/!2$#/+,+<s
normales.

87
3.5.2 Recherche des gènes impliqués dans la maladie du pool vide non syndromique
diagnostiquée chez certains membres de la famille S

3.5.2.1 !"#$%&'($)*+$,-.$)$/)012-/034$4)*$)/5'%4.6446-%)*$)7')2'/0-7-(6$

La mise en évidence chez trois membres de la famille S (Figure 38V)*-/"+)'"!&',$+ biologique similaire et
caractérist$7/+)*-/")(G.+)*+)N-SPD non syndromique nous a conduits 8),')%1',$2'($!")*/)217/+"k'9+)*+),-+6!&+)
de tous les membres de la famille (Boycott et al., 2013).

Figure 38 : Arbre généalogique de la famille S

Trois membres sont porteurs 04$/'!-#)#0,'!0$!1..)!;,0'!/./!*P/03.-,2$'!#;'%!0<J,%,+!'/! 56 : le propositus
SJ, SCH et SM.

5")+##+(;),-$*+"($#$ '($!")*+),').'(A!,!9$+) A+F trois enfants sur quatre .+%&+()*-+"3$2'9+%)/"+) !&.'%'$2!")*+2)

217/+" +2) !*'"(+2)*+),-+"2+&ble des gènes de chaque individu afin de rechercher des mutations corrélées
avec la présence de la thrombopathie. ?!&.(+)(+"/)*+),-'%0%+)91"1',!9$7/+)réalisé, plusieurs hypothèses de
transmission de la thrombopathie peuvent être envisagées :

- Une transmission autosomique dominante liée à une mutation germinale dite « de novo » *-/")2+/,)
gène provenant indifféremment du père ou de la mère. Dans ce cas, seuls SJ, SM et SCH seraient
porteurs de la mutation.
- Une transmission autosomique récessive : les parents (non consanguinsV)2+%'$+"()',!%2).!%(+/%2)*-/"+)
mutation mono-allélique et possiblement différente du même gène. Les deux mutations devraient alors

88
 être trouvées chez les trois enfants atteints (patients hétérozygotes composites). Le quatrième enfant
(SCA) serait alors po%(+/%)*-/"+)&/('($!")&!"!-allélique provenant indifféremment du père ou de la
mère, ou ne porterait aucune mutation du gène candidat.
- Un digénisme (Schaffer, 2013): la pathologie serait liée à deux mutations de deux gènes distincts
!*'"()*+2).%!(1$"+2)7/$)$"(+%'9$%'$+"()*$%+ (+&+"()!/)$"*$%+ (+&+"(),-/"+)'3+ ),-'/(%+)'/) !/%2)*/)
même mécanisme physiologique. Dans ce cas, les deux mutations devraient être trouvées chez les
enfants atteints. Une mutation serait supposée prov+"$%)*+),')&E%+)+(),-'/(%+)*/).E%+4)@+)7/'(%$E&+)
+"#'"() .!/%%'$() ',!%2) .!%(+%) $"*$##1%+&&+"() /"+) '"!&',$+) $2!,1+) *-/") *+2) 9E"+2) !/) 0$+") '/ /"+)
anomalie.

Le séquençage des exomes complets des six membres de la famille et les analyses bio-informatiques associées
ont été réalisées en collaboration avec nos collègues du laboratoire de génétique du CHU de Strasbourg
(Professeur Hélène Dollfus et son équipe, Unité INSERM 1112). Le séquençage en lui-même a été confié à la
société Integragen© qui a effectué ce travail sur un séquenceur Haut Débit Illumina HiSeq 2000. Les détails
de la méthode de séquençage sont fournis *'"2),-'""+6+)(+ A"$7/+ (Annexe 4) de ce document. @-'""!('($!")
*+),-+6!&+)+(),')3',$*'($!")*+)la qualité du séquençage ont été effectuées 8),-'$*+)*/),!9$ $+,)Illumina RTA
(Real Time Analysis) v1.14. En particulier, les séquences retenues devaient posséder sur chaque base un score
de qualité Q suffisamment élevé (Q >25) pour attester de manière statistique que la base proposée est bien
celle qui est présente à cet emplacement dans le génome (si Q> 25, la probabilité pour que cette base soit la
bonne est supérieure à 99%). :'%),')2/$(+;),-+"2+&0,+)*+2)217/+" +2)3',$*1+2)!"()1(1)',$9"1+2)2/%),+)91"!&+)*+)
%1#1%+" +)T3+%2$!")A9Ble[K?AhDV)8),-'$*e du logiciel CASAVA 1.8. Ce logiciel fourni par Illumina© permet
,-'""!('($!")*+2)*$##1%+"(2).!,G&!%.A$2&+2)&$2)+")13$*+" +)'$"2$)7/+),-$*+"($#$ '($!")*+2)&/('($!"2)*+)(G.+)
insertion/délétion (INDEL). Cette approche nous a permis de mettre en évidence plus de 230 000 variants dans
,-+"2+&0,+)*+2)2$6)+6!&+2)'"',G2124)?+2)3'%$'"(2)!"()+"2/$(+)1(1)#$,(%12)+()'""!(12)8),-'$*+)*-/"+)'..%! A+)
utilisée par ,-17/$.+)*/):%)X1,E"+)M!,,#/2 : Alamut HT (Interactive Biosoftware©V)7/$).+%&+()*-$" ,/%+)*'"2)
,-'"'lyse les annotations du génome ainsi que les effets potentiels des variants à la fois au niveau nucléotidique
et au niveau protéique. La combinaison des informations obtenues avec les données disponibles dans les
différentes bases de données internationales en termes de fréquence des variants décrits dans la population
générale a permis de classer les mutations identifiées en fonction de leur potentiel délétère.

f"+) #!$2) ,-'"',G2+) 0$!-informatique réalisée, nous avons pu appliquer les différentes hypothèses de
transmission de la pathologie précédemment citées. Mais avant cela, nous nous sommes immédiatement
intéressés au gène ABCC4 codant pour la protéine MRP4 actuellement supposée être impliquée dans les N-
SPD non syndromiques. Malheureusement, aucune mutat$!")"-')1(1)&$2+)+")13$*+" +) A+F)'/ /")&+&0%+)*+)
notre famille. Ce résultat ne permet cependant pas de conclure définitivement quant à ,-'02+" +)*-$&.,$ '(ion
de la protéine MRP4 dans notre cas de N-SPD car les séquences régulatrices situées hors des exons du gène
ABCC4 "-!"().'2)1(1)217/+" 1+24

89
@+2)2 1"'%$!2)*+)(%'"2&$22$!")0'212)2/%),-'((+$"(+)*-/")2+/,)9E"+)"+)"!/s ont pas permis de sélectionner de
gènes candidats codant pour des protéines plaquettaires dont la fonction pouvait être en rapport avec la
thrombopathies observée4)@-AG.!(AE2+)*-/"+)(%'"2&$22$!")'/(!2!&$7/+)*!&$"'"(+)'22! $1+)8)/"+)&/('($!")de
novo "!/2)')!%$+"(12)3+%2)/"+)7/$"F'$"+)*+)9E"+2)&'$2)'/ /")"-1('$()$&.,$7/1)*'"2),').AG2$!,!9$+).,'7/+(('$%+4)
De la même manière, les quarante gènes candidats sélection12) +") 1&+(('"(),-AG.!(AE2+)*-/"+)(%'"2&$22$!")
'/(!2!&$7/+) %1 +22$3+) '3+ ) '..'%$($!") *-A1(1%!FG9!(+2) !&.!2$(+2) A+F) +"#'"(2) '((+$"(2) "-!"( pas permis
*-$*+"($#$+%)de protéine candidate potentiellement liée à la pathologie observée (Figure 39).

M+3'"(),-'02+" +)*+)&/('($!")*-/")2+/,)9E"+) !*'"()/"+).%!(1$"+)$&.,$7/1+)*'"2),').AG2$!,!9$+).,'7/+(('$%+;)

nous nous sommes orientés vers une hypothèse de digénisme. En effet, dans la majorité des cas, les techniques
de séquençage à haut débit ne permettent pas, 8)+,,+2)2+/,+2;)8),-'$*+)*+)2$&.,+2)',$9"+&+"(2)*+)217/+" +2;)
,-$*+"($#$ '($!") *-'"!&',$+2) &/,($91"$7/+2) %+2.!"2'0,+2) *+) .'(A!,!9$+2) !&.,+6+2 (Schaffer, 2013). En
complément, la prise en compte des principales protéines connues pour être impliquées dans la physiologie
impactée par la pathologie est indispensable. Dans le cas de famille S, le déficit en ADP mis en évidence, nous
!%$+"(+) .%$!%$('$%+&+"() 3+%2) ,') %+ A+% A+) *-/"+) '"!&',$+) *-/") (%'"2.!%(+/%) *+) "/ léotides localisé sur la
membrane des granules denses plaquettaires.

@-$*+"($#$ '($!") %1 +"(+) */) (%'"2.!%(+/%) *+) "/ ,1!($*+2) m\fW) 2/%) ,') &+&0%'"+) *+2) 9%'"/,+2) *+"2+2)
plaquettaires (Hiasa et al., 2014) "!/2)').+%&$2)*-!%$+"(+%),')2/$(+)*+)"!2)$"3+2($9'($!"24)5")+##+()/"+)&/('($!")
faux-sens hétérozygote du gène SLC17A9 a été mise en évidence à la fois chez notre propositus (SJ) et chez
2') &E%+) TSXV) 7/$) %'..!%(+) 19',+&+"() /"+) A$2(!$%+) A1&!%%'9$7/+) .!" (/1+) *-1.$2('6$2) %1 /%%+"(+24) ?+((+)
mutation c.1190C>T conduit à la substitution de la thréonine 397 (localisée dans le 13ème exon) par une
&1(A$!"$"+4)?+).!,G&!%.A$2&+)+2()*1 %$()*'"2)+"3$%!")bR)*+),').!./,'($!")*-'.%E2),')0'2+)*+)*!""1+)« 1000
génomes »4) @') #%17/+" +) %+,'($3+&+"() 1,+31+) *-'..'%$($!") *+) +) .!,G&!%.A$2&+) "-+2() +.+"*'"() .'2) +")
contradiction avec la fréquence des N-SPD qui sont considérées comme les thrombopathies les plus fréquentes
*'"2),').!./,'($!"4):'%)'$,,+/%2;),')(A%1!"$"+)hlD)+2()'/) +"(%+)*-/"+)217/+" +)*+)i)' $*+2)'&$"12)T5WTGSW)
intégralement conservée dans de nombreuses espèces n),-Xomme, le singe %A12/2;),')2!/%$2;),+) A$+";),-1,1.A'"()
et le poulet, ce qui suggère un rôle fondamental de cette séquence dans la fonction du transporteur.
Malheureusement, le modèle de prédiction fonctionnelle de cette séquence extrêmement conservée (via le site
internet Interpro (Interpro) ne fournit aucune information sur son rôle supposé.

90
Figure 39 : Schéma résumé de la stratégie 04#/#)P*'! Q,.-informatique et des scénarios de transmission
#11),2$<*!>!)#!*$,+'!0$!*<2$'/R#"'!04'9.-'!0'!)#!J#-,))'!G
S'*!0.//<'*!"</<3<'*!1#3!)'!*<2$'/R#"'!04'9.-'!./+!<+<!3'+3#,+<'*!*$%%'**,;'-'/+ >!)4#,0'!0'!+3.,*!).",%,')* :
RTA, CASAVA et Alamut HT. S4'9.-'!0'!%&#2$'!,/0,;,0$!#!<+<!#//.+<!'+!)4'/*'-Q)'!0'*!-$+#+,./*!,0'/+,J,<'*!
ont été classées en fonction de leur potentiel délétère. Les différents scénarios de transmission (mutation de
novo à transmission autosomique dominante, transmission autosomique récessive ou digénisme) ont ensuite
été appliqués pour sélectionner les gènes candidats.

91
3.5.2.2 Etude du transporteur VNUT chez le patient SJ

VNUT (vesicular nucleotides transporter) est une protéine à douze domaines transmembranaires codée par le
gène SLC17A9 localisé sur le bras long du chromosome 20 (20q13.33). La protéine a été caractérisée pour la
première #!$2) +") HaaC) .'%) ,-17/$.+) *+) Sawada (Sawada et al., 2008) qui a isolé le transporteur dans de
nombreux tissus chez ,') 2!/%$2) &'$2) *!"() ,-+6.%+22$!") &'<!%$('$%+) 1('$() +22+"($+,,+&+"() ,! ',$21+) *'"2) ,+)
cerveau, les glandes surrénales et la tyroïde. Cette équipe a également montré que VNUT est un transporteur
actif de nucléotides +()+").'%($ /,$+%)*+),-LW:)qui utilise comme force motrice le gradient électrochimique créé
par la concentration des protons dans les vésicules cellulaires acides (Figure 40). Les travaux de Sakamoto et
al (Sakamoto et al., 2014) ont par la suite montré grâce à un modèle de souris KO que le transporteur VNUT
.'%($ $.'$()8),')%19/,'($!")*+),')21 %1($!")*-$"2/,$"+).'%)les cellules o)*+2)$,!(2)*+)@'"9+%A'"24)

Figure 40 : Le transporteur de nucléotides VNUT

A gauche représentation schématique des 12 domaines transmembranaires de la protéine VNUT. A droite,
13<*'/+#+,./!0$!3T)'!*$11.*<!0$!+3#/*1.3+'$3!UVWK!0#/*!)4,/%.31.3#+,./!0'*!/$%)<.+,0'*!0#/*!)'*!"3#/$)'*!O
plaquettaires. Le transport actif des nucléotides est effectué grâce à la protéine VNUT qui utilise comme force
-.+3,%'! )'! "3#0,'/+! <)'%+3.%&,-,2$'! "</<3<! 1#3! )4'/+3<'! 0'*! 13.+./*! 0#/*! )'*! "3#/$)'*=! S'*! /$%)<.+,0'*! *'!
concentrent 0#/*!)'*!"3#/$)'*!'+!*'3./+!*<%3<+<*!#$!%.$3*!0$!13.%'**$*!04#%+,;#+,./!0's plaquettes.
(54#13:* Sawada et al (Sawada et al., 2008), et Hiasa et al (Hiasa et al., 2014),)

5"#$";),')&$2+)+")13$*+" +)*+),-+6.%+22$!")*+)m\fW)2/%),+2)9%'"/,+2)*+"2+2).,'7/ettaires par Hiasa et al (Hiasa

et al., 2014) suggèrent un rôle *+) +) (%'"2.!%(+/%) *+) "/ ,1!($*+2) *'"2) ,') !" +"(%'($!") *+) ,-LW: dans ces
organelles. Cependant, ces travaux ne permettent pas de conclure 2/%),-!%$9$"+)*+ ,') !" +"(%'($!")*-LM:)*'"2)

92
les granules N4) 5") +##+(;) m\fW) (%'"2.!%(+%'$() $"*$##1%+&&+"() ,-LM:) +() ,-LW:4) ^%) ,-LM:) .,'7/+(('$%+) +2()
presque intégralement localisé dans les granules denses plaquettaires ce qui suggère :

- soit la présence un transporteur 2.1 $#$7/+)*+),-LM:)7/$) !" +"(%+%'$() +)"/ ,1!($*+)*'"2),+2)9%'"/,+2)

N au dépend du milieu intra-cellulaire,
- 2!$()/")'/(%+)&1 '"$2&+)7/$).+%&+((%'$(),')2G"(AE2+)*+),-LM:)*$%+ (+&+"()*'"2),+2)9%'"/,+2)N4)Dans
+) '2) ,-LM:) .!/%%'$() .%!3+"$%) *+) ,') *19%'*'($!") *+) ,-LW:) 2/$(+) 8) ,-' ($!") *-/"+) +"FG&+) *+) (G.+)
nucléotidase.

\!/2)'3!"2).!/%2/$3$),+2)$"3+2($9'($!"2).!/%)2'3!$%)2$),-+6.%+22$!")et/ou la localisation de la protéine VNUT

étai(en)t perturbée(s) chez le propositus (SJ). Les immunoempreintes (Western blot) réalisées sur le lysat
.,'7/+(('$%+)*+)"!(%+).'($+"()"-!"() +.+"*'"()&$2)+")13$*+" +)'/ /"+)'"!&',$+)*+)('$,,+)!/)*-+6.%+22$!")*+),')
protéine (Figure 41).

Figure 41 : Immuno-empreintes (Western blot) réalisées sur un lysat de plaquettes témoin ou de plaquettes du
patients SJ
A gauche, on retrouve la présence de la protéine VNUT (55 KDa) sur le lysat de plaquettes témoin et chez le
1#+,'/+=! !03.,+'(!)4$+,),*#+,./!04$/!#/+,%.31*!0,3,"<!%./+3'!)#! Glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase
7X 65IA!1'3-'+!0'!-./+3'3!2$'!)4'913'**,./!0'!)#!13.+<,/'!UVWK!/4'*+!1#*!0,-,/$<'!%&'Y!)'!1#+,'/+!GZ=!

5") .,/2) *+) ,-1(/*+) *+) ,-+6.%+22$!") *+) ,') .%!(1$"+) m\fW;) "!/2) (%'3'$,,!"2) ' (/+,,+&+"() 8) ,-1(/*+) *+) ,')
localisation de la protéine en microscopie électronique à transmission. La mise au point des immuno-
marquages /($,$2'"(),-'"($ !%.2)'"($-m\fW) !/.,1)8)*+2)0$,,+2)*-!%)*+3%'$().+%&+((%+)*-$*+"($#$+% rapidement
une éventuelle localisation atypique de la protéine.

5"#$";)"!/2)'3!"2)2!,,$ $(1),-17/$.+)*+)S'Y'&!(!)(Sakamoto et al., 2014) qui a généré récemment des souris

]^).!/%),').%!(1$"+)m\fW;)'#$")*-!0(+"$%)7/+,7/+2)'"$&'/6)'/),'0!%'(!$%+4)?+((+)17/$.+)"+)#'$().'2)&+"($!")
*-/") 7/+, !"7/+) .A1"!(G.+) A1&!%%'9$7/+) A+F) +2) 2!/%$2;) +() $,) 2+%'$() 2$&.,+) +( %'.$*+) *-+##+ (/+%) *+2)

93
'9%19'($!"2).,'7/+(('$%+2)+()/")*!2'9+)*+)"/ ,1!($*+2) A+F) +2)'"$&'/6).!/%) !" ,/%+)8),-$&.,$ '($!")*+)m\fW)
A+F),')2!/%$2;)*'"2),+)2(! Y'9+)*+),-LM:)*'"2),+2 granules denses plaquettaires.

3.5.2.3 8$90$590$)*+un deuxième gène candidat

@-Aypothèse de digénisme et ,')&$2+)+")13$*+" +)*-/"+)&/('($!")*/)9E"+)SLC17A9 chez notre propositus et

chez sa mère nous a conduits à rechercher une mutation présente chez le père du propositus et transmise aux
trois enfants atteints. En appliquant cette hypothèse de transmission et en sélectionnant les gènes codant des
protéines impliquées dans le métabolisme plaquettaire, nous avons pu identifier 24 gènes candidats qui sont
actuellement e") !/%2)*-+6.,!%'($!")TFigure 42).

Figure 42 : Liste des gènes candidats qui présentent des mutations chez le père du propositus (SF) ainsi que
chez les trois enfants atteints (SJ, SCH et SM)

Parmi ces gènes, deux retiennent particulièrement not%+)'((+"($!")+()#+%!"(),-!0<+()*-/"+)1(/*+)'..%!#!"*$+ :

ENTPD2 qui code pour une ectonucléotidase qui dégra*+),-LW:)+")LM:)+(),-LM:)+")LI: (Wink et al., 2006)
et le gène LYST déjà présenté dans le cadre des syndromes de Chediak-Higashi.

@-1(/*+)*/)9E"+)ENTPD2 .'22+%')*-'0!%*).'%)/")reséquençage complet du gène. Les mutations confirmées

pourront alors être reproduites dans un vecteur plasmidique bactérie")7/$).+%&+((%'),-+6.%+22$!")*+2).%!(1$"+2)
sauvages ou mutées. Des expériences évaluant la cinétique de dégradation des nucléotides seront alors
effectuées afin de mettre en évidence un éventuel déficit fonctionnel de cette nucléotidase.

@-1(/*+)*/)9E"+ LYST passera également par un séquençage complet associé à une étude biochimique de la
protéine directement sur les lysats plaquettaires provenant des patients. Des immunomarquages en microscopie
électronique seront également réalisés 2/%),+)&'(1%$+,)' (/+,,+&+"()*$2.!"$0,+)8),-5dS)L,2' + '#$")*-1(/*$+%),')
localisation de la protéine.

94
3.6 Recherche des gènes impliqués dans la maladie du pool vide non
syndromique : conclusion/discussion

\!/2)'3!"2)*!" )$*+"($#$1)'/) !/%2)*+) +((+)1(/*+)/"+)#'&$,,+)*!"()(%!$2)&+&0%+2)2!"().!%(+/%2)*-/"+)&','*$+)

du pool vide avec déficit isolé en ADP. Le séquençage *-+6!&+s réalisé chez tous les membres de la famille
a permis de mettre en évidence une mutation hétérozygote faux-sens dans une partie très conservée du gène
codant pour le transporteur de nucléotides VNUT. Cette mutation a été trouvée chez notre propositus et chez
2')&E%+4)M'"2),-AG.!(AE2+)*-/")*$91"$2&+;)/")'/(%+)9E"+) '"*idat est actuellement recherché pour expliquer
le phénotype observé chez les membres de la famille porteurs de N-SPD. Deux gènes candidats retiennent
actuellement notre attention : ENTPD2 qui code pour une nucléotidase et LYST qui code pour une protéine peu
connue impliquée dans le trafic des organelles cellulaires. Une anomalie fonctionnelle de la nucléotidase
(ENTPD2) p!/%%'$() .+%&+((%+) *-+6.,$7/+%) ,+) .A1"!(G.+) !02+%31. En effet, une anomalie du transport des
nucléotides VNUT (ATP et ADP) lié à une mutation de SLC17A9 associée à un déficit de *19%'*'($!")*-LW:)
en ADP '/)2+$")*+2)9%'"/,+2)N)expliquerait le déficit profond en ADP retrouvé chez les patients. Le deuxième
gène candidat particulièrement intéressant est le gène LYST. En effet, les mutations homozygotes du gène LYST
ont été identifiées dans les maladies de Chediak-Higashi. _,)"!/2).'%'$()*!" )$"*$2.+"2'0,+)*+)31%$#$+%)7/-/"+)
&/('($!")A1(1%!FG9!(+)*/)9E"+)@OSW)"-est pas impliquée dans certaines #!%&+2)"!")2G"*%!&$7/+2)*+)N-SPD
comme celle identifiée dans la famille S.

Cependant, compte tenu du rôle supposé de la protéine VNUT dans la concentration des nucléotides dans les
granules N;),')%+ A+% A+)*-/"+)'/(%+)'"!&',$+)91"1($7/+)*/)9E"+)SLC17A9 7/$)"-'/%'$().'2)1(1)(%!/31+)'/) !/%2)
*/)217/+"k'9+)*-+6!&+)*!$()c(%+)+"3$2'91+4)@+)217/+"k'9+) !&.,+().'%)&1(A!*+)*+)Sanger a été récemment
réalisé chez tous les membres de la famille S)&'$2)"-').'2)&$2)+")13$*+" +)*+)&/('($!")2/..,1&+"('$%+)*'"2)
la séquence codante du gène SLC17A9. @-1(/*+)91"1($7/+)2+%')*!" )poursuivie par la %+ A+% A+)*-'"omalie
dans les introns du gène et dans les séquences régulatrices4)M'"2) +)0/(;),-/($,$2'($!")*+)(+ A"$7/+)*-AG0%$*'($!")
génomique comparative sera un outil détermin'"(4)5"#$";)"!/2)3+"!"2)*-$*+"($#$+%)/"e nouvelle famille dont
au moins quatre membres répartis sur trois 91"1%'($!"2)2!"()'((+$"(2)*-/"+)&','*$+)*/).!!,)3$*+)*+).%12+"tation
similaire à la famille S. Le séquençage du gène SLC17A9 sera réalisé prochainemen(4)5"),-'02+" +)*-'"!&',$+)
*+)m\fW)*'"2) +((+)"!/3+,,+)#'&$,,+;)/")217/+"k'9+)*-exome sera également réalisé et les données obtenues
seront croisées avec celles provenant de la famille S. La compilation des données de séquençage provenant
des deux famille2).!/%%')"!/2).+%&+((%+)*+)2+,+ ($!""+%)*+)"!/3+'/6)9E"+2) '"*$*'(2)7/$)"-'/%'$+"().'2).p)
être soupçonnés avec les données obtenues uniquement chez la famille S.

95
4 Diagnostic et caractérisation des thrombopathies :
discussion et perspectives

Ce mémoire de (AE2+)*-/"$3+%2$(1)').!/%)!0<+ ($#).%$" $.',)*+)*$2 /(+%)*+2)2(%'(19$+2)' (/+,,+&+"()/($,$21+2)*'"2)

les laboratoires et les unités de recherche pour identifier et caractériser les thrombopathies non étiquetées ainsi
que pour rechercher les nouveaux gènes impliqués dans la physiopathologie de ces maladies. Le travail
.%12+"(1)*'"2) +)&'"/2 %$()')1(1)%1',$21)'/),'0!%'(!$%+)*-A1&!2('2+)2.1 $',$21)*+),-5dS)L,2' +)7/$).!22E*+)/"+)
convention avec les Hôpitaux Universitaires de Strasbourg pour le diagnostic des maladies plaquettaires ainsi
q/-'/) 2+$") *+) ,-/"$(1) _\S5KI) fIK) Slbl4) @+) ,'0!%'(!$%+) *-A1&!2('2+) 2.1 $',$21) *+) ,-5dS) L,2' +) +2()
également associé au CHU de Nancy dans le cadre du Centre de Compétences des Pathologies Plaquettaires
T??::V) .!/%) ,-+6.,!%'($!") +() le suivi des patients atteints de thrombopathies. Grâce à cette démarche
coopérative, nous avons pu explorer *+./$2)HaBh;)+"3$%!")bCa).'($+"(2)2/2.+ (12)*-c(%+)'((+$"(2)*-'"!&',$+2)
plaquettaires responsables de syndromes hémorragiques de sévérité variable. Au cours de ces explorations,
'/ /"+)'"!&',$+).,'7/+(('$%+)"-')./)c(%+)&$2+)+")13$*+" +) A+F)+"3$%!")baR)*+2).'($+"(24)L),-$"3+%2+;)HQR)
des patients étudiés présentaient des déficits fonctionnels correspondant à des pathologies connues : maladie
de Glanzmann, maladie de Bernard-Soulier, syndrome MYH9. Cependant pour environ 35% des patients
+6.,!%12;) '/ /") *$'9"!2($ ) .%1 $2) "-') +" !%+) ./) c(%+) 1('0,$) 0$+") 7/+) *+2) '"!&',$+2) #!" ($!""+,,+2) +(e!/)
morphologiques aient été mises en évidence. Ces pathologies, qui englobent de nombreux cas de thrombopénie
familiale avec ou sans macrocytose plaquettaire ainsi que des anomalies fonctionnelles variées, sont
actuellement en cours de caractérisation au laboratoire.

Nous avons choisi de présenter dans ce mémoire de docto%'(),+2)(%'3'/6),+2).,/2)'3'" 12) !" +%"'"()*-/"+)
part trois nouvelles mutations du récepteur P2Y12 +()*-'/(%+).'%(),-1(/*+)*-/"+)#'&$,,+)*!"()(%!$2)&+&0%+2)2!"()
'((+$"(2)*-/"+)&','*$+)*/).!!,)3$*+)"!")2G"*%!&$7/+4

@-1(/*+)+(),') 'ractérisation de la mutation p.His187Gln du récepteur P2Y12 a été réalisée à la fois sur des
.,'7/+((+2)#%'$ A+2)+()2/%)*+2) +,,/,+2)*-'2(%! G(!&+)A/&'$")("-+6.%$&'"().'2 le récepteur de manière native)
transfectées avec le récepteur muté ou sauvage. Cette étude a également permis de confirmer le rôle essentiel
des expériences de liaison utilisant un nouveau ligand radiomarqué et sélectif du récepteur P2Y12 [3H]PSB-
0413. Cependant les deux autres mutations identifiées au laboratoire (p.Tyr259Cys et p.Phe95Ser) nous
rappellent que ces expériences de liaison ne sont applicables à la caractérisation du récepteur P2Y12 que si le
[3H]PSB-0413 peut effectivement interagir avec son site de liaison au sein du récepteur. En effet, ces deux
mutations touchant des acides aminés essentiels pour la liaison des ligands nucléotidiques au récepteur P2Y12
"-!"().'2)+" !%+)./)c(%+) '%' (1%$21+2)*'"2)notre modèle cellulaire '%),-+6.%+22$!")&+&0%'"'$%+)*/)%1 +.(+/%)
sur les cellules transfectées "-') ./) c(%+) !"#$%&1e. 5") ,-'02+" +) *+) &/('($!") +"(%'inant un déficit majeur
*-+6.%+22$!" */)%1 +.(+/%)T.'%)$"2+%($!")*-/") !*!")SW^:).'%)+6+&.,+V;),a poursuite des investigations sur
ces deux mutations nécessitera la transfection de récepteurs (sauvages et mutés) marqués par une séquence

96
HA permettant une utilisation *-anticorps monoclonaux dirigés contre la séquence HA à la fois en cytométrie
en flux et en immunofluorescence. Après avo$%)31%$#$1),-'02+" +)*-+##+( *+),-$"2+%($!")*+) +((+)217/+" +)XL)
2/%) ,') #!" ($!") */) %1 +.(+/%) 2'/3'9+;) "!/2) .!/%%!"2) 1(/*$+%) ,-+6.%+22$!";) ,') ,! ',$2'($!") +() ,') 2$9"',$2'($!")
associée à ces récepteur variants.

@-$*+"($#$ '($!")*+) +2)"!/3+'/6)3'%$'"(2) A+F)*+2).'($+"(2).%12+"('"()*+s syndromes hémorragiques assez

modérés nous amène également à une réflexion sur le potentiel hémorragique réellement lié à la présence des
'"!&',$+2)*/)%1 +.(+/%) A+F),+2).'($+"(24)5")+##+(;)$,)'..'%'$() ,'$%+&+"(;)*-'.%E2),+2)*!""1+2)!0(+"/+2) A+F)
deux p'($+"(2) 1(/*$12) +") *1('$,2) T,-/") '/) ,'0!%'(!$%+;) .'($+"() ___-B;) ,-'/(%+) A+F) "!2) !,,E9/+2) $(',$+"2) +()
',,+&'"*2V)7/+),').%12+" +)*-/"+)&/('($!")A!&!FG9!(+)'0!,$22'"() !&.,E(+&+"(),')(%'"2*/ ($!")*/)2$9"',)+")
'3',) */) %1 +.(+/%) +2() %+2.!"2'0,+) *-/"+) A$2(!$%e hémorragique constamment présente et parfois sévère. Le
phénotype observé en présence de la mutation homozygote p.His187Gln est similaire à celui des patients
.%1 1*+&&+"() *1 %$(2) .!/%) c(%+) .!%(+/%2) *+) &/('($!") +"(%'$"'"() /"+) '02+" +) *-+6.%+22$!") */) %1 +pteur
(Hollopeter et al., 2001) (Conley, 2001). Le dépistage et le diagnostic précis des anomalies du récepteur P2Y12
est donc indispensable chez les patients présentant un déficit sévère afin de prévoir une prise en charge
médicale adaptée à leur pathologie. Cependant, en cas de mutation hétérozygote, le potentiel hémorragique lié
8) +((+)'"!&',$+)+2()&',) !""/4)M-'.%E2)"!(%+)+6.1%$+" +;)*'"2) +%('$"2) '2;),+)2G"*%!&+)A1&!%%'9$7/+)+2()
suffisamment important pour motiver une consultation spécialisée et une étude poussée des fonctions
.,'7/+(('$%+24) :'%) '$,,+/%2;) &c&+) 2$) ,+2) .'($+"(2) .!%(+/%2) *-/"+) &/('($!") A1(1%!FG9!(+) "+) .%12+"(+"() 7/-/")
.A1"!(G.+)A1&!%%'9$7/+)&!*1%1;),-'**$($!")*+)#' (+/%2)*+)%$27/+2)2/..,1&+"('$%+2)T !"9énitaux ou acquis)
(+"*%') 8) &'<!%+%) #!%(+&+"() ,+) .A1"!(G.+4) ?-+2() ,+) '2) A+F) ,+) .'($+"() ?J:) .!/%) ,+7/+,) ,+2) '"!&',$+2)
#!" ($!""+,,+2)'22! $1+2)8),')&/('($!")A1(1%!FG9!(+).4WG%HQl?G2)2!"()#!%(+&+"()&'<!%1+2).'%),').%$2+)*-/")
traitement antiplaquettaire de type aspirine. En présence de ce type de traitement, il est probable que des
hémorragies provoquées chez ces patients pourraient devenir importantes et difficiles à contrôler. Enfin, la
fréquence des anomalies du récepteur P2Y12 *'"2),').!./,'($!")91"1%',+)"-+2().'2) !""/+)8) +)<!/%)+()$,)+2()
+"3$2'9+'0,+)7/+)*+)"!&0%+/2+2).+%2!""+2)2!$+"().!%(+/2+2)*+)&/('($!"2)7/$)"-+"(%'$"+"().'2)*+)2G"*%!&+)
hémorragique suffisant pour motiver une consultation spécialisée aboutissant à la mise en évidence ces
3'%$'"(24)@-+6.%+22$!")*+),').'(A!,!9$+)"1 +22$(+%'$()',!%2)/")*+/6$E&+)#' (+/%)*+)%$27/+) !"2($(/($!""+,)!/)
environnemental pour déclencher des hémorragies anormalement importantes. Afin de connaitre le vrai
potentiel hémorragique associé à la présence de variants du récepteur, des études épidémiologiques seraient
nécessaires pour évaluer la fréquence de ces variants et du risque hémorragique qui leur est associé dans la
population générale.

Nous avons également présenté le travail réalisé dans le cadre de la recherche des gènes impliqués dans les
&','*$+2)*/).!!,)3$*+)2'"2).%12+"('($!")2G"*%!&$7/+4)@+)217/+"k'9+)*-+6!&+2)+##+ (/1) A+F)2$6)&+&0%+2)
*-/"+)#'&$,,+) *!"()(%!$2) &+&0%+2) 2!"() .!%(+/%2) *+) ,') .'(A!,!9$+) "!/2) ') .+%&$2)*+) &+((%+) +")13$dence une
mutation faux-sens du gène SLC17A9 codant pour le transporteur de nucléotides VNUT récemment identifié
sur la membrane des granules denses plaquettaires. Cette mutation présente chez le propositus et chez son père

97
"-+6.,$7/+).'2) !&.,E(+&+"(),+).hénotype observé chez trois des quatre enfants de la famille (famille S). Nous
re A+% A!"2) *!" ) ' (/+,,+&+"() *-/"+) .'%( une autre mutation du gène SLC17A9 dans les séquences non
couve%(+2) .'%) ,-'"',G2+) *-+6!&+;) +() *-'/(%+) .'%( un autre gène candidat qui po(+"($',$2+%'$() ,-'"!&',$+)
fonctionnelle de l').%!(1$"+)m\fW),$1+)8),')&/('($!")*1<8)*1 !/3+%(+4):'%)'$,,+/%2;)"!/2)3+"!"2)*-$*+"($#$+%)au
laboratoire une deuxième famille (famille H) *!"()'/)&!$"2)7/'(%+)&+&0%+2)2!"()'((+$"(2)*-/"+)&','*$+)*/)
pool vide de présentation similaire à la pathologie observée dans la famille S. Le séquençage du gène SLC17A9
2+%')*-/"+)$&.!%('" +) %/ $',+).!/%) !"#$%&+%),-AG.!(AE2+)2+,!"),'7/+,,+),+)(%'"2.!%(+/%)m\fW)2+%'$()$&.,$7/1)
dans la pathologie. Enfin;) ,+) 217/+"k'9+) *-+6!&+) 7/$) 2+%') %1',$21) A+F) ,-$"(19%',$(1) *+2) &+&0%+2) *+) +((+)
nouvelle famille nous permettra de compiler les données de séquençage obtenues chez nos deux familles afin
de renforcer ou infirmer nos hypothèses actuelles.

?!&&+)"!/2)'3!"2)./),+)3!$%;),+2)N-SPD correspondent à une entité de thrombopathies très hétérogène. Les

travaux qui débutent actuellement au laboratoire sur une nouvelle famille confirment cette complexité. En
effet, dans le cadre des réunions du CCPP de la partie Est de la France, nous avons exploré une jeune femme
de 23 ans présentant un syndrome hémorragique ayant nécessité à plusieurs reprises une couverture
.,'7/+(('$%+),!%2)*-$"(+%3+"($!"s A$%/%9$ ',+24)@-1(/*+)*+2).,'7/+((+2)*+),').'($+"(+)').+%&$2)*+)*$'9"!2($7/+%)
une maladie du pool vide associée à un déficit majeur en ADP (rapport ATP/ADP > 10) et à une absence
complète de granules denses !/)8),').%12+" +)*+)9%'"/,+2)N)+6(%c&+&+"()*Gstrophiques dans les plaquettes
(Figure 43).

Contrairement aux membres atteints des familles S et H, ce((+) .'($+"(+) 2+&0,+) *!" ) .!%(+/2+) *-/") N-SPD
'%' (1%$21).'%)/"+)'02+" +)*+)9%'"/,+2)N)!/).'%)des anomalies morphologiques majeures des 9%'"/,+2)N4)Le
*!2'9+)*+),')21%!(!"$"+)+(),+2)(+2(2)*-$" !%.!%'($!"e21 %1($!")*+)21%!(!"$"+)%'*$!&'%7/1+)7/$)2+%!"()+##+ctués
permettront de poursuivre la caractérisation de la pathologie chez notre propositus. La collaboration avec les
,$"$ $+"2)*+),-$"(+%%19$!")52()"!/2).+%&+()' (/+,,+&+"()*+)%+ !"2(%/$%+),-'%0%+)91"1',!9$7/+)*+),')#'&$,,+4)5")
effet, une partie des indiv$*/2) +2() 2/$3$+) 8) P+2'"k!") ',!%2) 7/+) ,-'/(%+) .'%($+) !"2/,(+) 3+%2) M$<!"4) @')
collaboration actuelle dans le cadre du Centre de Compétences des Pathologies Plaquettaires +(),-A'%&!"$2'($!")
des techniques de dépistage de cette pathologie .+%&+((%') *-$*+"($#$+%) .%1 $21&+"() ,+2) .'($+"(2) .!%(+/%2) *+)
,-'"!&',$+)#!" ($!""+,,+)+() +,')2'"2)#'$%+)*1.,' +%),+2).'($+"(2)8)S(%'20!/%94)f"+)#!$2),-$*+"($#$ '($on précise
des patients réalisée;)/")217/+"k'9+)*-+6!&+).!/%%')c(%+)+##+ (/1)'#$")*+)%+ A+% her les gènes impliqués dans
+((+)#!%&+)*+)N-SPD.

98
Figure 43 : MQ*'3;#+,./!'/!-,%3.*%.1,'!<)'%+3./,2$'!0'*!1)#2$'++'*!04$/'!1#+,'/+'!#++',/+'!04$/'!-#)#0,'!0$!
pool vide non syndromique avec rapport ATP/ADP > 10
On note une quasi absence de granules denses ou la présence de granules denses très fortement dystrophiques
où )4./!/'!1'$+!1)$*!-'++3'!'/!<;,0'/%'!)#!Y./'!%'/+3#)'!/.3-#)'-'/+!.1#2$'!#$9!<)'%+3./*!%./+'/#/+!$/'!+3:*!
forte concentration de calcium.

De nombreuses autres thrombopathies sont explorées dans le cadre du centre de compétence Grand-Est. Nous
avons en particulier mis en évidence ces trois dernières années deux cas de déficit en GPVI chez deux patients
différents. Les explorations morphologiques et fonctionnelles ont été effectuées à Strasbourg alors que les
études protéiques ont été prises en charge .'%),-17/$.+)*/):%!#+22+/%)I'%($"+)J'"*%!(-:+%%/2)8),-Xq.$(',)P$ A'(
(INSERM UMR 1148). Un des patients explorés présentait un syndrome des plaquettes grises découvert il y a
.,/2$+/%2)'""1+24)M+3'"(),').%12+" +)*-/")2G"*%!&+)A1&!%%'9$7/+)&'<+/%)!02+%31)2/$(+)8)/")(%'$(+&+"().'%)
'2.$%$"+;) "!/2) '3!"2) &$2) +") 13$*+" +) /"+) '02+" +) !&.,E(+) *-'9%19'($!") $"*/$(+) .'%) ,+) !,,'9E"+) +() ,')
convulxine associée à diminution très importante *-+6.%+22$!")de la GPVI objectivée en cytométrie en flux.
Les immunoempreintes réalisées à Strasbourg et à Paris ont mis en évidence une diminution environ 80 % de
,-+6.%+22$!")*+ la GPVI, de son fragment intra-cytoplasmi7/+)+()*+),') A'$"+)r)*/)%1 +.(+/%)'/)#%'9&+"()d )
des immunoglobulines (Figure 44).

99
Figure 44 : [--$/.-#32$#"'*!3<#),*<*!*$3!0'*!)P*#+*!0'!1)#2$'++'*!04$/!+<-.,/!.$!04$/!1#+,'/+!#++',/+!04$/!
syndrome des plaquettes grises associé à un déficit en GPVI
!"#$%&'(!)4$+,),*#+,./!04$/!#/+,%.31*!7\ZB]A!0,3,"<!%./+3'!)#!1#3+,'!extracellulaire de la GPVI met en évidence
$/!0<J,%,+!04'/;,3./!^_!`!04'913'**,./!0'!)#!13.+<,/'=! !03.,+'(!)4$+,),*#+,./!04$/!#/+,%.31*!0,3,"<!%./+3'!)#!
partie intracytoplasmique 0'!)#!13.+<,/'!%./J,3-'!)'!0<J,%,+!'/!X6U[!#).3*!2$'!)4#/+,%.31*!0,3,"<!%./+3'!)#!
%&#,/'!a!0$!3<%'1+'$3!#$!J3#"-'/+!b%!0'*!,--$/.").Q$),/'*!-./+3'!2$'!%'++'!%&#,/'!/.3-#)'-'/+!#**.%,<'!>!
la GPVI est également absente.

La diminution A!&!9E"+)*+),')[:m_)+()*+),') A'$"+)'22! $1+)13!7/+%'$()2!$()/").%! +22/2)*-$"(+%"',$2'($!")

!"<!$"()2!$()/")*1#'/()*-+6.%+22$!") !"<!$"(4)?+) '2).%!che de celui publié par Nurden P et al (Nurden et al.,
2004) est actuellement en cours *+) '%' (1%$2'($!"4)@-'"',G2+)*+)0$!,!9$+)&!,1 /,'$%+)+2()+##+ (/1+) A+F),+)M%)
K+&$)d'3$+%)',!%2)7/+),-1(/*+)*/)&1 '"$2&+) !"*/$2'"()8)/")*1#$ $()+")[:m_)*'"2),+) '*%+)*-/")2G"*%!&+)*+2)
plaquettes grises sera effectuée à Strasbourg.

Par ailleurs, nous avo"2)2'$2$),-!..!%(/"$(1)*-c(%+),! ',$212)*'"2)/") +"(%+)*+)(%'"2#/2$!")2'"9/$"+).!/%)13',/+%)

la prévalence de certains gènes impliqués dans des thrombopénies congénitales. En effet, les sites de
prélèvements des différents établissements de transfusion sanguine (ETS) sont régulièrement amenés à mettre
en évidence des thrombopénies modérées et récurrentes dans la population des donneurs de sang. Cependant,
la prévalence des anomalies génétiques conduisant à ces thrombopénies est encore inconnue dans la population
générale et en particulier chez les donneurs volontaires. Dans ce contexte, trois ETS régionaux (Alsace, Centre
Atlantique (Pr Py) et Bretagne (Pr Férec, Dr Guéguen)) se sont associés pour conduire une étude ayant pour
objectif *-$*+"($#$+%) ,') .%13',+nce des mutations de 17 gènes connus pour être impliqués dans des
thrombopénies *'"2),').!./,'($!")*+2)*!""+/%2)*+)2'"94)@-LM\)*+2 donneurs thrombopéniques sera obtenu
.'%) ,-$"(+%&1*$'$%+) *-/") .%1,E3+&+"() 2',$3'$%+) 7/$) 2+%') (%'"2#1%1) '/),'0!%'(!$%+) *+) 91"1tique de Brest pour

100
extraction et séquençage. Les données épidémiologiques seront compilées par le Professeur Py et les études
fonctionnelles plaquettaires seront réalisées préférentiellement à Strasbourg. Cette étude dite ABC (pour
Alsace, Bretagne, Centre Atlantique) a été déclarée aux instances nationales réglementaires et est enregistrée
'/.%E2)*+),-L9+" +)\'($!"',+)*+)S1 /%$(1)*/)I1*$ '&+"()+()*+2).%!*/$(2)*+)2'"(1)TL\SIV)2!/2),+)"/&1%!)
RCB : 2014-A00002-45.

Bien que le laboratoire dispose déjà de nombreux outils qui nous permettent de conduire des projets de
recherche 3'%$12;),')&$2+)+").,' +)*-/")217/+" +/%)8)A'/()*10$( nous permettrait de répondre à la demande
croissante nécessaire au diagnostic des thrombopathies. En effet, les techniques de séquençage par méthode
de Sanger sont de moins en moins adaptées à notre besoin de séquençage pour les gènes de grande taille (MYH9
et NBEAL2 par exemple) ou pour des panels de gènes4)@-/($,$2'($!")*+) +((+)(+ A"!,!9$+)"1 +22$(+rait alors de
définir un panel de gènes impliqués dans les thrombopathies connues. Cet outil pourrait être utilisé de deux
manières différentes :

- en regroupant les patients en attente de 217/+"k'9+) *+) 9E"+2) !""/2) +") ,$&$('"() ,-'"',G2+) 0$!-
informatique associée au gène concerné
- e") %+ A+% A'"() ,+2) '"!&',$+2) *+) .,/2$+/%2) 9E"+2) '"*$*'(2) *'"2) ,+) '*%+) *+) ,-+6.,!%'($!") *+)
(A%!&0!.'(A$+2).!/%),+27/+,,+2)/")9E"+)/"$7/+)"+).+/()c(%+)2/2.+ (14)?-+2(),+) '2)"!('&&+"().!/%),+2)
macrothrombopénies familiales pour lesquelles des anomalies fonctionnelles sont rarement mises en
évidence et qui nécessitent donc la recherche de mutation des plusieurs gènes incluant ACTN1, MYH9,
TUBB1, FLNA, NBEAL2 et GFI1B.

Compte tenu du cout relativement modéré et de la possibilité de séquencer plusieurs mégabases chez plusieurs
individus en une seule manipulation, les séquençages réalisés sur des séquenceurs à haut débit nous
permettraient de pouvoir mettre en évidence de manière très rapide de nombreuses mutations présentes sur des
gènes déjà identifiés dans les (A%!&0!.'(A$+24)?+.+"*'"(;),')%1',$2'($!")*+)217/+"k'9+2)*-+6!&+s complets ou
de génomes complets particulièrement adaptée à la recherche de nouveaux gènes impliqués dans les
(A%!&0!.'(A$+2;)"1 +22$(+;)+").,/2)*+),-$"3+2($22+&+"()$"$($',)$&.!%('"(;)*+2) !&.1(+" +2)0$!-informatiques
poussées pour le traitement des giga-octets de données générées durant les analyses. L#$") *-!.($&$2+%)
,-/($,$2'($!") *+) +2) &' A$"+2) +() *+2) !&.1(+" +2) "1 +22'$%+2) 8) ,-'"',G2+) *+2) *!""1+2) 0%/(+2;) $,) '..'%'$(
$"*$2.+"2'0,+)*+)2-'*%+22+%)'/6)9%'"*+2).,'(+#!%&+2)*+)217/+"k'9+)+6$2('"(+2)T,+)[1"!2 !.+)8)53%G;),-_"2($(/()
de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire à Illkirch, ou des sociétés privées comme Integragen©).

En parallèle, la mise en commun des données obtenues lors des explorations plaquettaires complexes
nécessaires à la caractérisation des thrombopathies non étiquetées permet *-$*+"($#$+% des anomalies
fonctionnelles similaires chez des patients non apparentés et dispersés géographiquement. Cette force
collaborative est actuellement indispensable à la compréhension de la physiopathologie des maladies
plaquett'$%+2)+()8),-1('0,$22+&+"()*+)%+ !&&'"*'($!"s pour le diagnostic de ces nouvelles entités dont nous ne
connaissons pas la fréquence. En effet, c!&&+)"!/2),-'3!"2)13!7/1).%1 1*+&&+"(;),+2)*$##1%+"(2),'0!%'(!$%+2)

101
2.1 $',$212) *'"2) ,-1(/*+) *+2) (A%!&0!.'(A$+2) &anquent encore de standardisation dans leur démarche
diagnostique (Gresele et al., 2014)4) @-!%*%+) *'"2) ,+7/+,) 2!"() %1',$212) ,+2) +6'&+"2 au cours des visites
successives des patients;) ,+) (G.+) *-+6'&+"2;) ,+) (G.+) +() ,+2) !" +"(%'($!"2) *-'9!"$2(+s utilisés au cours des
1.%+/3+2)*-'9%19'($!n plaquettaire ou de cytométrie en flux sont autant de facteurs qui influencent les profils
des anomalies plaquettaires observées chez les patients. Plusieurs équipes, tentent actuellement de proposer
une démarche générale et cohérente applicable dans tous les laboratoires (Cattaneo et al., 2013) (Carubbi et
al., 2014) (Gresele and Subcommittee on Platelet, 2015). Le CRPP avait déjà proposé dès 2008, des protocoles
*-+6.,!%'($!")%+ !&&'"*12).!/%)la standardisation de la réalisation des agrégations plaquettaires en PRPc.
Mais ces deux documents uniquement focalisés 2/%),+2)(+2(2)*-'9%19'($on méritent une mise à jour et doivent
être complétés en accord avec les consensus internationaux établis. Très récemment, P. Gresele (Gresele and
Subcommittee on Platelet, 2015) %+.%12+"('"() ,+) !&$(1) *+) 2('"*'%*$2'($!") *+) ,-ISTH a proposé une suite
*-+6'&+ns de première, deuxième et troisième intention permettant le diagnostic des thrombopathies.
Cependant, ces recommandations peuvent paraitre irréalisables pour certains laboratoires +").'%($ /,$+%)2$),-!")
considère que les examens de microscopie électronique doivent être effectués dès la deuxième visite du patient.
M'"2) +) '2;) ,-$&&+"2+) &'<!%$(1) *+2) ,'0!%'(!$%+2) "+) .!/%%'$() .'2) #!/%"$%) ,-+"2+&0,+) *+2) $"#!%&'($!"2)
nécessaires à la caractérisation optimale des thrombopathies. Par ailleurs, comme avait tenté de le faire le
CRPP en 2008-Haal;)$,)"-G)').'2)2+/,+&+"()/"+)"1 +22$(1)8)*!""+%)/"+)A$1%'% A$2'($!")*+2)+6'&+"2)8)+##+ (/+%)
mais surtout à standardiser les techniques utilisées. En ce sens, le document proposé par P. Gresele ne répond
pas à la problématiqu+) *+2) ,'0!%'(!$%+2) 7/$) 2!"() !"#%!"(12) 7/!($*$+""+&+"() 8) ,-$*+"($#$ '($!") *$##$ $,+) *+2)
thrombopathies. Concernant les agrégations plaquettaires, une définition des agonistes principaux et des
concentrations utilisées est indispensable. De la même manière, les clones des anticorps utilisés en cytométrie
+") #,/6) '$"2$) 7/+) ,+2) !"*$($!"2) *+) 2($&/,'($!") *+2) .,'7/+((+2) */%'"() ,+2) (+2(2) *-' ($3'tion devraient être
homogénéisés. @-A'%&!"$2'($!")*+) +2)(+ A"$7/+2).+%&+((%'$()'$"2$)*-$*+"($#$+%),+2)(A%!&0!.'(A$+2)*e manière
!"2+"2/+,,+)'#$")*-!%$+"(+%),+2)+6'&+"2) !&.lémentaires de manière efficace vers les centres spécialisés. Par
'$,,+/%2;),+)*13+,!..+&+"()*+2)+6'&+"2)%1',$2'0,+2)8)*$2('" +)'/(!%$2+),-1(/*+)&!%.A!,!9$7/+)*+2).,'7/+((+2)
sans que le patient ait à se déplacer. Ainsi, nous travaillons, en collaboration avec le Dr Bordet (CHU de Lyon)
8),-/($,$2'($!" *-/"+)(+ A"$7/+)*+)#$6'($!")*+2).,'7/+((+2)+"):K: )7/$).+%&+(),-envoi de matériel vers les centres
équipés de ces microscopes très couteux et difficiles à manier. Cette possibilité devrait permettre de construire
rapidement un véritable atlas de la morphologie des plaquettes de ,-+"2+&0,+) *+2) (A%!&0!.'(A$+2)
diagnostiquées.

Cette démarche globale incluant des études fonctionnelles standardisées et réalisées sur des plaquettes fraiches
+")'9%19!&1(%$+)+()+") G(!&1(%$+)+")#,/6)'$"2$)7/-/"+)1(/*+)&!%.A!,!9$7/+).!/221+)+")&$ %!2 !.$+)!.($7/+)+()
électronique .+%&+((%')*-!%$+"(+%),+)*$'9"!2($ )*+2)(A%!&0!.'(A$+2)*+)&'"$E%+).%1 $2+ et consensuelle. En nous
appuyant sur la faisabilité des différents examens dans le contexte actuel, et compte tenu du travail présenté

102
dans ce mémoire, nous proposons ainsi un arbre décisionnel adapté au diagnostic des anomalies des voies de
,-LM:)'/) !/%2)*+),-' ($3'($!").,'7/+(('$%+ (Figure 45).

Figure 45 : 3Q3'!0<%,*,.//')!0<0,<!#$!0,#"/.*+,%!0'*!#/.-#),'*!0'*!;.,'*!0'!)4 56!#$!%.$3*!0'!)4#%+,;#+,./!

des plaquettes.

?!"(%'$%+&+"()'/6)%+ !&&'"*'($!"2)*+):4)[%+2+,+)+()*+),-_SWX)+()+").%+"'"()+") !&.(+),')#'cilité et le faible

coû()*-/")217/+"k'9+)*/)9E"+)P2RY12 "!/2).%!.!2!"2)+"(%+)'/(%+)*-+##+ (/+%),+)91"!(G.'9+)*/)9E"+) A+F)(!/2)
,+2).'($+"(2).%12+"('"()/"+)'"!&',$+)&'<+/%+)*+),-'9%19'($!").,'7/+(('$%+)$"*/$(+).'%),-LM:4)@-+"2+&0,+)*+2)
tests complémentaires permettant la caractérisation des pathologies devra néanmoins être réalisé dans des
centres spécialisés.

5"#$";)0$+")7/+),-'%2+"',)(A1%'.+/($7/+)8)*$2.!2$($!")*+2) ,$"$ $+"2)2!$(),$&$(1)+") '2)*-A1&!%%'9$+)*/+)8)/"+)

'"!&',$+) *+2) .,'7/+((+2) 2'"9/$"+2;) ,-1('0,$22+&+"() *+) .%!(! !,+2) *+) .%$2+) +") A'%9+) 2.1 $#$7/+) 8) +2)
pathologies est une nécessité. Ainsi le CRPP organise des réunions pluri-annuelles pour discuter des cas les
.,/2) !&.,+6+2)+().'%('9+%),-+6.1%$+" +)*+) A' /"4):'%)'$,,+/%2;)*+2)1(/*+2)$"(+%"'($!"',+2) !,,'0!%'($3+2)!"()
été réalisées récemment ou sont toujours en cours pour évaluer les risques hémorragiques réels liés aux
différentes pathologies plaquettaires. Ainsi, une publication récente sur le suivi et la prise en charge des
grossesses chez les femmes atteintes de thrombopénie congénitale (Noris et al., 2014b) a permis de montrer
q/+) ,+) %$27/+) A1&!%%'9$7/+) A+F) ,') &E%+) +() ,-+"#'"t était essentiellement corrélé aux antécédents

103
A1&!%%'9$7/+2)*+),').'($+"(+)+()8)2')"/&1%'($!").,'7/+(('$%+)'/)&!&+"()*+),-' !/ A+&+"(4)f"+)*+/6$E&+)
1(/*+)7/$) .!%(+) 2/%) ,-13',/'($!") */) %$27/+) A1&!%%'9$7/+) aux cours des interventions chirurgicales chez les
.'($+"(2)'((+$"(2)*+)*1#$ $()#!" ($!""+,).,'7/+(('$%+)')#'$(),-!0<+()*-/"+).%12+"('($!"),!%2)*/)*+%"$+%) !"9%E2)*+)
,')2! $1(1)+/%!.1+""+)*-A1&'(!,!9$+4)?+((+)1(/*+)+" !%+)"!")./0,$1+) !"#$%&+)7/+),+)%$27/+ hémorragique est
corrélé au type de thrombopathie identifiée et au score hémorragique initial. Une troisième étude internationale
3+"'"() *+) !&&+" +%) ') .!/%) !0<+ ($#) *-+##+ (/+%) ,+) 2/$3$) *+2) 1.$2!*+2) A1&!%%'9$7/+2) +() *+2) (%'$(+&+"(2)
associés chez les patients atteints de thrombopathie congénitale.

\!/2)'3!"2)+22'G1)*'"2) +)&1&!$%+)*+)(AE2+)*-/"$3+%2$(1)*+)*!""+%)/")'.+%k/)*+2) !""'$22'" +2)' (/+,,+2)2/%)

la physiopathologie des thrombopathies étiquetées. Ces thrombopathies correspondent à des pathologies dont
,+).A1"!(G.+)+2()%+,'($3+&+"()2$&.,+)+()2!/3+"(),$&$(1)8)/")2G"*%!&+)A1&!%%'9$7/+)&'$2)*!"(),-!%$9$"+)+2()
2!/3+"() !&.,+6+4) L$"2$;) *+2) *$F'$"+2) *+) 9E"+2) +() *+) .%!(1$"+2) '22! $1+2) .+/3+"() c(%+) %+2.!"2'0,+2) *-/"+)
anomalie fonctionnelle ou morphologique l'7/+,,+) 2+%') %+2.!"2'0,+) *-/") *1#$ $() *+) ,-A1&!2('2+) .%$&'$%+4)
5"#$";) ,-1(/*+) *+2) .'($+"(2) .%12+"('"() /") *1#'/() #!" ($!""+,) .,'7/+(('$%+) +2() /"+) 2!/% +) *-$"#!%&'($!")
indispensable pour la compréhension de la physiopathologie des thrombopathies et la mise en évidence des
principaux acteurs de la physiologie plaquettaire dite normale.

104
 R ❡✘✙❡

Apport des modèles murins dans

les thrombopénies constitutionnelles

Contribution of mouse ❘esume

Les thrombopenies constitutionnelles resultent d’anomalies de production des
models in constitutional plaquettes sanguines (thrombopoı̈! ese) d’origine hereditaire. Les connaissances
thrombocytopenia autour de ces maladies, longtemps mal diagnostiquees et peu etudiees, ont
considerablement augmente ces vingt derni! eres annees. L’essor des
techniques de biologie moleculaire permettant l’identification des mutations
et la culture de megacaryocytes provenant de patients, permise par la
Catherine Leon, Arnaud Dupuis,
Christian Gachet, François Lanza
decouverte de la thrombopoı̈etine, ont grandement contribue ! a ces progr!es.
UMR S949, Inserm, Strasbourg, F-67065, Parall!element, la manipulation des g! enes dans la souris (transgen! ese,
France inactivation totale ou conditionnelle, creation de mutations ponctuelles
Etablissement français du sang-Alsace reproduisant les mutations humaines, mutagen! ese chimique aleatoire) a
(EFS-Alsace), Strasbourg, F-67065, France
Universite de Strasbourg, Strasbourg, permis de creer des mod! eles de maladies qui ont grandement contribue au
F-67000, France decryptage des tableaux cliniques et biologiques presentes par les patients. La
Federation de medecine translationnelle plupart des thrombopenies pour lesquelles le g! ene mute a ete identifie ont
de Strasbourg (FMTS), Strasbourg,
F-67065, France
maintenant un mod! ele d’etude murin. La mise en relation des donnees
obtenues dans ces mod! eles et dans les cellules isolees de patients a abouti ! a
<[email protected]> une meilleure comprehension des pathologies et des mecanismes normaux de
production des plaquettes. Il reste que pr! es de la moitie des thrombopenies
constitutionnelles sont encore non etiquetees. L’essor du sequençage ! a haut
debit du genome devrait augmenter le nombre de g! enes candidats que la
generation de nouveaux mod! eles murins permettra de confirmer comme cause
de la maladie.
♥ Mots cles : thrombopenie hereditaire, megacaryocytopoı̈!ese, plaquettes, mod!eles
murins

❆✓✔✕✖act
Constitutional thrombocytopenia result from platelet production abnormalities
of hereditary origin. Knowledge about these long misdiagnosed and poorly
studied diseases has increased considerably in the last twenty years. Improved
molecular biology techniques applied to identify mutations in patients and
megakaryocyte culture, made possible by the discovery of thrombopoietin,
have significantly contributed to this progress. In parallel, genetic manipulation
in the mouse (transgenesis, total or conditional inactivation, introduction of
point mutations, or random chemical mutagenesis) allowed the generation of
disease models in order to decipher patient clinical and laboratory features.
Almost all of the thrombocytopenias where the mutated genes have been
identified have now a murine model counterpart, either in the form of total
gene inactivation or after introduction of the human mutation. Data obtained
in these models, together with those from isolated patients’ cells, have
increased our understanding of the corresponding diseases and also of the
doi: 10.1684/hma.2015.1067

normal mechanisms of platelet production. At present, the genetic

determinants of thrombocytopenia remain unknown in 40 to 50% of the

Hematologie Pour citer cet article : Leon C, Dupuis A, Gachet C, Lanza F. Apport des mod!eles murins dans
les thrombopenies constitutionnelles. Hematologie 2015 ; 21 : 262-279. doi : 10.1684/
hma.2015.1067
Tires !a part : C. Leon

✷✗✷ Hematologie
vol. 21 n8 5, septembre-octobre 2015

⑧ !✁✂✄ ☎✆✝✝✞✟ ✠✡☛✁☞✞✌☞✍ ✎✏✑✒

 Les mod!
eles murins de thrombopenie

cases. Currently available high-speed sequencing techniques, allowing in

particular sequencing of complete genomes or exomes will undoubtedly help
in the identification of new candidate genes. These will in turn allow
generation of murine models to confirm and further study the abnormal
phenotype.
✚ Keywords: hereditary thrombocytopenia, megakaryocytopoiesis, platelets, mouse
models

es thrombopenies constitutionnelles resultent de Les modèles murins

L mutations genetiques affectant la production des
plaquettes. Ces pathologies rares sont encore sous- Les modèles transgéniques
diagnostiquees, en particulier chez l’adulte, car elles
Avec plus de soixante-dix ans d’etude genetique classique, la
restent peu connues et d’expression tr!es variable. Le
souris represente un excellent mod! ele des maladies
diagnostic de thrombopenie auto-immune est encore
hereditaires humaines. Les progr! es de la genetique et des
souvent retenu !a tort, conduisant !a une prise en charge
techniques de biologie moleculaire realises ces trente
inadaptee des patients avec, parfois, une splenectomie
derni!eres annees permettent de creer quasiment « ! a
inappropriee. Le diagnostic des thrombopenies congeni-
façon » des mod! eles de souris mimant les maladies
tales passe par une analyse cytologique et fonctionnelle des ! travers la mutagen!
humaines. A ese ciblee et la transgen!
ese,
plaquettes realisees presque uniquement dans des labo-
on dispose maintenant de toute une panoplie de souris :
ratoires specialises. Par ailleurs, environ 50 % des
thrombopenies associees ou non !a une thrombopathie – les souris knock-out total sont generees par inactiva-
restent !a ce jour non etiquetees [1]. Dans les cas ou ! les tion du g! ene dans la totalite de l’organisme,
etudes plaquettaires orientent le diagnostic vers une – les souris knock-out conditionnel permettent l’inac-
pathologie connue, la mise en evidence de mutations tivation du g! ene dans un tissu donne ou ! a un moment
dans la sequence des g!enes suspectes confirme alors la precis du developpement, gr^ ace !
a l’utilisation d’enzymes
pathologie. de recombinaison d’ADN, le plus souvent une cre
La comprehension des mecanismes physiopathologiques recombinase, exprimee sous contro ^le du promoteur
conduisant aux thrombopenies congenitales a longtemps d’inter^
et.
repose uniquement sur l’observation des megacaryocytes Dans le cas de l’etude des thrombopenies, le syst! eme Mx-
presents dans la moelle osseuse. La necessite de Cre est le plus utilise pour exciser une portion d’ADN ! a un
prel!evements medullaires invasifs et la rarete de ces stade choisi du developpement. La cre recombinase est sous
cellules (moins de 1 % des cellules de la moelle) ont contro^le du promoteur ubiquitaire de la proteine
longtemps freine les etudes. La culture de megacaryocytes Mx1 (MyXovirus resistance 1) inductible par l’interferon.
!a partir de progeniteurs hematopoı̈etiques circulants est L’administration d’interferon a ou b permet d’induire la
maintenant possible mais reste confinee aux laboratoires recombinaison dans tous les tissus ! a n’importe quel stade du
de recherche et seuls quelques rares patients ont ete developpement. Le degre de deletion du g! ene varie selon le
explores de cette mani!ere. Le developpement recent de la tissu, probablement en raison du nombre de cellules
reprogrammation genetique de cellules souches pluripo- sensibles !a l’interferon qui sont presentes ou de la diffusion
tentes induites (iPS) et de leur differenciation de l’interferon dans chaque organe. Pour obtenir une
megacaryocytaire a permis des avancees, mais ces deletion specifique de la lignee megacaryocytaire, le
syst!emes in vitro restent imparfaits et ne reproduisent syst!
eme Pf4-Cre developpe par le groupe de Radek Skoda
pas fid!element l’ensemble des etapes conduisant ! a la est quasiment le seul ! a avoir ete utilise [2]. La recombinase
formation des plaquettes. Le developpement d’outils est sous contro ^le du promoteur Pf4, permettant la
permettant de manipuler genetiquement la souris permet recombinaison dans la lignee megacaryocytaire, d! es le
maintenant de disposer de mod!eles in vivo mimant ces stade I de differentiation des megacaryocytes, avec un
differentes pathologies et permettant l’evaluation de retentissement dans toutes les plaquettes circulantes [2, 3].
l’impact des mutations sur la production et les fonctions Cette recombinaison est observee essentiellement dans la
plaquettaires. lignee megacaryocytaire, avec toutefois une recombinaison
L’objectif de cette revue est de faire le point sur l’apport des possible dans certains leucocytes, dependant de l’etat
mod!eles de souris existants dans la comprehension et le inflammatoire des souris, dont il faut tenir compte pour une
traitement de ces maladies. interpretation correcte des donnees [3],

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 – les souris knock-in permettent l’introduction de La formation des plaquettes
mutations ponctuelles ou de petites insertions/deletions
par recombinaison homologue au locus d’inter^ et. Ces Différenciation et maturation du
mod"eles reproduisent fid"element la mutation presente mégacaryocyte
chez l’homme et representent la meilleure approche pour
modeliser la pathologie. Bien evidemment ces differentes Chez l’homme comme chez la souris, les plaquettes
approches, et tout particuli"erement le knock-in, sont sanguines sont formees majoritairement " a partir des
basees sur la conservation des g"enes et de la fonction entre cellules souches hematopoı̈etiques multipotentes (CSH)
l’homme et la souris. localisees au sein de la moelle osseuse. Le processus est
complexe et passe par une succession d’etapes de
proliferation, de differenciation et de maturation des
Les modèles avec mutations spontanées megacaryocytes " a partir des CSH. Au cours de la
ou provoquées maturation, les progeniteurs megacaryocytaires subissent
Comme l’homme, la souris est une esp"ece sujette aux plusieurs cycles d’endomitose aboutissant " a la formation
mutations spontanees. Toutefois, les mutations spon- de cellules geantes (> 50 mm) et de polyploı̈des (pouvant
tanees etant des evenements rares et non previsibles, les aller jusqu’"
a 128N). En parall"ele, le cytoplasme s’agrandit
strategies augmentant la frequence des mutations considerablement et un reseau de membranes internes
accroissent statistiquement la possibilite d’induire des extr^emement complexe et structure se developpe. Ce
anomalies dans les g"enes d’inter^et. Dans ce but, plusieurs reseau, appele syst" eme de membranes de demarcation
programmes de mutagen"ese chimique par traitement des (DMS pour demarcation membrane system), sert de
gam"etes "a la N-nitroso-N-ethyl-uree, suivie de methodes reserve membranaire pour la formation de longues
de criblages phenotypiques systematiques ont ete mis en projections, appelees proplaquettes, qui, apr" es liberation
place. Associee au sequençage ADN "a haut debit, cette dans la circulation, se remod" eleront pour former les
technologie a permis recemment l’identification de plaquettes (figure 1) [12, 13]. Les proteines du cytosque-
nouveaux g"enes impliques dans le processus de formation ^le cle dans l’extension des proplaquettes
lette jouent un ro
des plaquettes [4-7]. Cette approche pourrait permettre et la formation des plaquettes. C’est le cas des micro-
d’orienter le criblage vers de nouveaux g"enes chez les tubules dont la polymerisation et le glissement condition-
patients presentant des thrombopenies congenitales non nent l’elongation des proplaquettes et la formation de
etiquetees. plaquettes discoı̈des [14-16]. L’actomyosine joue
Les mod"eles de souris representent ainsi une approche egalement un ro ^le cle dans la differenciation
incontournable pour approfondir la comprehension des megacaryocytaire et le nombre de proplaquettes liberees
mecanismes mis en jeu dans le processus de formation des par megacaryocyte [17-19]. Plusieurs types de throm-
plaquettes. Ainsi le nombre de mod"eles disponibles a-t-il bopenies congenitales resultent ainsi de mutations dans
considerablement augmente depuis dix ans [8]. Tout en des g" enes affectant directement ou indirectement le
restant complementaires des etudes faites chez les cytosquelette (tableau 1).
patients, les souris mutantes constituent des outils precieux
Régulation de la mégacaryopoı̈èse
pour clarifier les processus physiologiques de base et servir
de mod"eles pour des etudes experimentales et des essais La megacaryopoı̈" ese est regulee tout au long de ces
precliniques pouvant conduire au developpement de differentes etapes, ce qui permet de contro ^ler la prolifera-
nouveaux traitements. tion des progeniteurs, leur engagement et leur differencia-
Dans le cadre de cette revue, nous evoquerons bri" evement tion en megacaryocytes matures et la liberation des
les etapes et les points cles de la formation des plaquettes plaquettes. Ceci implique l’action concertee d’un certain
en mettant l’accent sur le ro^le de certaines proteines si"
eges nombre de facteurs parmi lesquels des cytokines et facteurs
des mutations impliquees dans les thrombopenies congeni- de croissance, dont la thrombopoı̈etine (TPO), qui joue un
tales. Nous developperons ensuite les differentes throm- ^le majeur, ainsi qu’un certain nombre de facteurs de
ro
bopenies constitutionnelles pour lesquelles l’apport des transcription (figure 2). Plusieurs de ces acteurs sont la cible
mod"eles animaux a ete essentiel dans la comprehension et/ de mutations responsables de thrombopenie (tableau 1).
ou le traitement. Pour une description plus approfondie de La TPO agit via le recepteur MPL, dont la signalisation
la pathologie humaine, le lecteur est invite "a se referer " a aboutit "
a la modulation de l’expression des g" enes impliques
d’excellentes revues [9-11] ainsi qu’"a la banque de donnees en differents points du processus de differenciation/
OMIM1 (numero d’entree dans le tableau 1). maturation megacaryocytaire. Elle joue un ro ^le dans la
survie des CSH, leur engagement et leur differenciation
vers la voie megacaryocytaire [20]. Il n’est donc pas
1
Online Mendelian Inheritance in Man etonnant que les patients presentant des mutations

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 Les mod"
eles murins de thrombop!enie

❚✦✧★✩✦✪ 1. Récapitulatif des thrombopénies congénitales et des modèles murins disponibles. OMIM (Online
Mendelian Inheritance in Man ; AD, autosomal dominant ; AR, autosomal récessif ; MDS, syndrome myélodys-
plasique. Chiffre plaquettaire d’après Noris et al. [160] ; *, d’après [161].
Maladie (abréviation) Transmission# Gène Symptômes modèles murins
N8OMIM (chromosome) (chiffre plaquettaire
 SD)(x109/L)

Anomalies du cytosquelette
Maladies liées au MYH9 AD MYH9 (22q12-13) Plaquettes géantes (35  25,9) Inactivation totale [27, 28]
(MYH9-RD) Inclusions dans les leucocytes Inactivation tissu-spécifique [30]
et/ou néphropathie, cataracte, Knock-in [33, 34]
surdité
Syndrome Bernard-Soulier #231200 GP1BA (17p13) Plaquettes géantes (41  34,6) Inactivation totale Gp1ba [41]
- Biallélique (AR) AR GP1BB (22q11) Grosses plaquettes (87  30,2) Inactivation totale Gp1bb [42, 43]
- Monoallélique(AD) AD GP9 (3q21) Knock-in Gp1ba avec partie
extracellulaire IL4R [46]
Syndrome Wiskott-Aldrich Lié à l’X WAS (Xp11) Petites plaquettes (61  64,7) Inactivation totale [59-61]
#301000 Immunodéficience sévère Knock-in Y293 [53]
#313900
Thrombopénie liée à la Liée à l’X FLNA (Xq28) Grosses plaquettes (34  12,7) Inactivation tissu-spécifique [74]
filamine A #nd
Thrombopénie liée à la AD TUBB1 (6p21.3) Plaquettes géantes (82  44,7) Inactivation totale [77]
tubuline b1 #nd
Thrombopénie liée à AD ACTN1 (14q24) Grosses plaquettes (87  31,7) Pas de modèle murin
l’a-actinine #nd
Mutations affectant la voie
TPO-cMPL
Thrombopénie congénitale AR MPL (1p34) Plaquettes taille normale Inactivation totale [83, 84]
amégacaryocytaire (CAMT) #604498 (13  4,7) Inactivation tissus-spécifique [93]
Evolution vers aplasie
médullaire
Mutations affectant les
facteurs de transcription
Thrombopénies liées liées à l’X GATA1 (Xp11) Grosses plaquettes (24  9,8) Inactivation totale [99]
à GATA1 #300367 Anémie Knock-in d’une partie du
#314050 promoteur (Gatalow) [102]
Amégacaryocytose avec AD HOXA11 (7p15-14) Plaquettes taille normale (30) Inactivation totale [111, 112]
synostose radiocubitale #605432 Synostose radio-ulnaire
 autres défauts
Maladie familiale AD RUNX1 (21q22) Plaquettes de taille normale Inactivation totale [119, 120]
plaquettaire avec #601399 (103  35,9) Inactivation conditionnelle
prédisposition à la leucémie Développement possible (Mx-Cre) [121-124]
€ (FPD/AML)
myéloı̈de aigue de leucémie ou MDS Inactivation conditionnelle
(Pf4-cre) [128]
Syndrome de Paris-Trousseau AD Délétion (11q23-ter) Plaquettes de taille normale Inactivation totale Fli1 [131)
Syndrome de Jacobsen #188025 incluant FLI-1 (49  9,9) Knock-in avec Fli-1 tronqué [133]
#600588
#147791
Thrombopénie liée à GFI1B AD GFI1B (9q34.13) Grosses plaquettes (97  24,7) Inactivation totale [139]
#nd Diminution du nombre Inactivation conditionnelle
de granules a (Mx-cre) [140]
Inactivation conditionnelle
(inductible par doxycycline) [140]
Autres mutations
Syndrome des plaquettes AR NBEAL2 (3p21.1) Thrombopénie qui s’aggrave Inactivation totale [147-150]
grises #139090 avec l’âge (55  21,3)
Myélofibrose et splénomégalie
(Suite)

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 ✮✯✰✱✲✯✳ 1. (Suite )
Maladie (abréviation) Transmission# Gène Symptômes modèles murins
N8OMIM (chromosome) (chiffre plaquettaire
 SD)(x109/L)

Thrombopénie liée à AD ANKRD26 (10p2) Plaquettes taille normale Inactivation totale [154, 156]
ANKRD26 / Thrombopénie #313900 (43  28,4)
familiale 2 (THC2) Développement possible
de leucémie ou MDS
Thrombopénie avec AR RBM8A (1q21.1) Thrombopénie qui tend à se Pas de modèle murin
absence de radius #274000 normaliser chez l’adulte (19)
(TAR) Plaquettes de taille normale
Aplasie radiale bilatérale
 autres malformations

affectant la voie TPO-MPL developpent soit une throm- – GATA1 : les membres de la famille GATA qui sont des
bopenie sev!ere, soit une thrombocytose, selon que la proteines ! a doigt de zinc, forment un complexe avec le
mutation entraı̂ne une perte ou un gain de fonction. facteur commun FOG1 ( friend of GATA1). Un certain
^le essentiel tout au
Les facteurs de transcription jouent un ro nombre de thrombopenies resultent de mutations dans le
long de la megacaryopoı̈!ese, !a la fois dans l’engagement g!ene codant GATA1, et une mutation ponctuelle dans le
des progeniteurs vers leur lignage et dans la regulation du site de liaison de GATA1 au niveau du promoteur du g! ene
programme transcriptionnel determinant la maturation des codant la GPIbb (GPIBB) entraı̂ne une forme de syndrome
megacaryocytes [21]. Les megacaryocytes derivent d’un de Bernard et Soulier [22],
progeniteur bipotent megacaryocytaire-erythrocytaire – RUNX1 (AML1), un facteur de transcription de la famille
(MEP), necessitant l’activation coordonnee de g! enes RUNT qui agit avec son cofacteur CBFB (core-binding
specifiquement megacaryocytaires et l’inactivation des factor, b subunit), joue egalement un ro ^le important dans
facteurs de transcription selectifs de la lignee erythroı̈de la differenciation megacaryocytaire ! ^le dans
a travers son ro
(figure 2). Parmi les facteurs de transcription cles mutes la regulation de l’expression de proteines du cytosquelette
dans certaines thrombopenies congenitales, on peut citer : et de constituants plaquettaires. Certaines mutations dans

Cellule souche Mégacaryocyte

hématopoïétique immature
Plaquettes
circulantes

Mégacaryocyte
mature

Moelle osseuse

❙✴✵✶

Figure 1. Schema recapitulant les principales etapes de la megacaryocytopoı̈e !se. Apre!s differenciation a! partir de la cellule souche
hematopoı̈etique, le megacaryocyte subit une serie d’endomitoses aboutissant !a une cellule geante polyploı̈de. Le cytoplasme subit egalement une
phase de maturation au cours de laquelle les granules sont synthetises ainsi que les membranes internes qui s’organisent en un reseau complexe.
Aux stades ultimes, le megacaryocyte etend des projections cytoplasmiques dans le vaisseau sinusoı̈de pour y liberer les plaquettes. (Schema de
Fabien Pertuy).

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 Les modeles murins de thrombop!enie

CSH

MPP

EPO
EPO
CMP TPO
IL-3 GATA2
EPO IL-6 C/EBPα
TPO IL-11
MEP IL-3
IL-6 GATA1
IL-11 PU.1

4✺✻✼✽✾✿❀❁❂✺ TPO
SCF
Progéniteur
mégacaryocytaire GATA1 érythrocytaire
FOG1
TAL1
GATA1
FOG1
RUNX1
TAL1
TPO
Fli1
NFE2 Mégacaryocyte
SRF
MKL1

Autres lignées myéloïdes Lignées lymphoïdes

Monocytes Lymphocytes T
Macrophages Lymphocytes B
Cellules dendritiques Lymphocytes NK

Polynucléaires neutrophiles
Polynucléaires éosinophiles
Polynucléaires basophiles

Plaquettes Érythrocytes

Figure 2. H!ematopoı̈ese et engagement m!egacaryocytaire. Sch!ema r!ecapitulant les principales cytokines (rouge) et facteurs de transcription (bleu)
r!egulant la m!egacaryopoı̈ese, dont certains sont les cibles de mutations responsables de thrombop!enie chez l’homme. MPP, MultiPotent
Progenitor ; CMP, Common Myeloid Progenitor ; MEP, Megakaryocyte-Erythrocyte Progenitor. (Sch!ema de Fabien Pertuy).

RUNX1 aboutissent a une thrombop!enie associe!e a un Les genes impliqu! es responsables de plusieurs throm-
risque !elev!e de d!evelopper une my!elodysplasie et une bop!enies ont ainsi !et!
e identifi!
es, et des modeles murins
leuc!emie, existent pour la plupart des maladies r!epertori!
ees a ce jour
– Fli-1, un facteur de la famille ETS (E26 transformation- (tableau 1).
specific or E-twenty six) dont le site de liaison est pr!
esent
dans la plupart des promoteurs m!egacaryocytaires.
Certaines mutations dans le gene Fli-1 sont responsables
Mutations affectant le cytosquelette
des syndromes Paris-Trousseau et Jacobsen,
Maladies liées au MYH9
– HOXA11, membre de la famille des genes homeobox,
mut!e chez les patients pr!esentant une am!egacaryocytose Le gene MYH9 code la chaı̂ne lourde de la myosine non
avec synostose radio-cubitale. musculaire IIA (NMMHC-IIA, pour non-muscle myosin

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 heavy chain IIA) et les mutations presentes dans ce ge !ne la myosine IIA dans l’oreille interne sugg! ^le de cette
ere un ro
sont responsables de plusieurs syndromes comprenant proteine dans le developpement et le maintien de la
l’anomalie de May-Hegglin, le syndrome de Sebastian, le fonction auditive [29].
syndrome de Fechtner, le syndrome d’Epstein et certaines L’inactivation du g!ene murin selectivement dans la lignee
presentations du syndrome d’Alport. Depuis le debut megacaryocyto-plaquettaire reproduit la macrothrom-
des annees deux mille, date de l’identification du bopenie presente chez les patients [30]. L’absence de
g!ene responsable, ces maladies ont ete collectivement myosine abolit le changement de forme contractile des
renommees « syndrome MYH9 » et sont les causes les plus plaquettes ainsi que la retraction du caillot, avec pour
frequentes de thrombopenies constitutionnelles. Il s’agit consequence in vivo une diminution de la stabilite du
d’une maladie autosomale dominante, caracterisee par thrombus [30]. Par ailleurs, ce mod! ele a permis de proposer
une thrombopenie associee !a une macrocytose plaquet- un certain nombre de pistes expliquant les anomalies de
taire, et par la presence ou non de pseudo-corps de Do €hle formation de plaquettes chez les patients MYH9. Une
dans les leucocytes. Ces inclusions sont formees ! a partir mortalite importante des megacaryocytes au sein de la
d’agregats de ribosomes et de myosine anormalement moelle ainsi qu’une anomalie de developpement du
dimerisee. Selon le type de mutation, la macrothrom- syst!eme de demarcation membranaire (DMS pour demar-
bopenie peut s’accompagner de l’apparition progressive cation membrane system) ne permettant pas une extension
d’une insuffisance renale, d’une cataracte et/ou d’une normale des proplaquettes expliquent vraisemblablement
surdite neurosensorielle. La comparaison genotype-pheno- la thrombopenie [17, 18]. De mani! ere moins attendue, ces
type a permis de correler la presence de mutations dans le souris ont egalement permis d’attribuer ! a la myosine un
domaine moteur N-terminal avec, d’une part, la probabilite ^le dans la repartition des granules plaquettaires [31].
ro
de developper des manifestations non hematologiques et Enfin, une etude preclinique des effets ! a long terme du
d’autre part avec la severite de la thrombopenie [23, 24]. romiplostim, un agent thrombopoı̈etique de deuxi! eme
Celle-ci est directement correlee avec la severite des generation, a montre une augmentation de la myelofibrose
manifestations hemorragiques : faible dans la majorite des secondaire au traitement chez les souris Myh9-/- [32].
cas, mais pouvant aller, chez une minorite de patients, Le developpement plus recent, par deux equipes
jusqu’!a necessiter une transfusion. independantes, de souris knock-in recreant des mutations
Il existe trois isoformes de myosine non musculaire presentes chez des patients permet maintenant de disposer
de type II (IIA, IIB et IIC) mais seule la myosine IIA de mod! eles se rapprochant davantage de la pathologie
persiste dans les stades tardifs de differenciation humaine [33, 34]. Dans les deux cas, les souris
megacaryocytaire et dans les plaquettes, expliquant le heterozygotes developpent, en sus de la macrothrom-
phenotype plaquettaire congenital. Au cours de la bopenie, les manifestations non plaquettaires ! a savoir la
differenciation megacaryocytaire, l’expression de myosine presence d’agregats intracytoplasmiques de myosine dans
IIB est normalement reprimee par le facteur de transcrip- les leucocytes, une insuffisance renale, une perte auditive
tion RUNX1 [25]. La persistance de myosine IIB caracterise et une cataracte. Toutefois, la correlation genotype-
les patients thrombopeniques presentant des mutations phenotype observee chez l’homme n’est pas retrouvee
dans RUNX1 [25, 26]. dans ces mod! eles murins [33]. Malgre ces differences, ces
Plusieurs mod!eles de souris ont ete developpes pour souris restent d’excellents mod! eles pour etudier les
etudier les maladies liees au MYH9 et le ro^le possible de la mecanismes alteres dans les plaquettes des patients ainsi
myosine IIA dans leurs differentes manifestations. Les que les mecanismes physiopathologiques des defauts
souris avec inactivation totale du g!ene Myh9 (knock-out) renaux, auditifs et visuels.
ne sont pas viables !a l’etat homozygote et meurent au
stade embryonnaire E7.5 malgre la presence de myosine
^le unique des differentes isoformes de Maladie de Bernard-Soulier
IIB, confirmant un ro
myosine II [27, 28]. L’absence de myosine IIA aux stades La maladie de Bernard-Soulier (BSS) est une maladie
precoces du developpement perturbe en particulier les autosomale recessive dans sa forme classique, caracterisee
jonctions serrees et les jonctions adherentes, entraı̂nant par une thrombopenie et par la presence de plaquettes
ainsi une desorganisation cellulaire de l’embryon [28]. Les geantes. [35, 36]. Il existe egalement une forme mono-
souris heterozygotes sont viables et se reproduisent quasi allelique dominante qui est habituellement plus moderee,
normalement [27, 28]. La macrothrombopenie n’est pas avec une faible thrombopenie et des plaquettes de grande
observee, ni le phenotype renal, suggerant que l’haplo- taille, mais pas ou peu de saignements [37]. La maladie
insuffisance n’explique pas !a elle seule la plupart des resulte de mutations dans les g!
enes codant l’une des sous-
sympto ^mes des patients. En revanche, un tiers des souris unites du complexe GPIb-V-IX (GP1BA, GP1BB, ou GP9). Le
heterozygotes developpent une surdite mesuree par complexe GPIb-V-IX est le recepteur du facteur Willebrand
reponse auditive du tronc cerebral [27]. L’expression de (vWF) qui joue un ro ^le cle dans les premi!eres phases

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 Les mod!
eles murins de thrombopenie

d’adhesion des plaquettes au sous-endothelium lese. Dans des plaquettes. Ceci explique probablement l’absence de
la forme classique biallelique, les mutations entraı̂nent patients BSS lies !a un defaut de la GPV [47].
une quasi-absence d’expression du complexe en surface Les mod! eles de souris BSS ont egalement permis de realiser
[36, 38], associant !a la macrothrombopenie un defaut des etudes precliniques. Les souris Gp1bb-/- sont resistantes
fonctionnel des plaquettes, d’ou ! la severite de la maladie. !
a la thrombose dans plusieurs mod! eles in vitro et in vivo, et
La forme monoallelique entraı̂ne une diminution d’expres- la fonction procoagulante de leurs plaquettes est forte-
sion d’environ 40 % et une alteration moderee, voire nulle, ment diminuee [45, 48, 49]. Enfin, l’utilisation de souris
de la fonction plaquettaire [37]. Gp1ba-/- et de souris transgeniques exprimant la GPIba
Alors que l’absence de complexe GPIb-V-IX explique le humaine a contribue ! a faire la preuve de concept qu’une
defaut fonctionnel des plaquettes, les mecanismes ! a maladie genetique plaquettaire pouvait ^ etre corrigee par
l’origine de la macrothrombopenie ne sont pas totalement therapie genique [50, 51].
elucides. Les etudes in vitro !a partir de cultures de
progeniteurs hematopoı̈etiques de patients mono- ou
Syndrome de Wiskott-Aldrich et thrombopénie
bialleliques sugg!erent que la differenciation des
liée à l’X
megacaryocytes n’est pas affectee. En revanche, la
capacite de ces megacaryocytes !a former des proplaquet- Le syndrome de Wiskott-Aldrich (WAS) et la forme
tes est diminuee de 50 % dans la forme monoallelique moderee dite « thrombopenie liee ! a l’X » (XLT pour X-
[39], et une quasi-absence de proplaquettes est observee linked thrombocytopenia) resultent de mutations mono-
dans les cultures de progeniteurs de patients bialleliques, ou biallelique du g!ene WAS, localise en Xp11.22, codant la
expliquant la thrombopenie [40]. proteine WASp (Wiskott-Aldrich syndrome protein). Les
Differents mod!eles de souris BSS ont ete developpes et ont mutations non-sens, les insertions-deletions ou les muta-
permis d’avancer dans la comprehension des mecanismes tions complexes aboutissent ! a une proteine tronquee,
sous-jacents qui mettraient en cause les proteines du absente ou non fonctionnelle et entraı̂nent un WAS sev! ere
cytosquelette. Parmi les mod!eles developpes, l’inactivation caracterise par une thrombopenie associee ! a une appari-
totale du g!ene codant la GPIba [41] ou la GPIbb [42, 43] tion progressive de deficits immunitaires sev! eres et
reproduit le phenotype hemorragique ainsi que la macro- d’eczema, et ! a une augmentation de l’incidence des
thrombopenie et le defaut d’extension proplaquettaire. La maladies auto-immunes et malignes [52, 53]. Les muta-
diminution de formation des proplaquettes pourrait tions faux-sens aboutissent generalement au syndrome
resulter en partie d’un defaut de maturation des XLT [54, 55]. La proteine WASp est exprimee exclusive-
megacaryocytes, caracterise notamment par des anomalies ment dans les cellules hematopoı̈etiques et joue un ro ^le cle
dans le developpement du DMS observe dans les cellules dans la regulation du cytosquelette intracellulaire.
in situ [41, 42, 44, 45]. Un troisi!eme mod!ele murin a ete Son absence entraı̂ne une thrombopenie sev! ere micro-
genere par insertion d’un transg!ene correspondant ! a un cytaire (typiquement moins de 10 % de la numeration
recepteur chimerique compose d’une partie extracellulaire, plaquettaire normale), associee ! a des manifestations
le recepteur de l’interleukine 4 (IL-4), fusionnee !a la partie hemorragiques graves, les plus sev! eres etant des saigne-
transmembranaire et intracellulaire de la GPIba [46]. Apr! es ments intracr^ aniaux, gastro-intestinaux et oraux, causes
croisement avec des souris deficientes en GPIba, le majeures de morbidite et de mortalite.
complexe est capable de s’exprimer !a la membrane. Le On a longtemps pense que la thrombopenie resultait
nombre de plaquettes circulantes est augmente et la taille essentiellement d’une diminution de la duree de vie des
plaquettaire reduite en comparaison des souris Gp1ba-/-. plaquettes, qui est de moins de 24 h chez les patients et
Ces donnees ont permis de suggerer un ro ^le important de comparable ! a celle observee lors de la transfusion de
la partie intracellulaire dans la regulation du nombre et de plaquettes WAS chez des receveurs temoins [56, 57].
la taille des plaquettes, vraisemblablement par interaction Le nombre des megacaryocytes dans la moelle osseuse de
avec le cytosquelette d’actine via la liaison de filamine A patients est normal, voire augmente, ecartant l’hypoth! ese
[46]. Des defauts d’organisation ou de dynamique du d’un defaut de production. Enfin, in vitro, les
cytosquelette microtubulaire pourraient egalement rendre megacaryocytes differencies ! a partir de cellules CD34+
compte de la macrothrombopenie. En effet, l’absence du de patients ont une ultrastructure classique et une capacite
complexe entraı̂ne une augmentation du nombre de !
a emettre des proplaquettes normales [58]. Les plaquettes
microtubules dans les proplaquettes, ainsi qu’un suren- produites en culture etant de taille normale, la microcytose
roulement des spires de microtubules dans les plaquettes observee chez les patients pourrait resulter de la
circulantes [45]. Enfin, les souris inactivees pour le g! ene reorganisation anormale du cytosquelette plaquettaire
GP5 ont montre que cette sous-unite n’etait pas necessaire dans la circulation [58].
pour l’expression des autres sous-unites du complexe GPIb- L’inactivation totale de Was dans la souris a permis
IX ni pour ses fonctions principales, y compris la production ^le de Wasp et les consequences de son
d’eclaircir le ro

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vol. 21 n8 5, septembre-octobre 2015
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 absence dans la formation des plaquettes. Le modele murin historiquement nomm! ee ABP-280 (actin-binding protein
reproduit la thrombop!enie, mod!er!ee a s!evere selon le fond 280). Les filamines sont de grosses prot! eines dim! eriques
g!en!etique et les individus, bien que la microcytose soit assurant le pontage et la stabilisation du r! eseau d’actine
absente [59-61]. Il a ainsi !et!e montr!e que l’augmentation filamenteuse, l’ancrage de ce r! eseau aux glycoprot! eines
de la consommation plaquettaire en absence de la prot! eine transmembranaires, notamment le complexe GPIb-V-IX et
r!esultait a la fois de facteurs intrinseques aux plaquettes, et l’int!
egrine aIIbb3, et ont ! egalement la fonction de
de facteurs extrinseques en raison d’une susceptibilit! e prot!eines d’!echafaudage pour diff! erents interm! ediaires
accrue de ces souris a d!evelopper des anticorps anti- de signalisation [71]. Les mutations monoall! eliques dans le
plaquettaires entraı̂nant une phagocytose apres opsonisa- gene FLNA entraı̂nent, entre autres, des anomalies
tion [59, 60]. c!er!
ebrales, osseuses et cardiovasculaires [72]. Au niveau
En outre, l’absence de Wasp, en alt!erant la signalisation plaquettaire, on observe une macrocytose avec ou sans
induite par l’interaction du collagene I avec l’int! egrine thrombop! erenciation de cellules CD34+ de
enie. Apres diff!
a2b1, leve l’inhibition d’extension proplaquettaire m! edi!ee patients in vitro, certains m! egacaryocytes apparaissent
par le collagene I, ce qui aboutit a une lib!eration ectopique d!epourvus de filamine A avec une distribution anormale
des plaquettes dans le stroma m!edullaire [61]. Le des granules et une apparente fragilit! e des structures [73].
d!eveloppement de modeles murins knock-in a permis Ces observations sont en accord avec les donn! ees obtenues
d’explorer les m!ecanismes d’activation et de stabilit! e de la dans un modele de souris d! epourvues de filamine A dans la
prot!eine Wasp, a travers notamment le ro ^le important de la lign!ee plaquettaire caract! eris!
e par une macrothrom-
phosphorylation au site unique Y293 (l’!equivalent murin bop! enie s!
evere et une diminution du complexe GPIb-IX
du site Y291 chez l’homme) [53]. Ce site de phosphoryla- a la surface plaquettaire [74]. La thrombop! enie r!
esulte a la
tion joue un ro ^le critique dans l’activation de Wasp lors de fois d’une clairance rapide des plaquettes, qui apparaissent
nombreuses r!eponses cellulaires incluant la prolif!eration, la plus fragiles, et d’une production plaquettaire inefficace.
phagocytose et surtout l’assemblage de structures d’adh! e- Les proplaquettes sont form! ees pr!ematur! ement et liberent
sion et la chimiotaxie [62]. La prot!eine Wasp, en relayant la de gros fragments. Ceux-ci se fragmentent a leur tour en
signalisation induite par le collagene I et en favorisant la plaquettes qui sont sujettes a une microv! esiculation et sont
migration des m!egacaryocytes vers les sinusoı̈des, joue un rapidement ! elimin!ees de la circulation. Cette microv! esicu-
ro^le cl!e en pr!evenant la lib!eration pr!ematur! ee des lation est due a une moindre stabilit! e des membranes, en
plaquettes dans le compartiment m!edullaire. lien possible avec une instabilit!e du r!eseau d’actine sous-
Enfin, ces modeles de souris ont permis depuis une dizaine membranaire [74].
d’ann!ees de mener avec succes des essais pr!ecliniques de
th!erapie g!enique somatique, comme alternative a la Thrombopénie liée à la tubuline b1
transplantation. En effet, malgr!e les avanc!ees dans le
La tubuline b1 est une isoforme exprim! ee majoritairement
diagnostic, le pronostic des patients WAS reste sombre.
par les plaquettes sanguines. Des mutations dans le gene
Dans les cas mod!er!es, une prise en charge par des
TUBB1 ont ! et!
e d!ecrites pour deux familles [75, 76] mais
transfusions en cas d’h!emorragie s!evere, associ!ee a une
n’ont pas encore ! et!
e reproduites chez l’animal. Les patients
spl!enectomie, peut suffire, mais l’allogreffe de CSH reste le
pr!esentent une macrothrombop! enie associ! ee a une
traitement de choix pour les syndromes WAS/XLT. Des essais
diminution de la quantit! e de tubuline b1 dans les
de transduction de CSH murines avec des vecteurs
plaquettes. Ces mutations entraineraient une instabilit! e
r!etroviraux ou lentiviraux, codant la prot!eine Wasp, ont
!et!e effectu!es et suivis de transplantation en modeles murins de la prot! eine et une incapacit! e a s’incorporer aux
microtubules, avec pour cons! equence une diminution de
Was-/-. Les r!esultats ont montr!e une tres bonne efficacit! e de
la quantit!
e de m! egacaryocytes formant des proplaquettes.
transduction, une prise de greffe a long terme et l’expression
L’importance de cette isoforme particuliere de tubuline
du transgene dans les lignages lymphoı̈des et my!eloı̈des. La
dans la formation des plaquettes avait ! et!e d!
emontr!ee dans
greffe corrige notamment le d!eficit immunitaire, tout en
!
des souris inactivees pour le gene Tubb1. Ces souris ont
diminuant la production d’autoanticorps [63-68]. Ces
une macrothrombop! enie r!
esultant d’un d! efaut de forma-
avanc!ees, conjointement aux am!eliorations concernant les
tion de proplaquettes, malgr! e la surexpression compen-
vecteurs et promoteurs de transcription, autorisent mainte-
satoire de Tubb2 et Tubb5 [77]. L’absence de ph!enotype
nant les premiers essais de th!erapie g!enique comme
observ!e dans les souris h! et!
erozygotes suggere que le
traitement pour certains de ces patients [69, 70].
ph!enotype des patients pourrait ^ etre li!e a un effet
dominant n! egatif. Un effet dominant n! ^ a une
egatif du
Thrombopénie liée à FLNA
autre mutation entraı̂nant une instabilit! e des microtubules
La filamine A, cod!ee par le gene FLNA, est une prot!
eine de a!egalement ! et!e rapport!ee chez des chiens mut! es dans la
liaison a l’actine appartenant a la famille des filamines, tubuline b1 [78].

❍■❏ He! matologie

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 Les mod!
eles murins de thrombopenie

Mutations affectant la voie TPO-cMPL reguler les concentrations locales et donc la disponibilite de
la TPO dans le microenvironnement medullaire et eviter la
Thrombopénie congénitale myeloproliferation par surstimulation des progeniteurs [93].
amégacaryocytaire Enfin, comme pour d’autres pathologies, les souris
invalidees pour le g!
ene Mpl constituent un outil de choix
La thrombopenie congenitale amegacaryocytaire (CAMT, pour la mise en place d’une therapie genique et la
pour congenital amegakaryocytic thrombocytopenia) est la validation de nouveaux vecteurs [94, 95].
plus connue des thrombopenies amegacaryocytaires. Il
s’agit d’une maladie autosomale recessive due ! a des
mutations du g!ene MPL codant le recepteur de la TPO. Ce Mutations affectant les facteurs de
recepteur est present sur les CSH, les megacaryocytes et les
plaquettes, et active differentes voies de signalisation en
transcription
particulier Jak2/STAT, Ras/MAPK, et PI3K [20, 79]. La
Thrombopénies liées à GATA1
thrombopenie est sev!ere d!es la naissance et evolue vers
une aplasie medullaire durant la premi!ere annee de vie, On distingue deux thrombopenies liees ! a GATA1 : l’anemie
necessitant imperativement la greffe de CSH. Il existe une dyserythropoı̈etique avec thrombopenie (DAT) et la
correlation claire entre le genotype et le phenotype. Les thrombopenie liee ! a l’X avec b^ etathalassemie (XLTT)
mutations non-sens et les deletions aboutissant ! a une [96]. Dans ces deux cas, les mutations de GATA1 sont
proteine non fonctionnelle entraı̂nent une forte throm- responsables de dysmegacaryopoı̈! ese et dyserythropoı̈!
ese
bopenie, alors que les patients presentant une activite avec une anemie de degre variable et une macro-
residuelle du recepteur ont une thrombopenie moins thrombopenie, moins sev! ere dans XLTT. GATA1 est un
sev!ere [80]. A! l’inverse, des mutations MPL entraı̂nant une facteur de transcription contro ^lant l’expression de nom-
activation constitutive du recepteur ou une diminution de breux g! enes impliques dans la megacaryopoı̈! ese (GPIBA,
la clairance de la TPO, ainsi que des mutations dans le g! ene GPIBB, PF4, MPL, NFE2, etc.) ainsi que des g! enes de la
THPO responsables d’une augmentation de traduction du lignee erythroı̈de (HBB, ALAS1, BCL2L1) [97]. GATA1
g!ene, ont ete identifiees dans certaines formes familiales comporte deux domaines en doigt de zinc, l’un en N-
de thrombocytemies essentielles [81, 82]. terminal (Nf) et l’autre en C-terminal (Cf). Le domaine Nf
Les souris deficientes pour Mpl reproduisent partiellement le interagit !a la fois avec FOG1 et avec l’ADN. La mutation
tableau clinique. Comme chez l’homme, la thrombopenie responsable de XLTT affecte la liaison !
a l’ADN sans modifier
est sev!ere, mais on n’observe pas, en revanche, de l’interaction avec FOG1 [98], alors que les mutations
pancytopenie malgre une diminution du nombre de cellules impliquees dans DAT affectent la liaison ! a FOG1.
progenitrices des differents lignages hematopoı̈etiques L’inactivation totale du g! ene chez la souris est letale au
[83, 84]. Des etudes ulterieures ont permis de montrer le stade embryonnaire 10,5-11,5. Des etudes sur souris
ro^le de la signalisation TPO-Mpl dans la regulation des CSH chimeriques derivant de cellules ES Gata1-/- montrent une
murines chez l’adulte [85], ainsi qu’au cours du augmentation du nombre de megacaryocytes dans le foie
developpement lors de l’etablissement de l’hematopoı̈! ese fœtal [99]. Des donnees similaires ont ete rapportees dans
definitive [86, 87]. La presence, m^eme reduite, de pla- un mod! ele de souris presentant une mutation ponctuelle
quettes fonctionnelles dans les souris Mpl-/- sugg! ere induite par la N-nitroso-N-ethyluree (ENU) au niveau
l’existence d’autres facteurs impliques dans la formation du codon initiateur (Gata1Plt13), mimant les mutations
des plaquettes. Ces souris ont ete un mod!ele extr^emement presentes chez certains patients [100]. De plus, le
utile pour identifier ces facteurs. Differentes etudes ont developpement de souris transgeniques portant des
montre que les interleukines IL-3, IL-5, IL-6, IL-11 et IL-17 ne portions du g! ene suivies d’une sequence rapportrice a
sont pas impliquees dans la thrombopoı̈!ese residuelle [88- permis d’identifier les regions promotrices et la specificite
91]. En revanche, les chimiokines SDF-1 et FGF-4 favorise- d’expression de Gata1 au cours du developpement [101].
raient la thrombopoı̈!ese independamment de la TPO en Le remplacement cible d’une longue sequence en amont
permettant l’interaction des progeniteurs megacaryo- du locus Gata1 incluant le promoteur distal a permis
cytaires avec la niche vasculaire [92]. Tout recemment, la de generer une lignee murine viable, nommee Gata1low,
generation de souris invalidees pour Mpl specifiquement avec suppression d’expression specifique dans les
dans la lignee megacaryocytaire a permis de montrer que le megacaryocytes [102]. Ces souris presentent une throm-
ro^le cle de l’axe TPO-Mpl se situe au niveau des precurseurs bopenie sev! ere resultant d’un defaut de maturation des
megacaryocytaires bipotents. En effet, la presence du megacaryocytes qui sont peu polyploı̈des, presentent un
recepteur MPL au niveau des megacaryocytes n’est pas DMS sous-developpe aboutissant ! a un defaut de formation
indispensable pour leur expansion, leur maturation ou la de proplaquettes, ainsi qu’un defaut de formation de
production des plaquettes, mais reste essentielle pour granules [103]. Ces defauts sont associes ! a une reduction

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 de la transcription de genes cl!es dans la maturation des d’une d! egradation prot! eolytique [115]. Le facteur de
m!egacaryocytes (Gp1ba, Gp1bb, Pf4, Mpl, Nfe2) [103]. transcription CBF r! egule l’expression de nombreux genes
L’absence de Gata1 entraı̂ne !egalement une d! er!
egula- sp!ecifiques de l’h! ematopoı̈ese et est essentiel pour
tion du cycle cellulaire avec une hyperprolif! eration l’!
etablissement de l’h! ematopoı̈ese d! efinitive [116].
des m!egacaryocytes. Avec l’^age, les souris Gata1low La plupart des mutations identifi! ees chez les patients
d!eveloppent alors un tableau clinique h!ematologique entraı̂nent une haplo-insuffisance, bien que quelques
ressemblant a la my!elofibrose idiopathique en plusieurs variants puissent agir par effet dominant-n! egatif [117].
aspects [104]. Les souris Gata1low repr!esentent ainsi Les patients pr! esentent une thrombop! enie, parfois
!egalement un excellent modele d’!etude de cette pathologie associ!ee a un d! efaut fonctionnel d’agr! egation en r! eponse
[105]. au collagene, ainsi qu’un risque accru de d! evelopper
une leuc! emie my! eloı̈de aigu€ e ou des syndromes
Amégacaryocytose avec synostose my! elodysplasiques (40 % des cas) [118].
radiocubitale L’inactivation totale de Runx1 dans la souris est l!etale au
stade embryonnaire 11,5-12,5 en raison d’h! emorragies
Ce syndrome cong!enital rare est caract!eris!e par une
intracr^aniennes. Ces souris ont n! eanmoins permis de
thrombop!enie am!egacaryocytaire s!evere, pr!esente des la
montrer que Runx1 est n! ecessaire pour le d! eveloppement
naissance, associ!ee a une fusion proximale des radius et
de l’h! ematopoı̈ese d! efinitive au stade embryonnaire
cubitus. La thrombop!enie ne s’am!eliore pas avec l’^ age, et
[119, 120]. Le d! eveloppement de souris conditionnelles
les enfants peuvent !egalement d!evelopper une insuffi-
a permis d’inactiver le gene dans les souris adultes par
sance my!eloı̈de n!ecessitant une greffe de moelle [106].
croisement avec une souris exprimant la cre recombinase
L’ensemble de ces sympto ^mes se distingue des syndromes
sous contro ^le du promoteur Mx1. Dans ce cas, la perte de
CAMT et TAR (thrombocytopenia with absent radii), et
Runx1 au stade adulte n’entraı̂ne pas de perte totale
dans la plupart des cas des mutations dans le gene
d’h! ematopoı̈ese [121-124]. En revanche on observe une
HOXA11 ont !et!e mises en !evidence [106, 107]. HOXA11
inhibition de la maturation des m! egacaryocytes et des
est un membre de la famille des genes homeobox HOX, qui ^le dans la maturation de
lymphocytes, en accord avec un ro
codent des facteurs de transcription. Ces prot! eines
ces cellules. Par ailleurs, la fraction de prog! eniteurs
jouent un ro ^le important pendant le d!eveloppement
immatures est augment! ee [121, 122], Runx1 jouant un
embryonnaire ou leur expression est fortement r! egul!ee ^le de r!
ro egulateur n! egatif des CSH quiescentes [125]. Il a
au niveau spatial et temporel [108, 109]. Au niveau !
et!e d!ecrit que les prog! eniteurs h!ematopoı̈! etiques des
h!ematopoı̈!etique, HOXA11 serait exprim!e uniquement
patients FPD/AML avaient une augmentation du potentiel
dans les pr!ecurseurs les plus pr!ecoces [110]. Des modeles
clonog! enique et dans certains cas des capacit! es d’auto-
murins inactiv!es pour le gene Hoxa11 ont !et!e d!evelopp! es
renouvellement aberrantes [126]. L’expansion de ces
mais n’ont pas permis l’!etude des m!ecanismes impliqu! es
cellules immatures observ! ees dans les souris d! eficientes
dans la formation des plaquettes. Les souris h!et!erozygotes
pour Runx1 pourrait ainsi ^ etre impliqu! ee dans la
ou homozygotes Hoxa11-/- pr!esentent des malformations
pathog! enese des tumeurs h! ematologiques humaines
des membres inf! erieurs et post!erieurs, en accord avec les
associ!ees a un d! efaut de Runx1 [127].
observations chez les patients, mais la thrombop! enie n’a
Enfin, plus r!ecemment, l’inactivation de Runx1 durant la
jamais !et!e rapport!ee [111, 112]. Pour l’heure, on ne sait
maturation m! egacaryocytaire par croisement avec les
donc pas si les d!efauts de m!egacaryopoı̈ese pr!esents chez
souris Pf4-cre a montr! e l’importance de ce facteur dans
les patients r!esultent ou non d’un effet dominant n! egatif
la maturation des m! egacaryocytes et a permis de faire une
de la mutation ponctuelle [107].
analyse g! enomique de l’expression des genes contro ^ l!
es par
Runx1 dans les stades tardifs de la m! egacaryocytopoı̈ese,
Maladie familiale plaquettaire avec
€ apportant la encore des informations utiles a la compr! e-
prédisposition à la leucémie myéloı̈de aigue
hension de la pathologie [128].
La maladie familiale plaquettaire avec pr!edisposition a la
leuc!emie my!eloı̈de aigu€e (FPD/AML pour familial platelet
disorder/acute myeloid leukemia) est la cons!equence de
Syndrome de Paris-Trousseau et Jacobsen
mutations dans le gene RUNX1 (appel!e !egalement AML1 Le syndrome de Paris-Trousseau et le syndrome de
ou CBFA2). Il existe !egalement une forme non h!er! editaire Jacobsen, a transmission dominante, r! esultent d’une
r!esultant de mutations somatiques dans RUNX1, respon- d!
el!
etion partielle du bras long du chromosome 11
sable d’AML et de leuc!emie my!elomonocytaire chronique. (11q23-ter) [129]. Environ 200 cas ont !
et!
e d!ecrits avec
RUNX1 code la sous-unit!e a du complexe de transcription deux fois plus de femmes touch! ees que d’hommes. La
CBF [113, 114]. L’h!et!erodim!erisation de RUNX1 avec distinction entre le syndrome de Paris-Trousseau et le
CBF-b augmente son affinit!e pour l’ADN et le protege syndrome de Jacobsen est bas! ee sur la s!
ev!
erit!
e de la

◆❖◆ Hematologie
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 Les mod"
eles murins de thrombopenie

maladie. Dans tous les cas la thrombopenie est transcriptionnel [136]. La proteine GFI1B est exprimee dans
presente, temoignant d’un defaut de maturation des les cellules hematopoı̈etiques et en particulier dans les
megacaryocytes avec de nombreux megacaryocytes micro- erythrocytes et les megacaryocytes [137]. La generation de
cytaires immatures, hypolobules et dystrophiques [130]. souris rapportrices exprimant la proteine fluorescente GFP
Ces patients souffrent egalement de dysmorphie faciale. (pour green fluorescent protein) au locus Gfi1b (animaux
Des sympto ^mes additionnels peuvent ^etre observes dans le Gfi1b+/GFP) a permis de montrer que l’expression de cette
cas du syndrome de Jacobsen, avec des anomalies proteine au cours de l’hematopoı̈" ese est inversement
cardiaques, renales, gastro-intestinales et genitales, ainsi proportionnelle " a l’expression d’une autre proteine de la
^mes est
qu’un deficit intellectuel. La variabilite des sympto m^ eme famille, Gfi. En particulier, Gfi1b est exprimee dans
vraisemblablement correlee avec le type de deletion. Celle- les cellules erythroı̈des, les megacaryocytes et leurs
ci est variable en taille, pouvant atteindre 20 Mb. Le site de progeniteurs communs, le MEP (pour megakaryocyte
coupure est generalement localise "a l’interieur ou " a erythroid progenitor) [138].
proximite de la sous-bande 11q23.3, et s’etend habituel- Chez l’homme, la mutation entraı̂ne une proteine tronquee
lement jusqu’au telom"ere. Cette region recouvre en de ces quarante-quatre derniers acides amines qui agirait
particulier deux g"enes codant des facteurs de transcription comme dominant negatif vis-" a-vis de la proteine normale.
de la famille ETS : ETS1 et FLI1. Comme pour le syndrome des plaquettes grises autosomal
L’etude d’un mod"ele de souris inactivee sur le g"ene Ets-1 a recessif (voir ci-apr"es), la thrombopenie est associee " a des
permis de montrer que ce facteur de transcription n’est pas plaquettes de grosses tailles, depourvues, en partie ou
critique dans le processus de megacaryopoı̈"ese, alors que la totalement selon les patients, de granules alpha. Les
differenciation de la lignee lymphoı̈de est fortement saignements moderes " a sev"eres ont ete rapportes, pouvant
perturbee [131]. En revanche, l’etude de souris inactivees en partie ^etre attribues " a une diminution d’expression de la
sur le g"ene Fli1 a demontre la responsabilite de cette GPIba. Au niveau medullaire, le developpement de
proteine dans ces syndromes par son implication dans la myelofibrose au stade I a ete rapporte ainsi qu’une
transactivation de g"enes megacaryocytaires. L’inactivation augmentation du nombre de megacaryocytes pleomorphes
totale de Fli1 entraı̂ne une mortalite embryonnaire au stade en taille et forme, contenant peu de granules. Les
E11.5, "a la suite d’hemorragies intracr^aniales [132]. megacaryocytes, ainsi que les plaquettes, conservent une
L’absence de Fli1 affecte "a la fois la vasculogen" ese et forte expression du marqueur de cellules souche CD34+.
la megacaryopoı̈"ese. Comme chez les patients, on retrouve Les etudes chez la souris ont montre le ro ^le de Gfi1b
une anomalie morphologique des megacaryocytes, comme represseur transcriptionnel agissant au niveau de
caracteristique de megacaryocytes immatures [132]. l’erythropoı̈"
ese et de la megacaryopoı̈" ese au stade
Toutefois, les souris heterozygotes Fli1+/- ne presentent embryonnaire et adulte. La deletion totale du g" ene Gfi1b
aucun phenotype anormal, ce qui pose la question des entraı̂ne un arr^ et du developpement embryonnaire
mecanismes par lesquels l’haplo-insuffisance chez les autour de E14,5, du ^ " a un retard de maturation des
patients entraı̂ne les divers sympto ^mes. Pour etudier le erythrocytes primitifs, et un defaut de production
^le des domaines fonctionnels de Fli1, des souris mutantes
ro d’erythrocytes anuclees definitifs, accompagne d’un
ont ete generees, exprimant une forme tronquee, defaut de differenciation de la lignee megacaryocytaire
depourvue du domaine regulateur C-terminal [133]. [139]. La deletion d’un seul all" ele n’entraı̂ne aucune
Les souris homozygotes ont une viabilite diminuee consequence et les animaux heterozygotes se developpent
(30 % de survie "a l’^age adulte), presentent une throm- normalement. Ces donnees indiquent que l’haplo-insuffi-
bopenie ainsi que des defauts fonctionnels, resultant sance ne serait pas responsable de la pathologie humaine,
notamment d’une diminution d’expression de g" enes en accord avec un possible effet dominant negatif de la
associes au developpement megacaryocytaire (Mpl, deletion. Par ailleurs, la generation de souris knock-out
Itga2b, Gp5, Gp9, Pf4, Nf-e2, MafG, et Rab27b). conditionnelles dans lesquelles la cre recombinase est sous
contro^le du promoteur inductible Mx1 a permis de montrer
le ro^le cle de cette proteine dans la regulation de la
Thrombopénie liée à GFI1B
dormance et de la proliferation des CSH adultes [140].
Tre"s recemment, une mutation non-sens dans le g" ene L’inactivation specifique dans les erythrocytes (croisement
GFI1B (pour growth factor independent 1B) a ete mise en avec les souris exprimant la cre recombinase sous contro ^le
cause chez une famille presentant une forme autosomale du promoteur EpoR [recepteur de l’erythropoı̈etine])
dominante de syndrome des plaquettes grises [134]. Le montre un ro ^le de Gfi1b dans la differenciation des
g"ene GFI1B est un facteur de transcription contenant un proerythroblastes en erythrocytes matures et dans l’extinc-
domaine represseur SNAG (SNAil Gfi1) en N-terminal [135] tion de l’expression des g" enes codant la globine chez
et six domaines conserves "a doigts de zinc. Le domaine l’embryon et l’adulte [141]. Enfin, par croisement avec des
SNAG lui conf"ere, entre autres, un ro ^le de represseur souris exprimant la cre recombinase sous contro ^le d’un

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 promoteur inductible a la doxycycline, Foudi et al. ont La formation des proplaquettes ainsi que la survie des
confirm!e le ro ^le de r!epresseur transcriptionnel de plaquettes ! etant normale, les auteurs proposent que la
!
l’erythropoı̈ese adulte et de la thrombopoı̈ese [142]. Au thrombop! enie r!esulte d’anomalies dans les ! etapes termi-
cours de la m!egacaryopoı̈ese chez l’adulte, Gfi1b agit nales de lib!eration de plaquettes. Enfin, le modele publi! e par
principalement comme un r!epresseur transcriptionnel Guerrero et al. [150] (modele 3) d! eveloppe a la fois la
entre le stade prom!egacaryocyte, apres les endomitoses, spl!enom! egalie et la my!elofibrose. In situ, les m!egacaryocytes
et le stade m!egacaryocyte, avant la maturation cyto- sont plus petits et globalement moins polylob! es, et les
plasmique [142]. observations ultrastructurales notent un systeme de mem-
brane de d! emarcation un peu plus rudimentaire. La
formation de proplaquettes, visualis! ee par adh! esion de
Autres mutations m! egacaryocytes cultiv! es in vitro sur surface de fibrinogene,
est similaire entre les deux g! enotypes. De maniere
Syndrome des plaquettes grises !
etonnante, les granules alpha matures sont pr! esents dans
les m! egacaryocytes in situ, ainsi que dans les boutons
Le syndrome des plaquettes grises tire son nom de l’aspect
proplaquettaires de m! egacaryocytes diff! erenci! es in vitro. Les
gris!e des plaquettes sur un frottis sanguin color!e au May-
auteurs suggerent que le d! efaut de granules alpha
Gru€nwald-Giemsa, du ^ a l’absence de granules alpha. Il est
plaquettaire r! esulterait d’une r! etention anormale des
caract!eris!e par une macrothrombop!enie associ!ee a une
granules, pluto ^t que d’une g! en!eration anormale. Dans le
my!elofibrose et une spl!enom!egalie [143]. Cette maladie
cas de ces trois modeles, il s’agit de d! el!
etion totale, les
autosomale r!ecessive est due a une mutation biall! elique
modeles 1 et 2 ayant en outre la m^ eme origine. Les
dans le gene NBEAL2 (neurobeachin-like 2), les patients
diff!erences observ! ees, au moins entre les deux premiers
!etant soit homozygotes, soit double h!et!erozygotes
modeles, pourraient rendre compte d’une h! et!
erog! en!eit!
e
aboutissant a une perte de fonction de la prot!eine [144-
des souris, alli! e au fait que les effectifs utilis! es sont
146]. Les !etudes chez les patients montrent que le nombre
relativement faibles, ou d’une diff! erence de souche utilis! ee.
de m!egacaryocytes est normal alors que la thrombop! enie
On ne peut exclure egalement que les diff!
! erences avec le
s’accentue avec l’^age. La survie diminu!ee des plaquettes de
modele 3 r! esultent de la maniere dont l’inactivation a ! et!
e
ces patients, associ!ee au d!eveloppement progressif de
obtenue. Malgr! e ces diff!erences, qui ne permettent pas de
my!elofibrose probablement du ^ a la lib!eration pr!ematur!ee
conclure d! efinitivement quant au ro ^le exact de Nbeal2 dans
de facteurs de croissance, pourrait expliquer ces observa-
la formation des granules alpha et dans la thrombop! enie,
tions [143, 144].
l’ensemble de ces donn! ees ont permis de formuler un certain
R!ecemment, trois modeles de souris inactiv!ees pour le gene
nombre d’hypotheses. Les ! etudes devront ^ etre poursuivies
Nbeal2 ont !et!e g!en!er!es [147-150]. Ces modeles reprodui-
!
afin de determiner quels sont les m! ecanismes r! eellement
sent tous la macrothrombop!enie ainsi que l’absence de
affect!es dans la pathologie humaine selon le type de
granules alpha dans les plaquettes, mais des diff!erences sont
mutation.
a noter. Le modele d!evelopp!e par Kahr et al. [147] (modele
1) pr!esente !egalement une spl!enom!egalie a l’instar de la
pathologie humaine, mais pas de my!elofibrose. L’observa- Thrombopénies liées à ANKRD26/
tion ultrastructurale des m!egacaryocytes de ces souris
thrombopénie familiale 2
montre des anomalies au niveau de la maturation des La thrombop! enie familiale 2 (THC2) avec pre !disposition
granules alpha avec une abondance de formes immatures, aux leuc!emies est une forme rare de thrombop! enie
ainsi que dans le d!eveloppement des membranes de autosomale dominante [151, 152]. Les plaquettes sont
d!emarcation. En culture, les m!egacaryocytes d!eriv! es de normales d’un point de vue morphologique et fonctionnel,
prog!eniteurs Nbeal2-/- !etendent moins de proplaquettes et et la thrombop! enie, mod! er!
ee a s!evere, entraı̂ne des
sont tres peu polyploı̈des. Le facteur Willebrand est localis! e saignements moderes. La thrombop!
! ! enie a !et!
e associ!
ee a
de maniere anormale en p!eriph!erie et peut ^etre s! ecr!et!
e. un d!efaut de production de plaquettes au vu de la moelle
L’ensemble de ces donn!ees a permis de sugg!erer que le des patients qui pr! esentent une dysm! egacaryopoı̈ese et
d! eveloppement normal des granules alpha contribue a la des microm! egacaryocytes [153]. Cette pathologie a ! et!
e
maturation des m! egacaryocytes. Contrairement au modele r!
ecemment associ! ee a des mutations ponctuelles dans la
pr!ec!edent, celui d!evelopp!e par Deppermann et al. [149] partie non codante 5’ du gene ANKRD26 (ankyrin repeat
(modele 2) ne pr!esente pas ou peu de spl!enom!egalie m^ eme domain 26) [153-155]. ANKRD26 code une prot! eine de
chez les souris ^ag!ees. Les m!egacaryocytes ont un 192 kDa abondante dans diff! erents tissus comme le
d!eveloppement des membranes de d!emarcation normal. cerveau, le foie, le tissu adipeux et les muscles squeletti-
Les granules alpha y sont absents, mais on note une ques, mais aussi le tissu h! ematopoı̈!etique. De maniere
augmentation du nombre de vacuoles et de mitochondries. eressante, des souris Ankrd26-/- d!
int! eveloppent une

❲❳❨ He! matologie

vol. 21 n8 5, septembre-octobre 2015

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 Les mod!
eles murins de thrombopenie

obesite et un gigantisme lies a! une hyperphagie mais ne Dans certains cas, toutefois, le mod! ele murin ne reproduit
presentent pas de thrombopenie, suggerant que l’haplo- pas l’integralite des sympto ^mes humains et peut m^ eme
insuffisance n’est pas responsable de la thrombopenie des generer de nouvelles interrogations ! a l’instar des souris
patients [154, 156]. En accord avec ces observations, des deficientes pour Nbeal2. La culture et la differenciation de
donnees recentes ont montre que les mutations 5’UTR megacaryocytes humains in vitro restent absolument
affectent la liaison des facteurs de transcription RUNX1 et indispensables et totalement complementaires des etudes
FLI1, entraı̂nant l’absence de repression du g!ene ANKRD26 chez la souris. C’est en effet la confrontation des donnees
qui survient normalement pendant les stades tardifs de la observees chez l’animal et chez l’homme, in vivo et in vitro,
megacaryopoı̈!ese [157]. La surexpression anormale de qui permet les avancees majeures dans la comprehension
ANKRD26 augmente la signalisation via l’axe TPO/cMPL, des pathologies, et, par consequent, egalement dans les
entraı̂ne une signalisation anormale de la voie ERK/MAPK connaissances des mecanismes normaux de la production
et en consequence affecterait la formation des propla- des plaquettes.
quettes [157].
^t : Aucun.
Conflits d’intere ❩
Conclusion Références
1. Balduini CL, Pecci A, Noris P. Inherited thrombocytopenias: the evolving
Ces derni!eres annees ont ete marquees par des avancees spectrum. Hamostaseologie 2012 ; 32 : 259-70.
majeures dans la comprehension des mecanismes normaux ❬❭ Tiedt R, Schomber T, Hao-Shen H, Skoda RC. Pf4-Cre transgenic mice allow
et pathologiques de la thrombopoı̈!ese. L’apport des the generation of lineage-restricted gene knockouts for studying megakaryo-
mod!eles animaux dans ce domaine a ete important, non cyte and platelet function in vivo. Blood 2007 ; 109 : 1503-6.
pas tant (!a ce jour) par l’identification des g!enes impliques ❪❭ Pertuy F, Aguilar A, Strassel C, et al. Broader expression of the mouse platelet
factor 4-cre transgene beyond the megakaryocyte lineage. J Thromb Haemost
dans les thrombopenies que par la comprehension des 2015 ; 13 : 115-25.
mecanismes en jeu, par leur utilisation pour des etudes de ❫❭ Alexander WS, Viney EM, Zhang JG, et al. Thrombocytopenia and kidney
structure-fonction apr!es introduction de formes mutees, et disease in mice with a mutation in the C1galt1 gene. Proc Natl Acad Sci U S A
enfin comme mod!eles precliniques pour tester de 2006 ; 103 : 16442-7.
nouveaux medicaments ou developper les therapies ❴❭ Anderson NM, Javadi M, Berndl E, et al. Enu mutagenesis identifies a novel
platelet phenotype in a loss-of-function Jak2 allele. PLoS One 2013 ; 8 :
geniques.
e75472.
Actuellement, l’origine de la thrombopenie reste inconnue
dans 40 !a 50 % des cas. Les nouvelles techniques de
❵❭ Carpinelli MR, Hilton DJ, Metcalf D, et al. Suppressor screen in Mpl-/- mice: c-
Myb mutation causes supraphysiological production of platelets in the absence
sequençage !a haut debit et en particulier les sequençages of thrombopoietin signaling. Proc Natl Acad Sci U S A 2004 ; 101 : 6553-8.
d’exomes ou de genomes complets permettent mainte- ❛❭ Mason KD, Carpinelli MR, Fletcher JI, et al. Programmed anuclear cell death
nant d’identifier de nouveaux g!enes candidats, !a l’exemple delimits platelet life span. Cell 2007 ; 128 : 1173-86.

de mutations rapportees recemment dans ACTN1 ❜❭ Gachet C, Hechler B, Leon C, Cazenave JP, Lanza F. Transgenic animals in
primary hemostasis and thrombosis. In: Offermanns S, Hein L, editors.
[158, 159]. Ces nouveaux candidats seront a! l’origine Handbook of experimental pharacology Transgenic models in pharmacology.
d’autant de mod!eles murins !a venir. De mani! ere Berlin : Springer Verlag; 2004.
complementaire, les programmes de mutagen!ese aleatoire ❝❭ Kumar R, Kahr WH. Congenital thrombocytopenia: clinical manifestations,
dans la souris devraient egalement identifier de nouveaux laboratory abnormalities, and molecular defects of a heterogeneous group of
conditions. Hematol Oncol Clin North Am 2013 ; 27 : 465-94.
g!enes candidats impliques dans des thrombopenies, avant
d’^etre recherches chez les patients.
❞❢❭ Balduini CL, Savoia A, Seri M. Inherited thrombocytopenias frequently
diagnosed in adults. J Thromb Haemost 2013 ; 11 : 1006-19.
Le mod!ele animal ideal reste bien evidemment le knock-in ❞❞❭ Pecci A, Balduini CL. Lessons in platelet production from inherited
avec reproduction !a l’identique de la mutation humaine thrombocytopenias. Br J Haematol 2014 ; 165 : 179-92.
lorsqu’elle est connue, !a condition que le g!ene et la ❞❬❭ Italiano Jr JE. Unraveling mechanisms that control platelet production.
fonction soient conserves entre la souris et l’homme. La Semin Thromb Hemost 2013 ; 39 : 15-24.

possibilite recente de generer des iPS permet l’obtention de ❞❪❭ Malara A, Balduini A. Blood platelet production and morphology. Thromb
Res 2012 ; 129 : 241-4.
cellules souches hematopoı̈etiques mutees !a partir de
fibroblastes de patients. La xenogreffe de ces cellules
❞❫❭ Bender M, Thon JN, Ehrlicher AJ, et al. Microtubule sliding drives proplatelet
elongation and is dependent on cytoplasmic dynein. Blood 2015 ; 125 : 860-8.
souches dans des souris immunodeficientes (NOD/SCID/gc) ❞❴❭ Patel-Hett S, Richardson JL, Schulze H, et al. Visualization of microtubule
devrait permettre de mimer ou de reproduire la pathologie growth in living platelets reveals a dynamic marginal band with multiple
humaine, m^eme lorsque le g!ene incrimine est inconnu. microtubules. Blood 2008 ; 111 : 4605-16.

Cette strategie, dej!a utilisee dans le cas d’hemopathies ❞❵❭ Tablin F, Castro M, Leven RM. Blood platelet formation in vitro. The role of the
cytoskeleton in megakaryocyte fragmentation. J Cell Sci 1990 ; 97 (Pt 1) : 59-70.
malignes, permettra d’etudier les mecanismes anormaux
dans la cellule d’intere^t (megacaryocytes et plaquette) et
❞❛❭ Eckly A, Rinckel JY, Laeuffer P, et al. Proplatelet formation deficit and
megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knock-out mice.
d’evaluer de nouvelles approches therapeutiques. J Thromb Haemost 2010 ; 8 : 2243-51.

Hematologie
vol. 21 n8 5, septembre-octobre 2015
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⑧ !✁✂✄ ☎✆✝✝✞✟ ✠✡☛✁☞✞✌☞✍ ✎✏✑✒
 ❥❦❧ Eckly A, Strassel C, Freund M, et al. Abnormal megakaryocyte morphology ;♣❧ Balduini A, Malara A, Balduini CL, Noris P. Megakaryocytes derived from
and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 patients with the classical form of Bernard-Soulier syndrome show no ability to
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assembled principally at the ends of proplatelet processes produced by platelet dysfunction: the Bernard-Soulier syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A
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GATA binding site of the platelet glycoprotein Ibbeta promoter resulting in the
Bernard-Soulier syndrome. J Biol Chem 1996 ; 271 : 22076-80. ;;❧ Poujol C, Ware J, Nieswandt B, Nurden AT, Nurden P. Absence of
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✈✇① Hematologie
vol. 21 n8 5, septembre-octobre 2015

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 Les mod!
eles murins de thrombopenie

②③④ Blundell MP, Bouma G, Metelo J, et al. Phosphorylation of WASp is a key cytopoiesis in mice lacking the thrombopoietic receptor c-Mpl. Blood 1996 ; 87 :
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leads to improvement of B-cell functionality in a murine model of Wiskott- ment 2007 ; 134 : 3031-40.
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vector and nonlethal irradiation. Hum Gene Ther 2006 ; 17 : 303-13. poiesis in mpl null mice. Exp Hematol 2000 ; 28 : 1001-7.
②⑩④ Astrakhan A, Sather BD, Ryu BY, et al. Ubiquitous high-level gene ➁➂❻ Gainsford T, Nandurkar H, Metcalf D, Robb L, Begley CG, Alexander WS.
expression in hematopoietic lineages provides effective lentiviral gene therapy of The residual megakaryocyte and platelet production in c-mpl-deficient mice is
murine Wiskott-Aldrich syndrome. Blood 2012 ; 119 : 4395-407. not dependent on the actions of interleukin-6, interleukin-11, or leukemia
②❶④ Hacein-Bey Abina S, Gaspar HB, Blondeau J, et al. Outcomes following inhibitory factor. Blood 2000 ; 95 : 528-34.
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313 : 1550-63. Requirement of TPO/c-mpl for IL-17A-induced granulopoiesis and megakaryo-
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Hematologie
vol. 21 n8 5, septembre-octobre 2015
➄➅➅
⑧ !✁✂✄ ☎✆✝✝✞✟ ✠✡☛✁☞✞✌☞✍ ✎✏✑✒
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➑➒➓ Hematologie
vol. 21 n8 5, septembre-octobre 2015

⑧ !✁✂✄ ☎✆✝✝✞✟ ✠✡☛✁☞✞✌☞✍ ✎✏✑✒

 Les modeles murins de thrombop!enie

➔→➔➣ Savoia A, Del Vecchio M, Totaro A, et al. An autosomal dominant ➔→➛➣ Bera TK, Liu XF, Yamada M, et al. A model for obesity and gigantism due
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➔➛➟➣ Noris P, Biino G, Pecci A, et al. Platelet diameters in inherited
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He! matologie
vol. 21 n8 5, septembre-octobre 2015
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⑧ !✁✂✄ ☎✆✝✝✞✟ ✠✡☛✁☞✞✌☞✍ ✎✏✑✒
5.2 Annexe 2

In vitro Binding of [3H]PSB-0413 to P2Y12 Receptors

Sous presse dans Current Protocols in Pharmacology

124
In Vitro Binding of [3H]PSB-0413 to ❯!✁✂ ✄☎✆✝
P2Y12 Receptors
Arnaud Dupuis✱1 Véronique Heim✱1 Philippe Ohlmann✱1 and Christian Gachet✶
1
Etablissement Français du Sang—Alsace, UMR S949, Strasbourg, France

The P2Y12 /ADP receptor plays a central role in platelet activation. Character-
ization of this receptor is mandatory for studying disorders associated with a
P2Y12 receptor defect and for evaluating P2Y12 receptor agonists and antag-
onists. In the absence of suitable anti-P2Y12 antibodies, radioligand binding
assays are the only way to conduct such studies. While various radioligands
were employed in the past for this purpose, none were found to be suitable for
routine use. Described in this unit are protocols for quantitatively and qualita-
tively assessing P2Y12 receptors with [3 H]PSB-0413, a selective antagonist for
this site. The saturation and competition assays described herein make possible
the determination of P2Y12 receptor density on cells, as well as the potencies
C 2015 by John Wiley & Sons, Inc.
and affinities of test agents at this site. °
Keywords: p2y12 r binding r blood platelets r radioligand r ADP

How to cite this article:

Dupuis, A., Heim, V., Ohlmann, P., and Gachet, C. 2015. In vitro
binding of [3 H]PSB-0413 to P2Y12 receptors. Curr. Protoc.
Pharmacol. 71:1.35.1-1.35.19.
doi: 10.1002/0471141755.ph0135s71

INTRODUCTION
Adenosine 5′ -diphosphate (ADP) is a platelet agonist in primary hemostasis. In blood
platelets, ADP is stored in dense granules at a concentration of about 650 mM. These
granules secrete their contents (ADP, other nucleotides, serotonin, and calcium) when
platelets are activated by collagen or thrombin. Two G protein–coupled receptors bind
ADP on platelet membranes (Gachet, 2008): the P2Y1 and P2Y12 sites. The P2Y1
receptor is involved in ADP-induced platelet shape change and intracellular calcium
mobilization, while the P2Y12 receptor plays a central role in platelet activation (Gachet,
2012). Thus, stimulation of the P2Y12 receptor by ADP amplifies the platelet responses
triggered by various agonists through multiple signaling pathways (inhibition of cyclic
AMP production and PI3Kinase activation). Due to this central role, the P2Y12 receptor
is an important target for antiplatelet drugs (Moheimani and Jackson, 2012), including
irreversible P2Y12 antagonist prodrugs (clopidogrel and prasugrel) and direct P2Y12
targeting agents (ticagrelor and cangrelor). In this context, P2Y12 radioligand binding
studies are crucial not only for diagnosing disorders such as hemorrhagic diathesis,
associated with a deficit in P2Y12 receptors (Cattaneo et al., 2003; Daly et al., 2009;
Cattaneo, 2011; Lecchi et al., 2015), but also for the evaluating the effectiveness of
P2Y12 receptor-targeting drugs in clinical trials (Bal Dit Sollier et al., 2009).

Various radioligands have in the past been used to label P2Y12 receptors. Included in
this group are [14 C]ADP, [3 H]ADP, [3 H]2-methylthio-ADP, [β-32 P]2-methylthio-ADP,
and [β-33 P]2-methylthio-ADP. However, none were entirely suitable for quantifying and

Receptor Binding

❈✞✟✟ent Protocols in Pharmacology 1.35.1-1.35.19, December 2015 1.35.1

Published online December 2015 in Wiley Online Library (wileyonlinelibrary.com).
doi: 10.1002/0471141755.ph0135s71 Supplement 71
Copyright °C 2015 John Wiley & Sons, Inc.
 ❝✠✡☛✡❝☞✌☛✍✎✍✏✑ P2Y12 receptors. In part, this is because these ligands are metabolized by
ectonucleotidases and none are selective for the P2Y12 receptor, having some affinity for
P2Y1 sites on platelets as well. For many years, blood platelet P2Y12 receptor binding sites
were labeled with radioactive 2-methylthio-ADP, a nonselective agonist, in the presence
of a selective P2Y1 antagonist such as MRS2179 (Baurand et al., 2001) or MRS2500
(Houston et al., 2006). The number of P2Y12 receptors per cell was then estimated by
subtracting selective P2Y1 binding from the total binding. However, the results using this
approach are highly variable with human platelets (Ohlmann et al., 2013).

It has now been shown that [3 H]PSB-0413, a tritiated derivative of AR-C767085MX, is

a selective P2Y12 antagonist (El-Tayeb et al., 2005; Baqi et al., 2009) that can be used
to study the purinergic P2Y12 platelet receptor. Unlike the thienopyridines, which bind
covalently to the P2Y12 receptor and prevent further ligand interactions, [3 H]PSB-0413
binds to the receptor in a reversible manner. This makes it suitable for performing either
saturation or competitive binding experiments.

Described in this unit is the use of this radioligand to characterize the P2Y12 receptor
both quantitatively and qualitatively in intact washed human platelets or cultured cells.
Saturation experiments (Basic Protocol 1) allow the determination of receptor density
(Bmax ), the number of binding sites for ligands interacting with the receptor (nH ), and
receptor affinity (Kd ). Competition experiments (Basic Protocol 2) are employed to
determine the affinity and the relative potencies (IC50 /Ki ) of ligands that interact with
this site.

BASIC SATURATION BINDING ASSAY TO DETERMINE THE DISSOCIATION

PROTOCOL 1 CONSTANT (Kd ) AND NUMBER OF BINDING SITES IN THE TISSUE
SAMPLE
A saturation assay allows determination of the dissociation constant (Kd ) of a radi-
olabeled ligand at equilibrium and the number of binding sites in the tissue sample.
Saturation binding is used in particular to quantify P2Y12 receptors present on blood
platelets or on any type of cell expressing this receptor. Additional procedures to prepare
washed blood platelets and to suspend cultured cells are described in Support Protocols 1
and 2.
Materials
Washed platelets resuspended in Tyrode’s buffer containing 0.1% human albumin
(Support Protocol 1) or cells resuspended in CMP-DPBS/0.1% bovine serum
albumin (Support Protocol 2)
Dulbecco’s phosphate-buffered saline without Ca or Mg (CMF-DPBS; Life
Technologies, cat. no. 14190-094)
10 mM or 20 mM ADP (see recipe)[3 H]PSB-0413 dilutions (see recipe and Tables
1.35.1 and 1.35.2)
Liquid scintillation cocktail (GE Healthcare, cat. no. NBCS 104)
Whatman glass microfiber filters, binder-free, Grade GF/C (Sigma-Aldrich, cat. no.
1822915)
Large petri dishes
Reaction vials (Novolab, cat. no. A11088)
Pump (Air Cadet, cat. no. 87419) and filtration system (Hoefer Scientific
Instrument, cat. no. CA 94107); see Figure 1.35.1 for a full description of the
filtration system
SnapCap Bio-Vials (Beckman Coulter, cat. no. 566353)
β scintillation counter (e.g., Tri-carb 2810TR liquid scintillation analyzer,
[3 H]PSB-0413
Binding to P2Y12 PerkinElmer,)
Receptors GraphPad Prism software (http://www.graphpad.com)
1.35.2
Supplement 71 Current Protocols in Pharmacology
❚✒✓✔✕ ✖✗✘✙✗✖ [3 H]PSB-0413 Dilution Table for a Saturation Binding Experiment on Platelets (60
Vials Including Total and Nonspecific Binding Vials)

Initial Volume of Volume Final Target

concentration of initial of PBS volume concentration
radioligand (µM) solution (µl) (µl) (µl) (nM)a
20b 22 528 550 800
0.8 125 75 200 500
0.8 75 125 200 300
0.8 50 150 200 200
0.8 31.25 218.75 250 100
0.8 12.5 187.5 200 50
0.8 7.5 192.5 200 30
0.8 5 195 200 20
0.8 3 197 200 12
0.8 1 199 200 4
a Concentration to use to prepare the vials for the saturation binding assay,: called "Initial concentration of radioligand"
in Table 1.35.3.
b Commercial stock solution.

Table 1.35.2 [3 H]PSB-0413 Dilution Table for a Saturation Binding Experiment on Cells (60 Vials
Including Total and Nonspecific Binding Vials)

Initial Volume of Volume Final Target

concentration of initial of PBS volume concentration
radioligand (µM) solution (µl) (µl) (µl) (nM)a
20b 44 506 550 1600
1.6 125 75 200 1000
1.6 75 125 200 600
1.6 50 150 200 400
1.6 25 175 200 200
1.6 15.6 234.4 250 100
1.6 7.5 192.5 200 60
1.6 5 195 200 40
1.6 3 197 200 24
1.6 1 199 200 8
a Concentration to use to prepare the vials for the saturation binding assay : called "Initial concentration of radioligand"
in Table 1.35.4.
b Commercial stock solution.

Prepare washed platelet or cell suspension

1a. For blood platelets washed as in Support Protocol 1: Use 200 µl of washed platelet
suspension at 600,000 platelet/µl for a single measurement.
The suspension must be held at 37°C for at least 30 min before use.
One experiment, involving 10 measurements in triplicate vials for total binding and 10
measurements in triplicate vials for nonspecific binding, requires 14 ml of washed platelet
suspension.

1b. For cultured cells prepared as in Support Protocol 2: Use 450 µl of cell suspension
Receptor Binding
at 2 × 106 cells/ml for a single measurement.
1.35.3
Current Protocols in Pharmacology Supplement 71
 ❋✚✛✜✢✣ ✤✥✦✧✥✤ Filtration system for saturation binding assay.

The resuspended cells must be kept at 37°C until use.

The cells from step 1b can be used immediately after the preparation of the suspen-
sion. One experiment, involving 10 measurements in triplicate vials for total binding
and 10 measurements in triplicate vials for nonspecific binding, requires 30 ml of cell
suspension.

Prepare reagents
2. Prepare Whatman glass microfiber filters appropriate for the filtration device (gener-
ally, round filters with an average diameter of 25 mm obtained with a hammer and a
punch). Add cold CMF-DPBS to the filters in a large petri dish and store them at 4°C
until use.
3. Prepare a large quantity (at least 1 liter for a single experiment) of CMF-DPBS and
maintain at 4°C.
4. Prepare a 10 mM solution of ADP for a platelet experiment or 20 mM for a cultured
cell experiment, as the final volume needed for the latter is twice that needed for the
former (see Reagents and Solutions).
5. Prepare radioligand ([3 H]PSB-0413) dilutions from the stock solution to obtain ap-
propriate volumes and concentrations for each "Target solution" (see Table 1.35.1 for
platelet suspension and Table 1.35.2 for cultured cell suspension; also see Reagents
and Solutions).
In Tables 1.35.1 and 1.35.2, the "Target concentration" corresponds to the "Initial con-
centration of radioligand" shown in Tables 1.35.3 and 1.35.4.

Prepare reaction vials

6. Prepare three vials containing 25 µl of 100 nM radioligand [3 H]PSB-0413 to deter-
mine the specific activity of the radioligand on the day of the experiment (total cpm,
TC vials).
7. Prepare vials in triplicate to measure nonspecific binding, containing each of the
following: (see Table 1.35.3 for platelet suspensions and Table 1.35.4 for cultured
[3 H]PSB-0413 cell suspensions):
Binding to P2Y12
Receptors
ADP to a final concentration of 1 mM
1.35.4
Supplement 71 Current Protocols in Pharmacology
★✩✪✫✬ ✭✮✯✰✮✯ Preparation of Nonspecific Binding Vials for a Saturation Binding Experiment on Platelets
Vial number 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

a b c a b c a b c a b c a b c a b c a b c a b c a b c a b c
Radioligand added 0.1 0.3 0.5 0.75 1.25 2.5 5 7.5 12.5 20
(pmol)
Initial concentration 4 12 20 30 50 100 200 300 500 800
of radioligand
(nM) a
Volume of 25
radioligand
added/vial (µl)
Final concentration 0.4 1.2 2 3 5 10 20 30 50 80
of radioligand (nM)
ADP added (nmol) 250
Initial concentration 10
of ADP (mM)
Volume of ADP 25
added (µl)
Final concentration 1
of ADP (mM)
Volume of platelet 200
suspension added
(µl)
Total volume of 250
mixture/vial (µL)
a These “initial concentration solutions” correspond to the “Target concentration” obtained in Table 1.35.1.

Increasing concentrations of radioligand ([3 H]PSB-0413) to final concentrations

ranging from 0.4 to 80 nM.
8. Prepare vials in triplicate to measure the specific binding of the increasing concentra-
tions of radioligand ([3 H]PSB-0413 [0.4 to 80 nM]). Use 25 µl CMF-DPBS instead
of 25 µl of ADP in each vial.
Binding (two operators are required for this step)
9. Begin the binding reaction by adding 200 µl of blood platelet suspension prepared
as in step 1a (or 450 µl of cultured cell suspension prepared as in step 1b) to the first
vial of the nonspecific series. Vortex the vial gently and incubate the sample at 37°C
for 5 min.
Because the association and dissociation of [3 H]PSB-0413 at the P2Y12 receptor is quite
rapid (t1/2 association of [3 H]PSB-0413 = 26.7 ± 3.7 sec and t1/2 dissociation of [3 H]PSB-0413
= 42.9 ± 10.8 sec), an incubation time of 5 min is sufficient to achieve equilibrium.
Equilibrium is stable for at least 30 min (Ohlmann et al., 2013).

10. Proceed in the same way every 30 sec for each vial.
11. Following the 5-min incubation time, place a round filter (from step 2) on the filtra-
tion device and activate the pump. Add 2 ml of cold CMF-DPBS to the incubation
vial and empty it into the filtration system. Rinse the filter four additional times with
2 ml of cold CMF-DPBS to complete the washing.
This step is necessary to separate the receptor-bound radioligand from unbound radioli-
Receptor Binding
gand which is collected in the waste.
1.35.5
Current Protocols in Pharmacology Supplement 71
✲✳✴✵✷ ✸✹✺✻✹✼ Preparation of Nonspecific Binding Vials for a Saturation Binding Experiment on Cells
Vial number 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

a b c a b c a b c a b c a b c a b c a b c a b c a b c a b c
Radioligand added 0.2 0.6 1 1.5 2.5 5 10 15 25 40
(pmol)
Initial concentration 8 24 40 60 100 200 400 600 1000 1600
of radioligand
(nM) a
Volume of 25
radioligand
added/vial (µl)
Final concentration 0.4 1.2 2 3 5 10 20 30 50 80
of radioligand (nM)
ADP added (nmol) 500
Initial concentration 20
of ADP (mM)
Volume of ADP 25
added (µl)
Final concentration 1
of ADP (mM)
Volume of cell 450
suspension added
(µl)
Total volume of 500
mixture/vial (µl)
a These “Initial concentration of radioligand” correspond to the “Target concentration” obtained in Table 1.35.2.

12. Remove (or scratch with a tweezers, depending on the filtration device) the filter
from the filtration device and transfer it to one Snap Cap Bio-Vial.
13. Add 2 ml of scintillation cocktail, close the vial, vortex it gently, and keep it at
room temperature for 1 hr before quantifying radioactivity in a liquid scintillation
counter. Allow a counting time of 5 min for each sample to increase the accuracy of
the results.
This approach avoids photomultiplier bleaching due to chemiluminescence.

Data analysis
14. Calculate the mean bound radioactivity (counts per min or cpm) of each triplicate
point for TC vials, total binding vials, and nonspecific binding vials.
15. Convert the mean activity of each triplicate into the concentration of bound radioli-
gand using the measured specific activity of the TC vials.
This will reveal the total concentration of bound radioligand associated with a concen-
tration of nonspecifically bound radioligand.
16. Calculate, for each point, the concentration of specifically bound radioligand (total
bound radioligand minus nonspecifically bound radioligand).
An example is presented in Table 1.35.5.
[3 H]PSB-0413
Binding to P2Y12 17. Plot the concentration of radioligand added [L] against the concentration of specifi-
Receptors
cally bound radioligand [RL].
1.35.6
Supplement 71 Current Protocols in Pharmacology
✽✾✿❀❁ ❂❃❄❅❃❅ Total, Nonspecific, and Specific Binding: Raw and Transformed Data Obtained from a Saturation Binding
Experiment on Human Plateletsa

Concentration Total Nonspecific Total binding Nonspecific Specific

of ligand binding binding (nM) ± SD binding binding (nM)
added (M) (cpm) ± SD (cpm) ± SD (nM) ± SD
4 × 10−10 194 ± 7 31 ± 8 0.019 ± 0.001 0.003 ± 0.001 0.016 ± 0.002
−9
1.2 × 10 825 ± 167 51 ± 13 0.081 ± 0.016 0.005 ± 0.001 0.076 ± 0.018
−9
2 × 10 1131 ± 27 102 ± 18 0.111 ± 0.003 0.010 ± 0.002 0.101 ± 0.004
−9
5 × 10 2241 ± 166 173 ± 20 0.220 ± 0.016 0.017 ± 0.002 0.203 ± 0.018
−8
1 × 10 2761 ± 126 214 ± 35 0.271 ± 0.012 0.021 ± 0.003 0.250 ± 0.016
−8
2 × 10 3036 ± 414 234 ± 9 0.298 ± 0.041 0.023 ± 0.001 0.275 ± 0.042
−8
5 × 10 3382 ± 424 275 ± 40 0.332 ± 0.042 0.027 ± 0.004 0.305 ± 0.046
−8
8 × 10 3504 ± 320 357 ± 10 0.344 ± 0.003 0.035 ± 0.001 0.309 ± 0.004
a The raw data for total and nonspecific binding (in cpm) were converted into the concentration of bound [3 H]PSB-0413 using the specific activity of
the radioligand measured in the TC vials (40,748 cpm/pmol).

❆❇❉❊●❍ ■❏❑▲❏▼ Total and nonspecific binding of [3 H]PSB-0413 to human platelets. The total
binding (•) and nonspecific binding (¥) are plotted as a function of the concentration of ligand added
([L]). The values of the total and nonspecific binding in CPM are converted into concentrations
using the specific activity of [3 H]PSB-0413 obtained by counting the TC vials on the day of the
experiment. In this experiment, the specific activity was 40,748 cpm/pmol.

GraphPad Prism is suitable to plot the saturation curve in two ways (Fig. 1.35.2): the
total and nonspecific binding are shown on the same graph if the plotting option "One
site-total and nonspecific binding" is selected. There is only one ADP binding site on the
P2Y12 receptor (Zhang et al., 2014a; Zhang et al., 2014b).
Only the specific binding will be displayed when selecting the plotting option "One
site–specific binding" (Fig. 1.35.3).

18. Determine Kd and Bmax from the specific binding curve (Fig. 1.35.3).
GraphPad Prism calculates these parameters automatically. It is also possible to
calculate the "Hill slope coefficient," nH (Davenport and Russell, 1996), which
corresponds to the slope of the graphical representation of the following equation
(Equation 1.35.1):

µ ¶
[RL]
log = n H ∗ ([L]) − log(K d )
Bmax − [RL]
Equation 1.35.1

Receptor Binding
nH is approximately equal to 1 when the ligand binds to a single population of sites
1.35.7
Current Protocols in Pharmacology Supplement 71
 ◆❖"◗❘❙ ❱❲❳❨❲❳ Specific binding of [3 H]PSB-0413 to human platelets. The specific binding of
[3 H]PSB−0413 is plotted as a function of the concentration of radioligand added ([L]). The specific
binding is calculated as the total binding less the nonspecific binding, both expressed as the
concentration of bound radioligand. The saturation binding curve allows one to determine Kd and
Bmax . In this experiment, Kd = 3.76 nM and Bmax = 0.33 nM.

1.0 10 - 1 0
[3H] PSB 0413 bound (M)

8.0 10 - 1 1

6.0 10 - 1 1

4.0 10 - 1 1

2.0 10 - 1 1

0
0 2.0 10 - 8 4.0 10 - 8 6.0 10 - 8 8.0 10 - 8 1.0 10 - 7
[3H] PSB 0413 added (M)

◆❖"◗❘❙ ❱❲❳❨❲❩ Specific binding of [3H]PSB-0413 to 13.21.N1 astrocytoma cells transfected with
a wild-type P2Y12 receptor. The specific binding of [3H]PSB-0413 is plotted as a function of the
concentration of radioligand added ([L]). The specific binding is calculated as the total binding less
the nonspecific binding, both expressed as the concentration of bound radioligand. The saturation
binding curve allows one to determine Kd and Bmax . In this experiment, Kd = 5.08 nM and Bmax =
75.4 pM.

In the example presented in Figure 1.35.3 and Table 1.35.5, Kd = 3.76 ± 0.4 nM, Bmax
= 0.33 ± 0.09 nM and nH = 1.2.

19. With Bmax expressed as a concentration, it is possible to estimate the absolute number
of receptors (N) per platelet (or cultured cell) in the experiment (Equation 1.35.2):

Bmax (M) ∗ Volume(L) ∗ Avogadro Number

N=
Number of cells per experiment
Equation 1.35.2

In the example shown in Figure 1.35.3, the number of P2Y12 receptors is 414 per platelet.
[3 H]PSB-0413
Binding to P2Y12 A saturation-binding experiment performed on 13.21N1 astrocytoma cells transfected
Receptors
with wild-type P2Y12 receptor is shown in Figure 1.35.4 and Table 1.35.6. In this example,
1.35.8
Supplement 71 Current Protocols in Pharmacology
❬❭❪❫❴ ❵❛❜❞❛❡ Total, Nonspecific, and Specific Binding: Raw and Transformed Data Obtained from a Saturation Binding
Experiment on 13.21.N1 Astrocytoma Cells Transfected with a Wild-Type P2Y12 Receptora

Concentration Total binding Nonspecific Total binding Nonspecific Specific binding

of ligand (CPM) ± SD binding (nM) ± SD binding (nM) ± SD
added (M) (cpm) ± SD (nM) ± SD
4 × 10−10 77 ± 5 14 ± 2 0.0040 ± 0.0003 0.0007 ± 0.0001 0.0032 ± 0.0004
−9
1.2 × 10 217 ± 29 17 ± 2 0.0112 ± 0.0015 0.0009 ± 0.0001 0.0104 ± 0.0016
−9
2 × 10 524 ± 67 22 ± 2 0.0271 ± 0.0035 0.0011 ± 0.0001 0.0260 ± 0.0036
−9
5 × 10 839 ± 63 36 ± 3 0.0433 ± 0.0033 0.0019 ± 0.0001 0.0415 ± 0.0034
−8
1 × 10 938 ± 16 60 ± 8 0.0484 ± 0.0008 0.0031 ± 0.0004 0.0453 ± 0.0012
−8
2 × 10 1290 ± 84 127 ± 24 0.0666 ± 0.0043 0.0066 ± 0.0013 0.0601 ± 0.0056
−8
5 × 10 1350 ± 132 143 ± 21 0.0697 ± 0.0068 0.0074 ± 0.0011 0.0623 ± 0.0079
−8
8 × 10 1659 ± 40 157 ± 31 0.0857 ± 0.0021 0.0081 ± 0.0016 0.0776 ± 0.0036
a The raw data for total and nonspecific binding (in CPM) were converted into the concentration of bound [3 H]PSB-0413 using the specific activity of
the radioligand measured in the TC vials (38,746 CPM/pmol).

the Kd = 5.08 ± 1.14 nM, the Bmax = 75.4 ± 4.5 pM, with the number of P2Y12 receptors
per cell being 22,689.

COMPETITIVE BINDING ASSAYS TO DETERMINE THE AFFINITY (Ki OR BASIC

IC50 ) OF NON-RADIOLABELED LIGANDS FOR THE P2Y12 RECEPTOR PROTOCOL 2
Competition experiments are conducted to determine the relative affinities of various
ligands for a receptor binding site. The affinity is expressed as the IC50 value, from which
an inhibition constant (Ki ) is derived to characterize the pharmacological properties of the
receptor and to quantify the amount of radioligand bound in the presence of increasing
concentrations of an unlabeled or "cold" displacer ligand. Described in the protocol below
are P2Y12 competition binding experiments using ADP as the displacer for [3 H]PSB-
0413. The same protocol can be employed with any compound that competitively interacts
with the P2Y12 site, such as 2MeSADP or AR-C69931MX.

In contrast to the saturation binding assay (Basic Protocol 1), a competitive binding
assay requires an unlabeled ligand that is used to displace [3 H]PSB-0413 from the
P2Y12 receptor. The unlabeled substance most commonly used as the displacer is ADP,
although other agents, including AR-C69931MX (American Custom Chemicals Corpo-
ration, 163706-36-3) or 2MeSADP (2-(methylthio)adenosine 5′ -diphosphate trisodium
salt hydrate (Sigma-Aldrich, M152) can be employed instead. The steps below use ADP
as the displacer ligand.

For materials, see Basic Protocol 1.

Prepare blood platelet or cell suspension

1. Prepare a fresh blood platelet or cell suspension in sufficient quantity to perform the
experiment in triplicate, as described in Basic Protocol 1.
Note that 8 ml of washed platelets (or 15 ml of cultured cell suspension) is normally
sufficient to complete a competition binding assay.

Prepare reagents
Receptor Binding
2. Prepare filters and CMF-DPBS as described in steps 2 and 3 of Basic Protocol 1.
1.35.9
Current Protocols in Pharmacology Supplement 71
 ❢❣❤✐❥ ❦❧♠♥❧♦ ADP Dilution Table for a Competition Binding Experiment on Platelets (Three Vials
per Concentration)

Initial Volume of Volume of Final Target

concentration initial CMF-DPBS volume concentration
solution solution (µl) (µl) (µl) (M)a
b
10−1 15 135 150 10−2
−2
10 15 135 150 10−3
10−3 15 135 150 10−4
10−4 15 135 150 10−5
10−5 15 135 150 10−6
10−6 15 135 150 10−7
10−7 15 135 150 10−8
10−8 15 135 150 10−9
a Concentration to use to prepare the vials for the competition binding assay : called “initial concentration of ADP” in

Table 1.35.9.
b Prepared stock solution.

Table 1.35.8 ADP Dilution Table for a Competition Binding Experiment on Cells (Three Vials per
Concentration)

Initial Volume of Volume of Final Target

concentration initial CMF-DPBS volume concentration
solution (M) solution (µl) (µl) (µl) (M)a
2 × 10−1b 15 135 150 2 × 10−2
2 × 10−2 15 135 150 2 × 10−3
2 × 10−3 15 135 150 2 × 10−4
2 × 10−4 15 135 150 2 × 10−5
2 × 10−5 15 135 150 2 × 10−6
−6
2 × 10 15 135 150 2 × 10−7
2 × 10−7 15 135 150 2 × 10−8
2 × 10−8 15 135 150 2 × 10−9
a Concentration to use to prepare the vials for the saturation binding assay : called “Initial concentration of ADP” in Table

1.35.10.
b Prepared stock solution.

3. Prepare a 100 mM ADP stock solution for platelet studies or 200 mM stock solution
for cultured cell studies. Prepare ADP dilutions from the stock solution to obtain the
desired concentrations of the "Target solution" in the appropriate volumes (see Table
1.35.7 for platelet suspension and Table 1.35.8 for cultured cell suspension).
Each "Target concentration" shown in Tables 1.35.7 and 1.35.8 corresponds to the "Initial
concentration of ADP" displayed in Tables 1.35.9 and 1.35.10.

4. Prepare a [3 H]PSB-0413 dilution at 2 × 10−7 M for platelet experiments or at 4 ×

10−7 M for cell culture studies.
The final volume for cell culture experiments is twice that for the platelet experiment.

[3 H]PSB-0413
Prepare reaction vials
Binding to P2Y12 5. Prepare three total count (TC) vials containing 25 µl of [3 H]PSB-0413 at the con-
Receptors
centration used for each cell type (see step 4).
1.35.10
Supplement 71 Current Protocols in Pharmacology
♣!"#$ ✉✈✇①✈② Preparation of Binding Vials for a Competition Experiment on Platelets
Vial number 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

a b c a b c a b c a b c a b c a b c a b c a b c a b c a b c

Radioligand added 5
(pmol)

Initial concentration 200

of radioligand (nM)

Volume of 25
radioligand
added/vial (µl)

Final concentration 20
of radioligand (nM)

ADP added (mol) 2.5 × 10−6 2.5 × 10−7 2.5 × 10−8 2.5 × 10−9 2.5 × 10−10 2.5 × 10−11 2.5 × 10−12 2.5 × 10−13 2.5 × 10−14 0

−1 −2 −3 −4 −5 −6 −7 −8 −9
Initial concentration 10 10 10 10 10 10 10 10 10 0
of ADP (M) a

Volume of ADP 25
added (µl)

Final concentration 10−2 10−3 10−4 10−5 10−6 10−7 10−8 10−9 10−10
of ADP (M)

Volume of PBS 25
added (µl)

Volume of platelet 200

suspension added
(µl)

Total volume of 250

mixture/vial (µl)

a These “Initial concentration of ADP” values correspond to the “Target concentration” obtained in Table 1.35.7.

6. Prepare, in triplicate, competitive binding reaction vials containing both of the fol-
lowing: (see Table 1.35.9 for platelet suspension and Table 1.35.10 for cultured cell
suspension):

25 µl of decreasing concentrations of ADP to obtain final concentrations ranging

from 10−10 to 10−2 M. Also prepare a set of triplicate vials containing 25 µl
of CMF-DPBS instead of ADP
25 µl of [3 H]PSB-0413 to obtain a final concentration of 20 nM.
7. Follow steps 9 to 13 of Basic Protocol 1 for conducting the binding assay and for
quantifying radioactivity bound to the P2Y12 receptor.
Analyze data
8. Plot the concentration of bound ([3 H]PSB-0413]) against the log of the concentration
of the unlabeled ligand present in the incubation vial (log[ADP] in Fig. 1.35.5).
GraphPad Prism can be used to plot competitive binding curves. Select a nonlinear
regression from the "One site – fit Ki " plotting option for competitive binding, as there
is only one ADP binding site on the P2Y12 receptor (Zhang et al., 2014a; Zhang et al.,
2014b). This graphical representation allows determination of the inhibition constant
(IC50 ). The IC50 is the concentration of competitor that displaces 50% of the radioligand
from the receptor. The Ki is determined using the Cheng-Prusoff equation (Cheng and
Prusoff, 1973). GraphPad Prism software calculates the Ki automatically when the Kd of
the radioligand is entered into the system.

9. Determine the IC50 and Ki from the competitive binding curve.

Receptor Binding

1.35.11
Current Protocols in Pharmacology Supplement 71
③④⑤⑥⑦ ⑧⑨⑩❶⑨⑧❷ Preparation of Binding Vials for a Competition Experiment on Cells
Vial number 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

a b c a b c a b c a b c a b c a b c a b c a b c a b c a b c

Radioligand added 10
(pmol)

Initial concentration 400

of radioligand (nM)

Volume of 25
radioligand
added/vial (µl)

Final concentration 20
of radioligand (nM)

ADP added (mol) 5×10−6 5 × 10−7 5 × 10−8 5 × 10−9 5 × 10−10 5 × 10−11 5 × 10−12 5 × 10−13 5 × 10−14 0

−1 −2 −3 −4 −5 −6 −7 −8 −9
Initial concentration 2 × 10 2 × 10 2 × 10 2 × 10 2 × 10 2 × 10 2 × 10 2 × 10 2 × 10 0
of ADP (M)a

Volume of ADP 25
added (µl)

Final concentration 10−2 10−3 10−4 10−5 10−6 10−7 10−8 10−9 10−10
of ADP (M)

Volume of PBS 25
added (µl)

Volume of cell 450

suspension added
(µl)

Total volume of 500

mixture/vial (µl)

a These “Initial concentration of ADP” correspond to the “Target concentration” obtained in Table 1.35.7.

❸❹❺❻❼⑦ ⑧⑨⑩❶⑨❶ Competition between ADP and [3 H]PSB-0413 for binding to 13.21.N1 cells trans-
fected with a wild-type P2Y12 receptor. The concentration of bound [3 H]PSB-0413 is plotted as a
function of the log [ADP]. [[3 H]PSB-0413] was calculated using the specific activity of the radioli-
gand measured in the TC vials (36,898 cpm/pmol). The IC50 of ADP is defined as the concentration
of ADP that displaces 50% of the radioligand (L*) from the receptor. Ki is calculated from IC50 and
Kd according to the Cheng-Prusoff equation (Cheng and Prusoff, 1973). In this experiment, Ki for
ADP was 4.79 µM.

The competition between [3 H]PSB-0413 and ADP for binding to heterologous

[3 H]PSB-0413 13.21.N1 astrocytoma cells transfected with a wild-type P2Y12 receptor is displayed
Binding to P2Y12 on Figure 1.35.5 and Table 1.35.11. The Ki for ADP in this experiment was
Receptors
4.79 µM.
1.35.12
Supplement 71 Current Protocols in Pharmacology
❽❾❿➀➁ ➂➃➄➅➃➂➂ Raw and Transformed Data for a Competitive Binding Experiment on 13.21.N1
Cells Transfected with a Wild-Type P2Y12 Receptora

ADP added (M) Bound Bound [3 H]PSB-0413 (M)

[3 H]PSB-0413 (cpm)
± SD
1 × 10−2 65 ± 8 3.17 × 10−12 ± 0.30 × 10−12
−3
1 × 10 77 ± 5 3.80 × 10−12 ± 0.20 × 10−12
1 × 10−4 115 ± 3 5.66 × 10−12 ± 0.20 × 10−12
1 × 10−5 283 ± 4 1.39 × 10−11 ± 0.01 × 10−11
1 × 10−6 420 ± 52 2.06 × 10−11 ± 0.20 × 10−11
1 × 10−7 451 ± 12 2.21 × 10−11 ± 0.07 × 10−11
1 × 10−8 452 ± 44 2.22 × 10−11 ± 0.20 × 10−11
1 × 10−9 407 ± 42 2.00 × 10−11 ± 0.20 × 10−11
1 × 10−10 432 ± 32 2.12 × 10−11 ± 0.10 × 10−11
a The raw data for binding (in cpm) were converted into the concentration of bound [3 H]PSB-0413 using the specific

activity of the radioligand measured in the TC vials (36,898 cpm/pmol).

PREPARATION OF WASHED BLOOD PLATELETS SUPPORT

PROTOCOL 1
Characterization of the platelet P2Y12 receptor requires the use of resting, washed blood
platelets (Cazenave et al., 2004).
Materials
Tyrode’s buffer containing 0.35% HSA (see recipe)
Healthy blood donor or patient
Acid-citrate-dextrose anticoagulant
?5 U/µl? heparin (Cerp Rhin Rhone Mediterrannée, cat. no. ANM 3048450)
?10−3 M? prostaglandin I2 (PGI2 ; Sigma, cat. no. P6188)
Apyrase (ATP diphosphohydrolase 3.6.1.5; ?Supplier?; cat. no.?)

15- and 50-ml conical centrifuge tubes (e.g., Sarstedt or Corning Falcon)
Centrifuge (e.g., Sorvall RC3BP)
Automated blood cell counter (e.g., SYSMEX XE-2100)

1. Prepare 200 ml of Tyrode’s buffer containing 0.35% HSA.

2. Collect fresh whole blood drawn into acid-citrate-dextrose anticoagulant from a
healthy donor or a patient.
3. Centrifuge the fresh whole blood using the parameters shown in Table 1.35.12.
4. Transfer the platelet-rich plasma (PRP) into a new vial and incubate for 10 min at
37°C. Centrifuge according to the parameters displayed in Table 1.35.12.
5. Add 2 µl/ml of heparin (5 U/ml) and 0.5 µl/ml of PGI2 (10−3 M) to 30 ml of
Tyrode’s buffer containing 0.35% HSA.
6. Following centrifugation of the PRP, remove the platelet-poor plasma (PPP) and
resuspend the platelet pellet in 30 ml of Tyrode’s buffer containing 0.35% HSA,
heparin, and PGI2 from step 5.
7. Incubate the suspension for 10 min at 37°C. Add ?an additional? 0.5 µl/ml of PGI2
(10−3 M) and centrifuge 8 min at 1900 × g, 37°C. Employ the same centrifugation
Receptor Binding
acceleration and deceleration parameters as were used for preparing the PRP.
1.35.13
Current Protocols in Pharmacology Supplement 71
 ➆➇➈➉➊ ➋➌➍➎➌➋➏ Preparation of Washed Platelets: Centrifugation Parameters
Blood/PRP quantity (ml) RCF ((× g)) Time (min) Menu

15-ml vial 50-ml vial

QC run : NO
15 50 250 16 slow start: NO
Blood 10 40 250 15 slow stop: Y
6 25 250 13 deceleration 8
brake off: NO
set up run: NO
10 40 2200 16 QC run : NO
9 35 2200 15 slow start: NO
PRP 8 30 2200 14 slow stop: Y
6,5 25 2200 13 deceleration 10
5 20 2200 12 brake off: NO
4,5 15 2200 10 set up run: NO

8. Add 0.5 µl/ml of PGI2 (10−3 M) to 30 ml of Tyrode’s buffer containing 0.35% HSA.
9. After centrifugation of the platelet suspension, remove the supernatant with a
pipet and resuspend the platelet pellet in 30 ml of Tyrode’s buffer containing
0.35% HSA and PGI2 . Determine the platelet count in an automated blood cell
counter.
10. Incubate the suspension for 10 min at 37°C, then add 0.5 µl/ml of PGI2 (10−3 M)
and centrifuge 8 min at 1900 × g, 37°C. Remove the supernatant.
11. Add the appropriate volume of Tyrode’s buffer containing 0.35% HSA to obtain a
platelet suspension with a final count of 6 × 105 platelets/µl. Add 0.02 U/ml of the
ADP scavenger apyrase.
This concentration of ADP scavenger apyrase will prevent the desensitization of platelet
ADP receptors during storage.

12. Following centrifugation of the platelet suspension, remove the supernatant and
resuspend the platelet pellet in the appropriate volume of Tyrode’s buffer containing
0.35% HSA and apyrase to obtain 6 × 105 platelets/µl.
The platelets must be kept at 37°C throughout all experiments. Wait 30 min before
initiating the binding experiments to ensure there is no trace of apyrase in the supernatant.

SUPPORT PREPARATION OF A CELL SUSPENSION TO CHARACTERIZE P2Y12

PROTOCOL 2 RECEPTORS ON THE CELL SURFACE
A suspension containing 2×106 cells/ml is used to characterize P2Y12 receptors on the
cell surface. Shown below is a protocol used to prepare such a suspension using adherent
or suspended cultured cells.
Materials
Adherent cell line: e.g., 13.21N1 astrocytoma cells (ATCC #??) cultured in
[3 H]PSB-0413 175-cm2 flasks
Binding to P2Y12 Dulbecco’s phosphate-buffered saline without Ca or Mg (CMF-DPBS; Life
Receptors
Technologies, cat. no. 14190-094)
1.35.14
Supplement 71 Current Protocols in Pharmacology
 ➐➑➒➓➔→ →➣➓➑↔↕↕ ➙➔➛➜↔ ➐↔➝➞➟➠➡➠➢➛↔↕➤ ➝➥➦➧ ➟➠➧ ➨➩➫➭➯➲➭➩➳➵➸➺→➺ ➻↔➼➛➽➻ ➙➔➛➜↔
Technologies, cat. no. 424230-025) containing ??% fetal bovine serum (FBS)
Bovine serum albumin (BSA), fatty acid–free (Sigma-Aldrich, cat. no. A1887)
50-ml conical centrifuge tubes (Sarstedt, cat. no. 62547254,)
Cell counter or hemacytometer
Centrifuge
NOTE: Begin this protocol at step 5 when using a cultured cell line in suspension.

1. Remove the medium from the plate of adherent cells.

Because a saturation experiment requires the determination of total and nonspecific bind-
ing, two 175-cm2 flasks containing 6 × 107 cells are needed, whereas one 175-cm2 flask
is sufficient for a competition experiment.

2. Wash the cells twice with 10 ml of CMF-DPBS by adding the CMF-DPBS to the
monolayer and then aspirating.
3. Add 6 ml of TrypLE Express and incubate the samples at room temperature for 3 min
or until all the cells detach.
4. Add 14 ml of DMEM medium containing ??% serum and transfer all the cells into a
50-ml conical centrifuge tube.
5. Determine the cell concentration using a cell counter or hemacytometer.
6. Take an aliquot corresponding to the needed quantity of cells and centrifuge 5 min at
100 × g, room temperature. Remove the supernatant.
7. Resuspend the cultured cell pellet in the appropriate volume of CMF-PBS containing
0.1% BSA to a concentration of 2 × 106 cells/ml.
8. Store the suspension at 37°C until the experiment.

REAGENTS AND SOLUTIONS

Use deionized, distilled water in all recipes and protocol steps. For common stock solutions, see
APPENDIX 2A.

ADP for competition assay

For platelet experiments: Prepare a 100 mM solution of ADP immediately before
use by dissolving 7.0 mg of ADP (adenosine 5′ -diphosphate sodium salt; Sigma-
Aldrich, cat. no. A2754) in 164 µl of cold CMF-DPBS (Life Technologies, cat. no.
14190-094). Keep on ice.

For cell culture experiments: Prepare a 200 mM solution of ADP immediately before
use by dissolving 14.0 mg of ADP (adenosine 5′ -diphosphate sodium salt; Sigma-
Aldrich, cat. no. A2754) into164 µl of cold CMF-DPBS. Keep on ice.
ADP for saturation assay
For platelet experiments: Prepare a 10 mM solution of ADP immediately before
use. To this end, weigh out 5.0 mg of ADP (adenosine 5′ -diphosphate sodium salt;
Sigma-Aldrich, cat. no. A2754) and dissolve it in 1.17 ml of cold CMF-DPBS. Store
on ice until use.

For cell culture experiments: Prepare a 20 mM solution of ADP immediately before

use. In this case, dissolve 10.0 mg of ADP adenosine 5′ -diphosphate sodium salt
(Sigma-Aldrich, cat. no. A2754) into 1.17 ml of cold CMF-DPBS (adenosine 5′ -
diphosphate sodium salt; Sigma-Aldrich, cat. no. A2754). Store on ice until use.
Receptor Binding

1.35.15
Current Protocols in Pharmacology Supplement 71
 3
➾ H]PSB-0413 dilutions
For platelet experiments: Prepare a 2 × 10−7 M solution of [3 H]PSB-0413 im-
mediately before use by adding 10 µl of the stock 2 × 10−5 M solution of the
radioligand (GE Healthcare) to 990 µl of cold CMF-DPBS (Life Technologies, cat.
no. 14190-094). Keep on ice. See Table 1.35.1 for concentrations/volumes to use in
the assay.

For cell culture experiments: Prepare a 4 × 10−7 M solution of [3 H]PSB-0413

immediately before use by adding 20 µl of the stock 2 × 10−5 M solution of the
radioligand (GE Healthcare) to 980 µl of cold CMF-DPBS (Life Technologies, cat.
no. 14190-094). Keep on ice. See Table 1.35.2 for concentrations/volumes to use in
the assay.
All the reagents described in this section must be maintained at 4°C until the experiment is
initiated.

Tyrode’s buffer containing 0.35% HSA

Prepare 200 ml of a stock solution of Tyrode’s buffer (137 mM NaCl, 2 mM KCl,
12 mM NaHCO3 , 0.3 mM NaH2 PO4 , 1 mM MgCl2 , 2 mM CaCl2 , 5.5 mM glucose,
5 mM HEPES, pH 7.3) containing 0.35% human serum albumin (HSA). Store up to
?? at ??ºC.

COMMENTARY
Background Information the number of P2Y12 receptors per cell is
Prior to 2005, the only way to quantify unknown, saturation studies are needed to
and characterize P2Y12 receptors on blood establish the level of receptor expression
platelets was to use the nonselective, radio- (Bmax ) before assessing the affinities of other
labeled P2Y agonist [33 P]2-methylthio-ADP ligands for the site or exploring downstream
(Chhatriwala et al., 2004) in the presence of a signaling and second messenger systems. If
P2Y1 antagonist such as MRS2179 (Baurand the Bmax is too low, the nonspecific/specific
et al., 2001; Jacobson and Boeynaems, 2010). binding ratio will be too high, compromising
The development of [3 H]PSB-0413, the first the interpretation of the findings.
selective radiolabeled P2Y12 receptor antag-
onist, made possible the direct quantification
of P2Y12 receptors even in the presence of Number of measurements in a binding assay
Basic Protocols 1 and 2 provide practical
other types of P2Y binding sites. In addition,
guidelines for obtaining an accurate estimate
a tritium-labeled ligand is preferred over one
of the binding parameters used to character-
containing 33 P or 125 I.
ize P2Y12 receptors and P2Y12 ligands. Be-
cause the Kd of [3 H]PSB-0413 is approxi-
Critical Parameters mately 5 nM, the minimal number of exper-
Nonspecific and specific binding imental points needed for saturation studies
In saturation experiments, the nonspecific is 10 if the recommended concentrations (Ta-
binding is non-saturable and should represent bles 1.35.3 and 1.35.4) of radioligand are em-
less than 10% of the total binding. If it ployed. However, the number of experimen-
exceeds 10%, the number of specific binding tal points may be increased if the quantity of
sites in the reaction is too low for accurate cells is not limited. This is more difficult to
measurement. For the P2Y12 receptor, the accomplish if the experiments are performed
quantity of receptors is increased by increas- on human or rodent blood platelets. Likewise,
ing the number of platelets or cultured cells in for competition studies, the number of exper-
the assay tubes. For platelets, the number of imental points may be increased above 10 by
P2Y12 receptors per platelet is approximately including additional concentrations.
450. Thus, a 200-µl aliquot of platelet
suspension containing 600,000 platelets/µl is Troubleshooting
[3 H]PSB-0413 recommended for performing either saturation Common problems encountered with lig-
Binding to P2Y12 or competition experiments. For any other and binding experiments, along with trou-
Receptors
cells, and especially transfected cells, where bleshooting hints, are listed on Table 1.35.13.
1.35.16
Supplement 71 Current Protocols in Pharmacology
➚➪➶➹➘ ➴➷➬➮➷➴➬ Troubleshooting Guide for Receptor Binding
Problem Possible explanations Solutions proposed
No binding Number of receptors Increase the number of receptors (increase
is too low the number of cells or the density of
expression of the receptor on the cells)
Concentration of Increase the concentration of radioligand
radioligand is too low
Radioligand is too Check the expiry date indicated by the
old (several years) manufacturer
No specific binding Number of receptors Increase the number of receptors (increase
is too low the number of cells or the density of
expression of the receptor on the cells)
High nonspecific binding Radioligand binds to Increase the number of washing steps
the filter
Increase cell/platelet number

Table 1.35.14 Normal Ranges of Kd and Bmax Observed in Wild-Type Human and Mouse Blood
Platelets and Platelet Membranes

Kd (nM) Bmax
Human platelets 3.3 ± 0.6 425 ± 50 sites/platelet
Human platelet membranes 6.5 ± 3.6 0.5 ± 0.2 pmol/mg
Mouse platelets 14 ± 4.5 634 ± 87 sites/platelet
Mouse platelet membranes 9.1 ± 5.3 0.7 ± 0.3 pmol/mg

Anticipated Results Table 1.35.15 Ki of Various [3 H]PSB-0413

Saturation binding assays are used to quan- Displacer Agents Obtained from Experi-
titatively assess the expression of P2Y12 re- ment Performed on Human Bood Platelets
ceptor on cell membranes. Regardless of the (Ohlmann et al., 2013)
cell type, the receptors can be quantified accu-
rately only if the specific radioligand binding Ki ± SD
is saturable and reaches a plateau, and if the AR-C69931MX 1.5 ± 0.26 nM
nonspecific binding is less than 10% of the to-
2MeSADP 32.1 ± 3.03 nM
tal binding. To date, human and blood platelets
are the only non-transfected cells found to be ADPβS 7.3 ± 1.76 µM
useful for studying the P2Y12 receptor with ADP 75 ± 29.3 µM
[3 H]PSB-0413 as the labeling ligand. The typ-
ical range of Kd and Bmax values for these sites
on fresh platelets or platelet membranes are ceptors is known, competition experiments to
shown on Table 1.35.14 (Barber and Jamieson, evaluate the potency of various ligands for the
1970; Broekman, 1992). Various compounds site can be undertaken. Of the various cultured
have been identified (Ohlmann et al., 2013) cell lines examined, only the 13.21.N1 astrocy-
as competitive displacers of [3 H]PSB-0413 toma, HEK, and Jurkat cells have been found
binding to human platelet P2Y12 receptors to be devoid of endogenous P2Y12 receptors.
(Table 1.35.15). To date, no differences in binding characteris-
The level of expression of the P2Y12 recep- tics have been observed among these the cell
tors on transfected cells depends on the trans- types.
fection parameters. From our experience, a
level of expression of several thousands (3,000
Time Considerations
to 30,000) of receptors per cell is sufficient For blood platelet experiments
to perform competition binding experiments. The procedure for washing blood platelets
Once the level of expression of the P2Y12 re- Receptor Binding
is somewhat lengthy and needs to be mastered
1.35.17
Current Protocols in Pharmacology Supplement 71
 ➱✃❐❒❮✃ ❰&❰'❰('❰&) ➱❰&*❰&) ✃+,✃❮❰-✃&'./ 0❒❮ ( tive signal transduction in the platelet P2Y12
blood donor without thrombocytopenia, it receptor of a patient with congenital bleeding.
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100:1978-1983.
takes approximately 2.5 hr for an experienced
doi: 10.1073/pnas.0437879100.
technician to obtain 20 ml of washed platelet
Cazenave, J.P., Ohlmann, P., Cassel, D., Eckly, A.,
suspension at a concentration of 600,000
Hechler, B., and Gachet, C. 2004. Preparation
platelets/µl from 50 to 100 ml of whole blood. of washed platelet suspensions from human and
For the binding experiment, 2 hr are required rodent blood. Methods Mol. Biol. 272:13-28.
to prepare the reagents and labeled vials, with Cheng, Y. and Prusoff, W.H. 1973. Relationship
the binding assay itself requiring 2 hr, and 1 between the inhibition constant (K1) and the
hr is needed before placing the samples in the concentration of inhibitor which causes 50 per
scintillation counter. The time needed to quan- cent inhibition (I50) of an enzymatic reac-
tion. Biochem. Pharmacol. 22:3099-3108. doi:
tify the radioactivity in each sample depends
10.1016/0006-2952(73)90196-2.
on the number of vials. Typically, for an ex-
Chhatriwala, M., Ravi, R.G., Patel, R.I., Boyer,
periment involving 60 vials, a counting time
J.L., Jacobson, K.A., and Harden, T.K. 2004.
of 5 to 6 hr is needed. In general, 12 to 13 hr Induction of novel agonist selectivity for the
are required from the time of blood collection ADP-activated P2Y1 receptor versus the ADP-
to acquisition of the raw data. activated P2Y12 and P2Y13 receptors by con-
formational constraint of an ADP analog. J.
Pharmacol. Exp. Ther. 311:1038-1043. doi:
For cell experiments 10.1124/jpet.104.068650.
A sufficient number of cells in culture must
Daly, M.E., Dawood, B.B., Lester, W.A., Peake,
be available to perform the saturation or com- I.R., Rodeghiero, F., Goodeve, A.C., Makris,
petitive binding experiments. A cultured cell M., Wilde, J.T., Mumford, A.D., Watson, S.P.,
suspension can be prepared within 30 min. The and Mundell, S.J. 2009. Identification and char-
subsequent steps require the same amount of acterization of a novel P2Y 12 variant in
a patient diagnosed with type 1 von Wille-
time as for washed platelets. Thus, <10 to 11
brand disease in the European MCMDM-
hr will elapse between preparation of the cul- 1VWD study. Blood 113:4110-4113. doi:
tured cell suspension and acquisition of the 10.1182/blood-2008-11-190850.
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Cazenave, J.P., Bourguignon, J.J., and Gachet, methyl-(N)-methanocarba-2’-deoxyadenosine-
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1.35.18
Supplement 71 Current Protocols in Pharmacology
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Receptor Binding

1.35.19
Current Protocols in Pharmacology Supplement 71
5.3 Annexe 3

Identification of a new dysfunctional platelet P2Y12 receptor variant, associated

with bleeding diathesis

Blood, 5 February 2015, Volume 125, Number 6

144
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Regular Article

PLATELETS AND THROMBOPOIESIS

Identification of a new dysfunctional platelet P2Y12 receptor variant

associated with bleeding diathesis
Anna Lecchi,1 Cristina Razzari,2 Silvia Paoletta,3 Arnaud Dupuis,4 Lea Nakamura,5 Philippe Ohlmann,4 Christian Gachet,4
Kenneth A. Jacobson,3 Barbara Zieger,5 and Marco Cattaneo2
1
Angelo Bianchi Bonomi Hemophilia and Thrombosis Center, Fondazione Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico Ca’ Granda - Ospedale
Maggiore Policlinico, Milan, Italy; 2Divisione di Medicina 3, Ospedale San Paolo, Dipartimento di Scienze della Salute - Università degli Studi di Milano,
Milan, Italy; 3Molecular Recognition Section, Laboratory of Bioorganic Chemistry, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, National
Institutes of Health, Bethesda, MD; 4Unité Mixte de Recherche_S949, Inserm, Université de Strasbourg, Etablissement Français du Sang-Alsace,
Strasbourg, France; and 5Department of Pediatrics and Adolescent Medicine, University Medical Center Freiburg, Freiburg, Germany

Defects of the platelet P2Y12 receptor (P2Y12R) for adenosine diphosphate (ADP) are as-
Key Points
sociated with increased bleeding risk. The study of molecular abnormalities associated
• Two patients with bleeding with inherited qualitative defects of the P2Y12R protein is useful to unravel structure-
diathesis had dysfunctional function relationships of the receptor. We describe the case of 2 brothers, sons of first
platelet P2Y12R for ADP, cousins, with lifelong history of abnormal bleeding, associated with dysfunctional
attributable to homozygous P2Y 12 R and a previously undescribed missense mutation in the encoding gene.
ADP (4-20 mM)–induced aggregation of patients’ platelets was markedly reduced and
His187Gln mutation.
rapidly reversible. Other agonists induced borderline-normal aggregation. Inhibi-
• These studies delineate
tion of vasodilator-stimulated phosphoprotein phosphorylation and prostaglandin
a region of transmembrane 5 E –induced increase in cyclic adenosine monophosphate (cAMP) by ADP was impaired,
1
of P2Y12R that is required for whereas inhibition of cAMP increase by epinephrine was normal. [3H]PSB-0413, a
normal function after ADP selective P2Y12R antagonist, bound to a normal number of binding sites; however, its
binding. affinity, and that of the agonists ADP and 2-methylthio-adenosine-59-diphosphate,
was reduced. Patients’ DNA showed a homozygous c.847T>A substitution that
changed the codon for His-187 to Gln (p.His187Gln). Crystallographic data and molecular modeling studies indicated that
His187 in transmembrane 5 is important for agonist and nucleotide antagonist binding and located in a region undergoing
conformational changes. These studies delineate a region of P2Y12R required for normal function after ADP binding. (Blood. 2015;
125(6):1006-1013)

Introduction
P2Y12, which maps to chromosome 3q21-q25, is 1 of the 2 receptors adenosine monophosphate (cAMP) or the phosphorylation of
for adenosine diphosphate (ADP) that are expressed by platelets.1,2 vasodilator-stimulated phosphoprotein (VASP) after the exposure of
It is a G inhibitory protein (Gi)-coupled receptor that plays an im- platelets to prostaglandin (PG) E1 or other stimuli for adenylyl cyclase,
portant role both in hemostasis and thrombosis. This role is dem- should be used to confirm the diagnosis.2,6
onstrated by the observations that patients with inherited defects of The study of molecular abnormalities associated with inherited
the receptor display a bleeding diathesis2,3 and patients with clinical qualitative defects of the P2Y12R protein is useful to unravel structure-
manifestations of atherothrombosis are protected from major adverse function relationships of the receptor. Mutations in the region that
cardiovascular events by P2Y12 receptor (P2Y12R) inhibitors.4 spans the transition between transmembrane helix (TM) 6 and extra-
Congenital P2Y12R defects are autosomal recessive disorders, as- cellular loop (EL) 3 are associated with receptor dysfunction despite
sociated with qualitative or quantitative abnormalities of the receptor.2 normal ligand binding, suggesting that this region of the molecule plays
Affected patients display a bleeding diathesis of variable severity, a role in signal transduction.2,7-9 A heterozygous mutation, predicting
characterized by mucocutaneous bleeding and excessive postsurgi- a lysine to glutamate (p.Lys174Glu) substitution in the P2Y12R, was
cal or posttraumatic blood loss. The most typical platelet function identified in 1 patient with reduced and reversible aggregation in
abnormality of the disorder, which should raise the diagnostic sus- response to ADP and an ;50% reduction in binding of agonist radio-
picion of the disease, is the failure by ADP, even at very high con- ligand [3H]2-methylthio-adenosine-59-diphosphate (2MeSADP).10
centrations (.10 mM), to induce full and irreversible platelet Considering that Lys174 is situated in the EL2 of the P2Y12R,
aggregation.2,5 Tests that evaluate the degree of inhibition of adenylyl adjacent to Cys175, which may be important for the integrity of the
cyclase by ADP, by measuring either the platelet levels of cyclic ADP binding site on the receptor,11 and that a hemagglutinin-tagged

Submitted July 26, 2013; accepted November 21, 2014. Prepublished online There is an Inside Blood Commentary on this article in this issue.
as Blood First Edition paper, November 26, 2014; DOI 10.1182/blood-2013-
The publication costs of this article were defrayed in part by page charge
07-517896.
payment. Therefore, and solely to indicate this fact, this article is hereby
B.Z. and M.C. contributed equally to this study. marked “advertisement” in accordance with 18 USC section 1734.

1006 BLOOD, 5 FEBRUARY 2015 x VOLUME 125, NUMBER 6

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BLOOD, 5 FEBRUARY 2015 x VOLUME 125, NUMBER 6 NEW DYSFUNCTIONAL PLATELET P2Y12 RECEPTOR VARIANT 1007

p.Lys174Glu P2Y12R variant showed surface expression in Chinese preparation of washed platelet suspensions, 6 volumes of blood were drawn
hamster ovary cells, it was hypothesized that the p.Lys174Glu into 1 volume of acid-citrate-dextrose anticoagulant, centrifuged at 200g for
mutation inhibits ADP binding to the receptor. Recently reported 10 minutes to obtain PRP, which was used to prepare twice-washed platelet
crystallographic data12,13 do not show a direct involvement of Lys174 suspensions, according to the method described by Mustard et al,21 with the
exception that 500 nmol/L PGI2 was added during the first and second
in agonist binding but rather a role in stabilizing the receptor confor-
washes. Platelet counts in washed platelet suspensions were adjusted to
mation through interresidue ionic interactions and/or in affecting the 3 3 1011/L.
approach of the ligand to its binding site. In one patient, with no
personal history of abnormal bleeding, reduced expression of P2Y12R
Studies of platelet aggregation and secretion
was associated with the heterozygous mutation p.Pro341Ala, in
a putative postsynaptic density 95/disc large/zonula occludens- The first screening of platelet aggregation in patient III-7 was performed in
1–binding motif, most likely as a consequence of significantly Freiburg (Germany), using the light transmission aggregometer APACT 4
compromised P2Y12R recycling.14 (Labor Fibrintimer, Ahrensburg, Germany), and collagen (Nycomed, Austria)
Here, we report the case of an index patient and his brother, with and ADP (MP Biomedicals) as agonists. Two separate sets of experiments
an inherited dysfunctional P2Y12R associated with a normal num- were subsequently done in Milan (Italy), where platelet aggregation and
secretion were studied simultaneously by lumi-aggregometry. Samples of
ber of platelet binding sites but reduced affinity for the P2Y12R an-
PRP (0.45 mL) were incubated with 50 mL luciferine/luciferase reagent at
tagonist radioligand [3H]2-Propylthioadenosine-59-adenylic acid 37°C for 30 seconds and stirred at 1000 rpm in a lumi-aggregometer (Lumi-
(1,1-chloro-1-phosphonomethyl-1-phosphonyl)anhydride ([3H]PSB- aggregometer; Chrono-log Corp.). After incubation, 10 mL of an aggregating
0413),15,16 ADP, and 2MeSADP, and with homozygous c.847T.A agent was added, and the aggregation and ATP secretion tracings were re-
substitution, which changed the codon for His187 to Gln (p.His187Gln). corded for 3 minutes. Platelet aggregation of patient III-1 was studied in
Strasbourg (France) in an APACT 4004 aggregometer.

Binding of fluorescein-conjugated fibrinogen to

Methods activated platelets

Patients and controls To measure the binding of fibrinogen to activated platelets, aliquots of 100 mL
PRP (5 3 1010/L) were mixed with fluorescein-conjugated fibrinogen (final
The proband (III-7 in Figure 1) is a 45-year-old man living in Germany, who concentration 150 mg/mL) and were stimulated with different concentrations
belongs to a large family of Turkish origin (Figure 1). He presented with of ADP (0.25-2.0 mmol/L). After 3 minutes incubation, 100 mL 1% form-
recurrent epistaxis, postoperative bleeding after tooth extraction, thyroid ex- aldehyde was added at room temperature. Platelets were then washed with
plantation because of thyroid hyperplasia, and spleen explantation, consequent phosphate-buffered saline and then diluted in 500 mL phosphate-buffered
to spleen rupture in a car accident. He had normal platelet count (307 3 109/L), saline for analysis on FACS Calibur (Becton Dickinson, Germany). Histo-
screening coagulation tests (prothrombin time and activated partial thrombo- grams were obtained from 5000 cells, and the data were analyzed using the
plastin time), and plasma levels of von Willebrand factor antigen and ristocetin software CellQuest Pro (Becton Dickinson). Mean fluorescence intensities
cofactor activity. Serum thromboxane B2 levels and the platelet contents of (MFIs) vs cell number were expressed in a linear mode.
serotonin, ADP, adenosine triphosphate (ATP), and fibrinogen were normal.
Blood samples for genetic studies were available from his parents, who are first
cousins, and 9 relatives (2 grandparents and 7 brothers and sisters), with neg- Binding of [3H]PSB-0413 to washed platelets
ative, mild, or severe bleeding history. The 57-year-old brother, with severe Binding experiments were performed using [3H]PSB-0413, which is a tritiated
bleeding history (III-1, Figure 1), also provided blood samples for platelet derivative of a selective nucleotide antagonist of the P2Y12R, AR-C67085MX
function studies. [2-propylthioadenosine-59-adenylic acid (1,1-chloro-1-phosphonomethyl-1-
A total of 36 healthy subjects, with no personal history of abnormal bleed- phosphonylanhydride)], and 9 3 107 washed platelets.15 Nonspecific binding
ing, were also studied. All subjects gave consent to the study. was defined in the presence of 1 mM ADP. Washed platelets were incubated
with the ligand at 37°C for 5 minutes; then bound and free radioactivity was
Materials separated by filtration through Whatman GF/B glass-fiber filters. Filters were
[3H]PSB-0413 was prepared by catalytic hydrogenation with tritium gas (GE then washed with 5 3 2 mL of ice-cold washing buffer (Tris HCl, 50 mM, pH
Healthcare, Buckinghamshire, UK) of the propargyl precursor PSB-0412 7.5; EDTA, 1 mM; MgCl2, 5 mM; NaCl, 100 mM). Filter-bound radioactivity
as described.15 ADP, 2MeSADP, collagen, the thromboxane/prostaglandin was counted in 2-mL liquid scintillation counter. Assays were performed in
endoperoxide analog 9,11-dideoxy-11,9-epoxymethano-prostaglandin F2, triplicate in 3 independent experiments, 2 in III-7 and 1 in III-1.
thrombin receptor activating peptide 6, PGE1, and PGI2, were from Sigma Competition experiments were performed in triplicate using a fixed con-
(St. Louis, MO). Apyrase was purified from potatoes.17 Commercial prepa- centration of [3H]PSB-0413 (200 nM) and increasing concentrations of ADP
rations of luciferin/luciferase reagent were used to measure the platelet (10210-1022 M) or 2MeSADP (10211-1024 M) at 37°C for 5 minutes.
ATP and ADP contents (ATP Assay Kit; BioOrbit Oy, Turku, Finland), and
platelet secretion concurrently with platelet aggregation (Chronolume; Measurement of platelet cAMP
Chrono-log Corp., Havertown, PA). Serum thromboxane B2 was measured by
a commercially available enzymatic immunoassay (Thromboxane B2 EIA Platelet cAMP was measured by a radioisotopic assay, using a commercially
kit; Cayman Chemical Co., Ann Arbor, MI). available kit (Cyclic AMP [3H] assay system; Amersham International, UK).
Duplicate samples of 1 mL citrated PRP containing 1 mM theophylline were
Preparation of platelet-rich plasma (PRP) and washed incubated with Tyrode’s buffer and PGE1 (1 mM), PGE1 and ADP or epi-
nephrine (0.1 and 1.0 mM), or Tyrode’s buffer alone in a control mixture.
platelet suspensions
After incubation at 37°C (2 minutes), 1 mL of 5% trichloroacetic acid was
For studies with PRP, 9 volumes of blood were drawn into 1 volume of added, and the samples were snap-frozen in dry ice and methanol, thawed
109 mmol/L trisodium citrate and then centrifuged at 200g for 10 minutes.18,19 at ambient temperature, and then shaken at 4°C for 45 minutes. After
The supernatant PRP was transferred into a clean plastic tube; the platelet centrifugation at 4°C for 30 minutes, the supernatant was extracted 3 times
counts in PRP samples were adjusted to 2.5 3 1011/L in experiments per- with 5 mL of water-saturated ether, dried under a stream of nitrogen at 60°C,
formed in Freiburg (Germany) and not adjusted to a predefined value in and stored at 220°C. Before assay, the samples were reconstituted with
experiments performed in Milan (Italy) and Strasbourg (France).18,20 For the 0.05 mol/L Tris buffer containing 4 mmol/L EDTA.
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1008 LECCHI et al BLOOD, 5 FEBRUARY 2015 x VOLUME 125, NUMBER 6

Figure 1. Pedigree of the proband (indicated by an

arrow).

VASP phosphorylation analysis All P2Y12R structures were prepared using the Protein Preparation
Wizard tool22 implemented in the Schrödinger suite,23 adding all the hy-
The VASP phosphorylation analysis was performed immediately after
drogen atoms and the missing side chains of residues whose backbone
blood collection, using Platelet VASP (Diagnostica Stago, Asnières, France)
coordinates were observed in the structure. The orientation of polar hy-
according to the manufacturer’s instructions. Briefly, blood samples were
drogens was optimized, the protein protonation states were adjusted, and
incubated with PGE1 and ADP, alone and in combination, for 10 minutes
the overall structures were minimized with harmonic restraints on the heavy
and fixed with paraformaldehyde. Platelets were then permeabilized with
atoms, to remove strain. Then, all the heterogroups and water molecules were
a nonionic detergent, labeled with a primary monoclonal antibody (16C2),
deleted.
followed by a secondary fluorescein isothiocyanate-conjugated polyclonal
The SiteMap tool of the Schrödinger suite was used to identify potential
goat anti-mouse Ig antibody. Analyses were performed using a Becton Dick-
binding sites in the structures. Molecular docking of PSB-0413 at the agonist-
inson (Plymouth, UK) FACS Calibur flow cytometer. The platelet population
bound P2Y12R crystal and at the P2Y12 Gln-187 variant models was per-
was identified from its forward and side scatter distribution, and 10 000
formed by means of the Glide package24 from the Schrödinger suite.23 In
platelets were gated. Platelet reactivity index (PRI) was calculated from the
particular, a Glide Grid was centered on the centroid of residues located within
MFI, reflecting VASP phosphorylation, of samples incubated with PGE1 or
6 Å from the previously identified cavity. The Glide Grid was built using an
PGE1 plus ADP, according to the following formula: PRI 5 [(MFI(PGE1) –
inner box (ligand diameter midpoint box) of 14 Å 3 14 Å 3 14 Å and an outer
MFI(PGE1 1 ADP))/MFI(PGE1)] 3 100. The analysis was completed in ;30
box (box within which all the ligand atoms must be contained) that extended
minutes following blood sampling.
20 Å in each direction from the inner one. Docking of the ligand was per-
formed in the rigid binding sites using the XP (extra precision) procedure. The
Genetic studies top-scoring docking poses of the ligand were subjected to visual inspec-
Genomic DNA was isolated from peripheral blood lymphocytes using tion and analysis of protein-ligand interactions to select the final binding
standard procedures. The entire coding sequence of the P2Y12R gene was conformations.
amplified by a single polymerase chain reaction (PCR). PCR was performed
using the primers (forward) 59CCTTAGGCTGAAAATAACCATCCTC39
and (reverse) 59GCGCTTTGCTTTAACGAGTTCTGAAC39, with Dream-
Taq Green Polymerase, 103 DreamTaq Green (Fermentas ThermoFisher Results
Scientific Inc., Waltham, MA) and 29-deoxynucleoside 59-triphosphate mix
(Invitrogen-Life Technologies Corp., Carlsbad, CA). The amplified frag- Studies in patient III-7 (propositus)
ments were subjected to DNA sequence analysis by ABI 3730xl 96-capillary
DNA Analyzers (Eurofins MWG Operon, Huntsville, AL). Platelet aggregation and secretion. The platelets from patient
III-7 changed shape normally following stimulation with 1 mM ADP
Molecular modeling of the P2Y12R (not shown) and underwent aggregation in response to 4-20 mM
ADP that was markedly lower than normal and rapidly reversible
The recently resolved crystallographic structures of the human P2Y12R in
(Figure 2). The aggregation of these platelets in response to other
complex with the antagonist AZD1283 (Protein Data Bank ID: 4NTJ)12 and
with the full agonist 2MeSADP (Protein Data Bank ID: 4PXZ)13 were used
platelet agonists was normal (not shown). Very similar results were
in this study. Models of the P2Y12R Gln-187 variant, based on the agonist- obtained in experiments performed in Freiburg (Figure 2) and in
bound P2Y12R structure, were built by mutating His187 to Gln directly in the Milan (not shown). The ATP secretion from patient platelets was
structure and then by modifying its conformation by selecting 5 different, absent after stimulation by ADP, and normal after stimulation by
suitable rotamers. other agonists (Table 1).
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BLOOD, 5 FEBRUARY 2015 x VOLUME 125, NUMBER 6 NEW DYSFUNCTIONAL PLATELET P2Y12 RECEPTOR VARIANT 1009

analyzed the coding sequence of P2Y12R from DNA fragments

generated in a PCR reaction. DNA from the patient showed a
homozygous c.847T.A substitution that changed the codon for
His-187 to Gln (p.His187Gln), located in the TM5 portion of the
receptor.

Family studies

For 11 of 20 first- and second-degree relatives of the propositus, it

was possible to retrieve information on the individual bleeding his-
tory and blood samples for DNA extraction and genotyping. Seven
subjects (the grandparents, the parents, 2 sisters, and 1 brother) were
heterozygous for p.His187Gln, 1 brother and 2 sisters had wild-type
(WT) P2Y12R, and 1 brother had homozygous p.His187Gln. The
bleeding history was negative in all subjects, except in 2 sisters
(1 with heterozygous p.His187Gln P2Y12R, 1 with WT genotype)
who had a mild bleeding history, and in the brother (III-1) with homo-
zygous p.His187Gln P2Y12R, who had a severe bleeding history.
Patient III-1 underwent extensive platelet function studies in
Strasbourg (France), including platelet aggregation both in PRP
and washed platelet suspensions, inhibition of PGE1-induced in-
crease in platelet cAMP levels by ADP, and VASP phosphorylation
Figure 2. ADP-induced platelet aggregation in PRP from a normal control and assay. The results of these tests were superimposable to those ob-
from patient III-7. Numbers below the aggregation tracings indicate the concentra-
tained in the propositus and compatible with severe defect of P2Y12R
tion of ADP added (mM). These experiments were performed using the light trans-
mission aggregometer APACT 4 (Labor Fibrintimer). function. The VASP-P PRI was 1% in 2 separate experiments, sim-
ilarly to that obtained in patient III-7 in Freiburg; ADP did not inhibit
PGE1-induced increase in cAMP up to a concentration of 100 mM.
Binding of fluorescein-conjugated fibrinogen to ADP- Similarly to the propositus, binding studies of [3H]PSB-0413 to his
activated platelets. Compared with healthy controls, the amount platelets revealed that the Bmax was normal (693 sites per platelet),
of fluorescein-conjugated fibrinogen bound to platelets upon whereas the KD value was higher than normal (19.0 nM) and com-
stimulation with ADP (0.25-2.0 mmol/L) was severely impaired parable to the mean KD value calculated in the 2 experiments with the
(Figure 3). proband’s platelets. The binding affinity (Ki) values for both ADP
Inhibition of PGE1-induced increase in platelet cAMP. and 2MeSADP for bound radioligand were higher in patient III-1
The basal level of platelet cAMP was normal (12.2 pmol/109 than in a healthy control (Figure 4).
platelets; normal range: 6-17.9) and normally increased ;10- Finally, the results of preliminary experiments using 1321N1 as-
fold after stimulation with 1 mM PGE1. ADP, in a concentration- trocytoma cells expressing p.His187Gln P2Y12R were similar to
dependent manner, inhibited the production of cAMP by normal those obtained in patients’ platelets: compared with 1321N1 astro-
platelets exposed to PGE1, but this response was greatly impaired cytoma cells expressing WT P2Y12R, we observed decreased affinity
in the patient’s platelets (Table 2). In contrast to ADP, epineph- for [3H]PSB-0413 and a right shift of the displacement curves using
rine normally inhibited the production of cAMP in the patient’s ADP and 2MeSADP (data not shown).
platelets exposed to PGE1 (Table 2), suggesting that the defect
could be attributed to an abnormality in the platelet P2Y12R re-
sponsible for specifically coupling ADP stimulation to adenylyl cy-
Table 1. Secretion of platelet ATP induced by different agonists in
clase inhibition. patient III-7
VASP phosphorylation assay. The PRI value of patient’s plate-
Released ATP (nmol/108 platelets)
lets was 30% in an experiment done in Milan and 1% in a subsequent
Patient III-7, Patient III-7,
experiment done in Freiburg, compared with 78.7 6 6.7% in platelets Agonist experiment 1 experiment 2 Normal range*
from 31 normal subjects.
ADP (4 mM) Undetectable Undetectable 0.02-0.98
Binding of [3H]PSB-0413 to washed platelet suspensions.
(n 5 96)
The binding of [3H]PSB-0413 to patient platelets was measured in ADP (20 mM) Undetectable Undetectable 0.04-0.61
2 separate experiments and compared with that observed in normal (n 5 59)
volunteers. The specific binding was saturable in both cases, and Collagen (2 mg/mL) 0.46 0.47 0.17-0.93
Scatchard plot analysis yielded a linear fit. The number of binding (n 5 62)
sites per platelet (Bmax) was comparable between normal and pa- U46619 (0.5 mM) 0.02 0.03 0.02-1.03
tient platelets (Table 3); however, the dissociation constant (KD) (n 5 72)
values were higher with patient platelets than with normal platelets TRAP-6 (10 mM) Not done 0.17 0.01-1.08
(n 5 41)
(Table 3).
Characterization of the P2Y12R gene. The observation that PRP containing trisodium citrate as anticoagulant was stimulated by different
the patient platelets had a normal number of binding sites for [3H] agonists at the indicated concentrations.
TRAP-6, thrombin receptor activating peptide 6; U46619, thromboxane/
PSB-0413 in spite of a severely impaired function of the P2Y12R
prostaglandin endoperoxide analog 9,11-dideoxy-11,9-epoxymethano-prostaglandin F2.
suggested that a dysfunctional receptor was being synthesized in *The normal ranges are defined by the 2.5 and 97.5 percentiles of the distribution
normal amounts. To identify the underlying structural changes, we of values obtained in healthy subjects.
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1010 LECCHI et al BLOOD, 5 FEBRUARY 2015 x VOLUME 125, NUMBER 6

hydrophilic and ionic interactions with Lys80 (2.60), Arg93 (3.21),

Arg256 (6.55), Tyr259 (6.58), and Lys280 (7.35).
When docked at the P2Y12R p.His187Gln variant models, PSB-
0413 showed the same orientation in the binding site and similar
interactions as in the WT receptor (data not shown). However, de-
pending on the rotamer of the side chain of Gln187, the H-bonding
network involving the 29-hydroxyl group can differ. In fact, in some
rotamers Gln187 does not form any H-bond with the ligand, while in
others it can act as H-bond acceptor or H-bond donor.

Figure 3. Binding of fluorescein-conjugated fibrinogen to ADP-activated Discussion

platelets from a healthy control and patient III-7. Fluorescein-conjugated (FITC)
fibrinogen binding to PRP stimulated with the indicated concentrations of ADP Congenital defects and pharmacologic inhibition of the P2Y12R for
was measured by flow cytometry (see “Methods” for details). FITC, fluorescein ADP are associated with an increased bleeding risk, demonstrating
isothiocyanate.
the important role of this receptor in platelet function and normal
hemostasis.26 Most of the congenital defects of P2Y12R character-
Molecular modeling studies ized to date are associated with a marked decrease of the platelet
binding sites for ADP, which has been attributed to mutations that
To predict the implications of the p.His187Gln substitution at a disrupt the synthesis of the receptor,2,26-30 to alterations in the
molecular level, we performed molecular modeling studies of the ligand binding site,10 or to compromised P2Y12R recycling.14 A
P2Y12R. Two recently published crystallographic structures of the recently described patient displayed abnormalities in P2Y12R sig-
human P2Y12R,12,13 in complex with both agonist and antagonist, naling, traffic, and surface expression, which was associated with the
resulted to be very useful for this study. Moreover, models of the substitution of Arg122 with a cysteine.31 In 1 kindred, a case of a
P2Y12R p.His187Gln variant were built using the agonist-bound normal expression of the receptor that was associated with severely
P2Y12R crystal structure, to analyze the possible structural differ- defective signal transduction was described.7 Nucleotide sequence
ences because of this sequence variation. analysis of the P2Y12 gene revealed that the patient was a compound
TM5 in both P2Y12R crystal structures is unusually straight and heterozygote for 2 missense mutations that caused the substitution
tilted, because of the absence of proline (eg, position 5.50 following p.Arg256Gln (in TM6) and p.Arg265Trp (in EL3), suggesting that the
the Ballesteros-Weinstein numbering system)25 or glycine residues structural integrity of TM6 and EL3 regions is necessary for normal
in this helix in other G-protein-coupled receptors that destabilize its receptor function. A heterozygous mutation in the same region of the
straight a-helical conformation. Previous modeling attempts of the molecule, p.Pro258Thr, was later described in a patient with mild
P2Y12R based on the available crystallographic templates are impre- bleeding disorder and severely impaired ADP-induced platelet ag-
cise because of this difference. gregation, confirming that this region of the molecule is important for
In both structures, the point of mutation is located in the upper receptor function.8 The recently reported crystallographic data for
part of TM5 facing inward toward the binding site, in proximity the human P2Y12R support these findings revealing that significant
of the ligand. Comparison of the 2 different crystallographic struc- conformational changes occur in the TM6-EL3 region between the
tures, agonist and antagonist bound, revealed large conformational agonist- and antagonist-bound structures.12,13
changes occurring in TM6 and TM7 but also a slightly different ori- In the present report, we describe the case of a patient and his brother
entation of TM5. Consequently, the conformations of the residues in with lifelong bleeding disorder associated with defective P2Y12R-
this helix, including His187 (5.36), differ in the 2 structures. In the dependent platelet function, associated with normal expression of the
WT antagonist-bound P2Y12R structure, the side chain of His187 receptor but decreased affinity for its ligand. Based on the results of the
is more oriented toward TM4 and is delimiting the binding site making VASP phosphorylation assay6 and on the observation that ADP, up to
hydrophobic interactions with the ligand AZD1283. In the WT 100 mM, failed to inhibit adenylyl cyclase, we may conclude that the
agonist-bound P2Y12R structure, the side chain of His187 (5.36) is function of the mutant receptor is completely suppressed. The mod-
directly interacting through an H-bond with the 29-hydroxyl group erately reduced PRI value (30%) initially measured by the VASP-P
of 2MeSADP (Figure 5). Moreover, the aromatic ring of this his- assay in patient III-7 was not reproduced in a second experiment
tidine is perpendicular to the adenine core and can stabilize it through
hydrophobic interactions. Docking of PSB-0413 at this WT P2Y12R
Table 2. Effects of ADP and epinephrine on PGE1 (1 mM)–induced
structure closely resembles the binding mode of 2MeSADP (Figure 5). increase of cAMP levels in platelets from patient III-7 and healthy
In fact, the adenine bases of the 2 ligands occupy a common aromatic controls
binding site, forming a p-p interaction with Tyr105 (3.33) and cAMP (% of PGE1-induced)
H-bonds with Asn191 (5.40). The 2-propylthio group of PSB-0413
Patient III-7, Patient III-7, Healthy controls*
extends deeper in the same hydrophobic pocket occupied by experiment 1 experiment 2 (n 5 21)
the 2-methylthio group of the crystallized agonist and delimited
ADP (0.1 mM) 90.0 92.8 78.62 6 11.58
by Phe106 (3.34), Met152 (4.53), Leu155 (4.56), Ser156 (4.57), ADP (1.0 mM) 107.0 100.0 44.41 6 11.88
Val190 (5.39), and Cys194 (5.43). The ribose 29- and 39-hydroxyl Epinephrine (1 mM) 22.0 26.0 30.36 6 13.94
groups form H-bonding interactions with Lys179 (EL2) and
PRP containing trisodium citrate as anticoagulant was exposed to PGE1 (1 mM)
His187 (5.36) and with Lys179 (EL2) and the backbone carbonyl
in the presence or absence of ADP or epinephrine at the indicated concentrations for
of Cys97 (3.25), respectively. The noncleavable triphosphate-like 2 minutes at 37°C (see “Methods” for details).
chain of PSB-0413 is directed toward TM2 and forms numerous *Means 6 SD.
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BLOOD, 5 FEBRUARY 2015 x VOLUME 125, NUMBER 6 NEW DYSFUNCTIONAL PLATELET P2Y12 RECEPTOR VARIANT 1011

Figure 4. Competition of ADP and 2MeSADP for

binding of [3H]PSB-0413 to washed platelets from
patient III-1 and a healthy control. Higher concen-
trations of either ADP or 2MeSADP were necessary to
displace [ 3 H]PSB-0413 from the patient’s platelets,
compared with control.

(PRI 5 1%) and in 2 experiments performed in patient III-1, sug- p.His187Gln P2Y12R was essentially absent, comparable to that of
gesting that the results of the first experiment were likely inaccurate. subjects with the WT receptor, confirming previous observations.2
The bleeding histories of our proband and his brother were clin- In order to analyze the structural implications of the p.His187Gln
ically relevant and comparable to that of patients with severe P2Y12R mutation, molecular modeling studies were performed. Recently
deficiency, associated with homozygous base pair deletions in the open published crystallographic structures of the P2Y12R12,13 revealed
reading frame, resulting in frame shifts and premature truncation of the that His187 in TM5 is oriented toward the inside of the receptor
protein.5 The study of many relatives of the propositus, whose parents within the ligand binding site. In particular, the 2MeSADP-bound
were first cousins, depicts a typical inheritance pattern of recessive auto- structure showed a clear role of His187 (5.36) in agonist binding
somal diseases. The bleeding history of relatives with heterozygous because of the formation of a H-bond with the ligand’s 29-hydroxyl

Figure 5. Binding site of the human P2Y12R. Comparison of the crystallographic pose of 2MeSADP (green carbons) (A) and the docking pose of PSB-0413 (cyan carbons)
(B) at the WT agonist-bound P2Y12R crystal structure. Side chains of some amino acids important for ligand recognition are highlighted (gray carbon sticks). H-bonding and
ionic interactions are pictured as red dotted lines. Nonpolar hydrogen atoms are not displayed. In panel A, ribbon regions corresponding to residues whose mutation is
associated with a receptor dysfunction previously reported in patients are highlighted in pink and labeled with pink letters as follows: A, Lys174; B, Arg256, Pro258; and C,
Arg265.
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1012 LECCHI et al BLOOD, 5 FEBRUARY 2015 x VOLUME 125, NUMBER 6

Table 3. Binding studies of [3H]PSB-0413 on intact platelets from

the propositus (III-7) and his brother (III-1) and 10 healthy controls
Healthy
Acknowledgment
Patient III-7, Patient III-7, controls*
experiment 1 experiment 2 Patient III-1 (n 5 10) This work was supported by the National Institutes of Health
Bmax (sites 285 436 693 425 6 50
National Institute of Diabetes and Digestive Kidney Diseases Intra-
per platelet) mural Research Program (K.A.J. and S.P.).
KD (nM) 8.4 33.0 19.0 3.3 6 0.6

*Means 6 SD.

Authorship
group and hydrophobic interactions with adenine. PSB-0413 docking
predicted a binding mode similar to the crystallographic pose of the Contribution: A.L. performed platelet function studies, analysis of
nucleotide agonist. Therefore, the predicted involvement of His187 the data, and final approval of the manuscript; C.R. performed DNA
(5.36) also in PSB-0413 binding can explain the decreased affinity of analysis, analysis of the data, and final approval of the manuscript;
[3H]PSB-0413 for the patient’s platelets, considering that the H187Q S.P. performed molecular modeling, analysis of the data, and final
mutation can induce suboptimal H-bonding interactions with the approval of the manuscript; A.D. and L.N. performed platelet func-
ligand and attenuated stabilizing hydrophobic interactions. More- tion studies, analysis of the data, and final approval of the manuscript;
over, the conformational changes highlighted by the comparison of P.O. performed ligand binding studies, analysis of the data, and final
the agonist- and antagonist-bound P2Y12R structures, involving approval of the manuscript; C.G. performed platelet function studies,
mainly TM6 and TM7 and partially TM5, suggest that this region of ligand binding studies, analysis of the data, and final approval of
the receptor is important for the activation process. Also, mutagen- the manuscript; K.A.J. performed molecular modeling, analysis of
esis studies have shown the importance of residues located in the TM6- the data, drafting of part of the manuscript, and final approval of the
EL3 region for the functional integrity of the P2Y12R. Therefore, the p. manuscript; B.Z. performed clinical management of the patients,
His187Gln substitution could alter the interresidue interactions in this platelet function studies, analysis of the data, and final approval of
region as compared with WT, potentially interfering with conforma- the manuscript; and M.C. performed coordination and design of
tional rearrangements occurring during the activation process. the study, analysis of the data, drafting of the manuscript and final
In conclusion, His187 (5.36) is important for agonist and nucleo- approval of the manuscript.
tide antagonist (ie, PSB-0413) binding, as highlighted by crystallo- Conflict-of-interest disclosure: The authors declare no competing
graphic data and docking results, and located in a region undergoing financial interests.
conformational changes. Therefore, we have determined a struc- Correspondence: Marco Cattaneo, Unità di Medicina 3, Ospedale
tural context for the functional consequences of the p.His187Gln San Paolo – Università degli Studi di Milano, Via di Rudinı̀ 8 20142
substitution in the P2Y12R. Milano, Italy; e-mail: [email protected].

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doi:10.1182/blood-2013-07-517896 originally published
online November 26, 2014

Identification of a new dysfunctional platelet P2Y12 receptor variant

associated with bleeding diathesis
Anna Lecchi, Cristina Razzari, Silvia Paoletta, Arnaud Dupuis, Lea Nakamura, Philippe Ohlmann,
Christian Gachet, Kenneth A. Jacobson, Barbara Zieger and Marco Cattaneo

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Platelets and Thrombopoiesis (597 articles)

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Blood (print ISSN 0006-4971, online ISSN 1528-0020), is published weekly by the American Society
of Hematology, 2021 L St, NW, Suite 900, Washington DC 20036.
Copyright 2011 by The American Society of Hematology; all rights reserved.
5.4 Annexe 4

Techniques utilisées

!"#$%"&'()*+,-.)/")*+,0.

!"#!$%&'(%)*+"#,-./0#*+%#1%1#&1'2)"1es à partir de 200 3 #,!#"'+4#%*%'2#5#2-'),!#,6#7)%#QiaAmp®DNA Blood

Mini kit (Ref 51104) de Qiagen© et selon les recommandations du fabriquant.

!"#!$%&'(%)*+"#,-.80#*+%#1%1#&1'2)"1!"#5#9'&%)&#,!#100 000 (!2262!"#5#2-'),!#,6#7)% RNeasy® Micro kit (Ref

74004) de Qiagen© et selon les recommandations du fabriquant.

PCR et séquençage

Amorces d'amplification et de séqueçage

Sequence 5'-3' Taille amplicon (pb)
Forward : CTC TGC CCC CAC ACT AAC CTC T
Exon 1 491
Reverse : CCC TCC CCA CCT AGC ATC GT
Forward : CTG AGG GAG GTC TCT GAG TGA TGA A
Exon 2 501
Reverse : GGG TCT TCT GCC CAG ATT TAT CCA
Forward : GGG AAG GAG CTT GGT GGA TAA ATC
Exon 3 493
Reverse : CCC TTG TCT CCC CAC CTG GT
Forward : CAG CCC AAA CCT GAG CAG ATA G
Exon 4 502
Reverse : GGA CGG CAT CTG GCA TCG TTA
Forward : GGC GAT GAA AAC ACC CTC TTC TC
Exon 5 496
Reverse : CCT GTG CCC AGC AGG TCT TC
Forward : GCA ACC TGA GGC ATG GAC GA
VNUT Exon 6+7 594
Reverse : GGT GCA GCT CAA GCC TCG TG
Forward : GCT GTC CAG CCT GAG TAT CCT CTT
Exon 8 495
Reverse : GTG GGT CTG GAG CAC ATG GAA C
Forward : GCA CGG GAT AGC TGT CTT GA
Exon 9 274
Reverse : CTG GTC CCA GAT ATC AGG TGA CT
Forward : GCT TTC GGG CAG CTG AGT CA
Exon 10 489
Reverse : CCC AGC TGC CCG TCT TCA TG
Forward : CCC GCT TCC CCT GTG ACA AC
Exon 11+12 501
Reverse : CAG ATG GCG ACT CAT GAG CCA
Forward : CCA AGA CCC TCC AAG TCT GAG C
Exon 13 506
Reverse : TTG TGG ACT CTT CTT AAG GAG CTT
Forward : ATC AAC AGT TAT CAG GTA ACC AAC AAG AA
P2Y12 P2Y12 1093
Reverse : CAC AAA GAG ATT GAA ATA TTT CCT TAG TTA

154
Toutes les amplifications ont été réalisées avec les kits HotStarTaq® MasterMix (Ref 203445) de Qiagen©,
en appliquant le mode opératoire suivant :#;<#+4#,-./0#"*+%#=)"#!+#9&1"!+(!#,!#>?@;#3 #,!#MasterMix, de 1
3 #,-'=*&(!#"!+"#!%#'+%)"!+"#5#><#3A#(B'(6+!#,'+"#6+#C*26=!#D)+'2#,!#?;#3 @

Les amplifications par PCR ont été réalisées suivant le protocole ci-dessous pour le séquençage des exons du
gène SLC17A9 (VNUT).

1) Activation de la Taq polymérase et dénaturation : 95°C E 15 min.

2) Amplification : 35 cycles :
a. Dénaturation : 95°C E 30 sec
b. Hybridation : 60°C E 45 sec
c. Elongation : 72°C E 45 sec
3) Elongation finale : 72°C E 10 min

Les amplifications par PCR ont été réalisées suivant le protocole ci-dessous pour le séquençage du gène
P2RY12.

1) Activation de la Taq polymérase et dénaturation : 95°C E 15 min.

2) Amplification 35 cycles :
a. Dénaturation : 95°C E 30 sec
b. Hybridation : 57°C E 45 sec
c. Elongation : 72°C E 45 sec
3) Elongation finale : 72°C E 10 min

Les séquençages ont été sous-traités par la société Eurofins Genomics© (https://eurofinsgenomics.eu/).

Les alignements de séquences ont été réalisés sur le site internet http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/ en
comparant les séquences obtenues chez les patients avec les séquences de référence disponibles sur le site
www.ensembl.org

PCR avec transcription inverse (RT-PCR)

Les PCR avec transcription inverse *+%#1%1#&1'2)"1!"#5#2-'),!#,!"#'=*&(!"#"6)C'+%!"

Amorces de RT-PCR
Amorces Taille amplicon (pb)
Forward : CAG TTA TCA GGT AAC CAA CAA GAA
P2Y12 584
Reverse : AGA GTT CGG TCT AGT CTG GCA
Amorces RT
Forward : GTG CTC GCG CTA CTC TCT C
!" 150
Reverse : GTC AAC TTC AAT GTC GGA T

155
Les amplifications ont été réalisées avec des kits Qiagen®OneStep RT-PCR kit (Ref 210212), en appliquant
le mode opératoire suivant :#F<<#+4#,-.80#"*+%#=)"#!+#9&1"!+(!#,!#><#3 #,!#%'=9*+#;GH#?#3 #,!#,0IJ#K><#
=A#(B'(6+LH#F#3 #,-'=*&(!#"!+"#!%#'+%)"!+"#K><#3A#(B'(6+!L#!%#?#3 #,6#%6M!#N Enzymes » contenant à la
fois la reverse transcriptase et la polymérase. Le volume final est de 50 µL.

Les amplifications par RT-PCR ont été réalisées suivant le protocole ci-dessous pour la mise en évidence des
ARN messagers de P2Y12 !%#,!#2'#O-2-microglobuline qui sert de contrôle aux étapes ,-!$%&'(%)*+#,-.80H#,!#
%&'+"(&)9%)*+#)+C!&"!#!%#,-'=92)D)('%)*+.

1) Transcription inverse, activation de la Taq et dénaturation

a. Transcription inverse : 50°C E 30 min
b. Dénaturation et activation de la Taq : 95°C E 15 min
2) Amplification : 35 cycles
a. Dénaturation : 95°C E 30 sec
b. Hybridation : 57°C (P2Y12LH#P<QR#KO?AL#E 45 sec
c. Elongation : 72°C E 45 sec
3) Elongation terminale : 72°C E 10 min

1234/(5$6/)*+/!'7/)84#)9::47&($);&1/3<===

!# "1S6!+T'4!# ,-!$*=!# '# 1%1# &1'2)"1# 9'&# 2'# "*()1%1# U+%!4&'4!+V# "6&# un séquenceur haut débit Illumina
W)X!S?<<<@# '# &1'2)"'%)*+# ,6# "1S6!+T'4!# +1(!"")%!# %&*)"# 1%'9!"# 'C'+%# 2-'+'2Y"!# M)*-informatique : la
préparation de la M'+S6!#,-!$*+"#5#"1S6!+(!&H#2'#41+1&'%)*+#,!"#N clusters » nécessaires au séquençage et le
séquençage proprement dit.

P !"# #$%&'()*(+#(,#'-.*()*(/ #01*'$2()3456 :

-)"*2!=!+%#!%#2'#('9%6&!#,!#2-intégralité des séquences codantes de chaque génome ont été effectués en phase
2)S6),!# 5# 2-'),!# ,6# 7)%# X6&!# X!2!(%# I'&4!%# Z+&)(B=!+%# XY"%!=# KAgilent, Human All Exon Kits v2). Cette
%!(B+)S6!#9'""!#,-'M*&,#9'&#6+!#D&'4=!+%'%)*+#=1('+)S6!#,!#2-./0#K9'&#+1M62)"'%)*+#*6#"*+)('%)*+L#96)"#2)!#
à chaque extrémité des fragments générés un adaptateur qui permettra le séquençage à partir des deux
extrémités du fragment. Une séquence spécifique (dite « code barre ») est également ajoutée pour permettre
2-),!+%)D)('%)*+# ,!# (B'S6!# D&'4=!+%# '6# "!)+# ,-6+# 9**2@# [+# *M%)!+%# '2*&"# 6+!# M'+S6!# ,!# D&'4=!+%"# ,-./0#
complets@# R!%%!# M'+S6!# ,-./0# !"%# !+"6)%!# BYM&),1!# 5# 6+# 9'+!2# ,-*2)4*+6(21*%),es biotinylés spécifiques
(*6C&'+%#2-!$*=!#(*=92!%#B6=')+@# !"#BYM&),!"#M)*%inylés "*+%#!+"6)%!#('9%6&1"#5#2-'),!#,!#M)22!"#='4+1%)S6!"#
(*6C!&%!"#,-'C),)+!@

Génération des clusters :

'#M'+S6!#,-./0#')+")#"12!(%)*++1!#!"%#BYM&),1!#"6&#6+!#='%&)(!#"*2),!#,-amplification (flow-(!22L#5#2-'),!#
,!"# "1S6!+(!"# ','9%'%&)(!"# D)$1!"# "6&# (B'S6!# D&'4=!+%# ,-./0# 2*&"# ,!# 2-1%'9!# 9&1(1,!+%!@# /!"# (2*+!"#
,-'=92)D)('%)*+# K(26"%!&"L# "*+%# 41+1&1"# "6&# 2'# ='%&)(!#,!# "1S6!+T'4!# 9'&# '=92)D)('%)*+# M),)&!(%)*++!22!# ,)%!#
« pair-end ».

156
Séquençage :

Contrairement au séquençage par méthode de Sanger qui utilise des nucléotides terminateurs de chaine, la
technique Illumina 454 utilise un mélange des quatre bases nucléotidiques couplées à des fluorochromes
,)DD1&!+%"@#.)+")#9*6&#(B'S6!#(26"%!&#&!9&1"!+%'+%#6+#D&'4=!+%#,-./0H#2-'\*6%#,-6+!#M'"!#!+%&')+! 2-'99'&)%)*+#
,-6+! couleur spécifique qui permet l-),!+%)D)('%)*+#,!#2'#M'"!#)+(*&9*&1!@#.#(B'S6!#D*)"H#2-'\*6%#,-6+!#M'"!#
!"%#"6)C)#,-6+!#1%'9!#,!#,19&*%!(%)*+#S6)#9!&=!%#2'#"699&!"")*+#,6#D26*&*(B&*=!#!%#2'#9*6&"6)%!#,!#2-12*+4'%)*+#
de la chaine nucléot),)S6!@#RB'S6!#)+(*&9*&'%)*+#,!#M'"!#!"%#"6)C)!#,-6+!#9B*%*4&'9B)!#B'6%!#&1"*26%)*+#,!#2'#
« flow-cell ». Comme chaque cluster est identifié par un code barre, la succession des photographies prises de
(B'S6!#(26"%!&#9!&=!%H#!+#D*+(%)*+#,!#2-!+(B')+!=!+%#,!s couleurs obtenues, de reconstituer la séquence de
(B'S6!#D&'4=!+%#,-./0#!%#,-'%%&)M6!&#(!"#,*++1!"#5#2-1(B'+%)22*+#,-*&)4)+!@

157
Transfection de cellules 1321N1

La construction de vecteurs plasmidiques pcDNA3 portant un gène de résistance à la généticine (G418) et

ayant incorporé le cDNA du récepteur P2Y12 sauvage ou muté sous la dépendance du promoteur du CMV
(cytomégalovirus) a été sous-traitée par la société Eurofins Genomics©. La société nous a fourni, lors de la
livraison, le séquençage com92!%#,!"#(*+"%&6(%)*+"#=*+%&'+%#2-)+(*&9*&'%)*+#,!"#"1S6!+(!"#,-)+%1&]%#,'+"#2!#
C!(%!6&#92'"=),)S6!@# !"#(!2262!"#>F?>0>#+'%)C!"#*+%#1%1#9'&#2'#"6)%!#%&'+"D!(%1!"#5#2-'),!#,-6+#'4!+%#2)9*"*='2#
(Lipofectamine 2000©) selon le procotole suivant :

J-1 : Ensemencer les cellules en plaque de 24 puits à 50 000 cellules par cm² soit 100 000 cellules par puits
dans 500 3 #,!#=)2)!6#/AZA#(*+%!+'+%#><^#,!#"1&6=#,!#C!'6#D_%'2#KX`aL#!%#6+#=12'+4!#,-'+%)M)*%)S6!#
PSG (Pénicilline 500 µg/ml, Streptomycine 500 µg/ml, L-Glutamine 500 µg/ml)

J0 : Les cellules doivent être entre 70 et 90% de confluence. Avant la transfection, le milieu est remplacé par
du milieu sans antibiotique et contenant moins de sérum (DMEM+5%SVF).

1 µg de plasmide (dilué dans 50 µL de milieu OptiMEM (Gibco, Ref 31985-062)) est mélangé à 4 µL de
Lipofectamine ((Gibco, Ref 11668027) dilué dans 50 µL de milieu OptiMEM)) et incubé 30 min à température
ambiante. Les 100µL du mélange sont ajoutés goutte à goutte sur les cellules, qui sont ensuite incubées pendant
6h à 37°C sous 5% de CO2.

Après 6h, le milieu de transfection est remplacé par 500 µL du milieu DMEM +10%SVF + PSG.

J+2 : Après 48h de culture, les cellules sont transférées en plaque 6 puits en présence de 2 mL de milieu
DMEM+10%SVF+PSG+Geneticin (800µg/mL) (Gibco, Ref 10131-027).

Les cellules sont incubées à 37°C sous 5% de CO2 et le milieu est changé tous les 2 jours pendant 7 jours.
Seules les cellules transfectées survivent.

Le clonage est ensuite effectué par la technique des dilutions limites pour isoler une cellule par puits de plaque
96 puits. Les clones obtenus seront ensuite testés en RT-PCR pour vérifier la présence du transcrit P2Y12.

"4*/)*/):+,>?%)84#)%/::4:/8)@A<@.@

J-1 : ensemencer 0.2.106 cellules/puits en plaque 24 puits dans un milieu DMEM + 10% SVF.

J0 : procéder à la stimulation des cellules. Différentes conditions sont réalisées en triplet :

1) Sans forskolin K"%)=62'%!6&#,!#2-',1+Y2'%!#(Y(2'"!L
- ADP 10-4 M
- AR-C69931MX (ARC) 10-7 M, un antagoniste du recepteur P2Y12
- ARC 10-7M + ADP 10-4 M
2) Avec Forskolin 10-4 M
- FSK +ADP10-4 M
- FSK+ARC 10-7 M
- FSK+ARC 10-7 M +ADP10-4 M

Mode opératoire :
1) Laver les puits 2 fois en PBS

158
 2) Ajouter 445 µl DMEM+IBMX (3-isobutyl-1-methylxanthine) 10-4 M pour inhiber la dégradation de
2-.AJ(#!% incuber 30 min à 37°C
3) Dans chaque puit, ajouter 55 32#,!#2-'4*+)"%!#"*6B')%1#!+#,1('2'+%#2!"#96)%"#,!#?< sec. Incuber 5 min
30 sec à température ambiante.
4) Ajouter 60 32#,-'(),!#9!&(B2*&)S6!#P N (Merck Ref B403517) pour stopper la réaction en précipitant
les protéines et incuber 10 min à 4°C
5) Transvaser les cellules en tube et ajouter 1ml de mélange trichlorofluorométhane (Aldrich, Ref
254991)/trioctylamine (Fluka, Ref 92830) (v/v) puis vortexer 2 min. Cette étape permet la
+!6%&'2)"'%)*+#,6#=)2)!6#!%#2-!$%&'(%)*+#,!#2-AMPc dans la phase aqueuse.
6) Après avoir centrifugé 5 min à 13000g à +4°C, récupérer la phase aqueuse et congeler à -20°C
\6"S6-'6#,*"'4!#,!#2-.AJ(@

J*6&#2!"#(*+,)%)*+"#.8R#b#./JH#2-./J#!"%#'\*6%1#F<#"!(#'9&c"#2-.8RH#!%#2'#&1'(%)*+#!"%#"%*991!#; min après

2-./J#"*)%#; min 30 sec de réaction totale.

!#,*"'4!#,!#2-.AJ( "-!DD!(%6!#!+#&',)*-)==6+*2*4)!#5#2-'),!#,6#7)%#8U., cAMP [125I] RIA KIT (Ref RK-

500, Institute of izotopes CO.LTD) selon les recommandations du fabriquant.

Extraction et dosage des nucléotides plaquettaires

Le dosage des nucléotides plaquettaires peut être réalisé sur une suspension de plaquettes lavées sans apyrase
ou sur un PRPc.

1) Extraction

450 µL de PRPc ou de suspension de plaquettes lavées sans apyrase sont lysées en présence ,-'(),!#
perchlorique 6 N. Après quelques secondes de vortex et une incubation de 10 min à 4°C, centrifuger 5 min à
13 000 g à 4°C. L!#"6&+'4!'+%#!"%#&1(691&1#96)"#+!6%&'2)"1#5#2-'),!#,-1 mL de mélange trichlorofluorométhane
/ trioctylamine (v/v). Vortexer 2 min puis centrifuger 5 min à 13 000 g à 4°C. Prélever la phase aqueuse et
(*+4!2!&#\6"S6-'6#,*"'4!#!+#WJ R.

2) Dosage

Le dosage des nucléotides se fait en chromatographie liquide haute performance sur colonne échangeuse
,-'+)*+#KRef ZORBAXSAX-250/046 Agilent Technologies) couplée à un détecteur UV-2075 Plus visible.

Préparer 200 µL de chaque échantillon à doser ainsi que de trois solutions étalons contenant respectivement
5.10-4 M des nucléotides suivants : AMP, ADP et ATP. Préparer également un mélange v/v/v des solutions
,-.AJH#,-./J#!%#,-.IJ.

!#,*"'4!#WJ R#"-!DD!(%6!#9*6&#%*6"#2!"#1(B'+%)22*+"#!%#1%'2*+"#"6)C'+%#6+#4&',)!+%#2)+1')&!#,!#%'=9*+#.#K!'6#
distillée) / tampon B (tampon phosphate 1M 9WF@dL@# -)+\!(%)*+#,!#><< 3 #,-1(B'+%)22*+#"!#D')%#'C!(#><<^#,!#
tampon A@# !#4&',)!+%#9!&=!%#,-*M%!+)&#6+!#9B'"!#=*M)2!#(*+%!+'+%#><<^#de tampon B au bout de 30 min.

159
Après le passage de la solution de mélange de nucléotides, on obtient un électrophorégramme permettant
,-),!+%)D)!&# les trois nucléotides grâce à leurs %!=9"# ,!# &1%!+%)*+@# -')&!# "*6"# 2'# (*6&M!# ,!# (B'S6!# 9)(# !"%#
proportionnelle à la quantité de nucléotides injectés.

Western blot VNUT

1) Obtention des lysats plaquettaires

1 mL de suspension de plaquettes lavées à 300 000 plt/µL est centrifugé 5 min à 1200 g. Le culot est repris
dans 950 3 #,-6+!#"*26%)*+#.#KI8UX#<@<;AH#42Y(!&*2#?^H#0ZA ?=A#!%#6+#=12'+4!#,-)+B)M)%!6&"#de protéases
(Complete, Roche©)). Après avoir remis en suspension le culot, celui-ci est ultracentrifugé à 100 000 g
pendant 1h à 4°C. Reprendre le culot dans 100 µL de solution A contenant 1% de SDS (sodium dodecyl
sulfate). Le SDS permet la rupture des liaisons covalentes et la dénaturation des protéines. Faire bouillir
pendant 5 min puis congeler.

2) Dosage des protéines

Le dosage des protéines a été effectué par technique classique dite BCA (e)R)+(B*+)+)(#'(),#.""'YL#5#2-'),!#
du kit (Pierce® BCA Protein Assay kit, ThermoScientific) selon les recommandations du fabriquant.

3) Migration et transfert :

10 µg de protéines issues de chaque échantillon sont déposées en présence de 10 mM de DTT (un agent
&1,6(%!6&# ,!"# 9*+%"# ,)"62D6&!L# ,'+"# 2!"# 96)%"# ,-6+# 4!2# ,-'(&Y2'=),!# KGel Critérion BioRad 4-15%©). La
=)4&'%)*+#"-!DD!(%6!##"*6"#6+#(B'=9#12!(%&)S6!#,!#?<< V pendant 30 min. Les protéines sont transférées sur
6+!#=!=M&'+!#J`/a#Ke)*&',VL#5#2-'),!#,6#"Ystème Trans-blot turbo (Biorad©).

4) Immunomarquage :

Afin de limiter le marquage non spécifique, la membrane est incubée en présence de blocage commercial
(blocking buffer, Thermofischer ©) pendant 1h. Après un lavage en PBS/tween 0.05%, la membrane est
)+(6M1!#9!+,'+%#6+!#B!6&!#"*6"#'4)%'%)*+#,*6(!#'C!(#6+!#"*26%)*+#,-'+%)(*&9"#K'+%)-VNUT, anti-GAPDH ou
IgG) à 1µg/mL dans un tampon PBS/Tween 0.05% / 0.1% serum albumine bovin (BSA)/NaN3 0,02%. Après
trois lavages en PBS/tween 0.05%, la membrane est incubée pendant 1h sous agitation douce en présence de
2-'+%)(*&9"#"!(*+,')&!#f.8-HRP à 50ng/mL en PBS/Tween 0.05%/BSA 0.1%.

5) Révélation :

Après 3 lavages en PBS/Tween 0.05% et un 2'C'4!#!+#JeXH#2'#&1C12'%)*+#"-!DD!(%6!#'C!(#2!#&1'ctif « Pierce

ECL de Thermo Fischer Scientific© » suivant les recommandations du fabriquant. Les photographies sont
9&)"!"#5#2-'),!#,-6+#,1%!(%!6&#g`#f!2/*(#G8#Ke)*&',V) avec une exposition de 3 min.

160
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 Arnaud DUPUIS

DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE, CARACTERISATION

MOLECULAIRE ET IDENTIFICATION DE
NOUVEAUX GENES IMPLIQUES DANS DES
THROMBOPATHIES CONGENITALES NON
ETIQUETEES

Résumé
Les thrombopathies congénitales sont des pathologies au phénotype hémorragique hétérogène
dues à des anomalies fonctionnelles des plaquettes sanguines parfois associées à des
anomalies morphologiques et/ou à une thrombopénie. Les outils diagnostic disponibles
permettent de corréler une anomalie fonctionnelle plaquettaire à un déficit protéique voire à une
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UMR S949 travaillent de concert à @)$(,&"$1$0#"$%&',"'I'@#'0#<#0"/<$-#"$%&'(,'0,-'.#";%@%*$,-3'D$&-$5'
nous avons mis en évidence trois nouvelles mutations du récepteur P2Y 12 dans trois familles
différentes. La mutation p.His187Gln a été entièrement caractérisée sur des plaquettes fraiches
du patient et dans un modèle cellulaire adapté. La reproduction des deux autres mutations
(p.Tyr259Cys et p.Phe95Ser) est en cours. Nous avons par ailleurs identifié une famille dont trois
, =<,-'-%&"'#"",$&"-'()!&,' #@#($,'(!'.%%@'J$(,'&%&'-K&(<% $2!,'," nous suspectons grâce
#!'-/2!,&L#*,'(),?% ,',11,0"!/'2!,'@,'"<#&-.%<",!<'(,'&!0@/%"$(,-'MFNO',-"'$ .@$2!/'(#&-'@#'
pathologie.

Mots clés : thrombopathies congénitales, maladie du pool vide, récepteur P2Y12

Summary
Inherited platelets disorders (IPD) are pathologies associated with heterogeneous bleeding

phenotypes. They are due to functional platelets deficiency that may come with morphological
abnormalities and/or thrombocytopenia. Available diagnosis tools are used to link a functional
deficiency to a protein defect and in some instances to a specific genetic mutation. However, in
2015 at least 50% of IPD are still not identified. In this context, the haemostasis laboratory of the
EFS Alsace together with INSERM UMR S949 team are working to diagnose and characterize
these pathologies. Thus, we found three new P2Y12 receptor variants in three different families.
The mutation p.His187Gln has been fully characterized on blood fresh platelets coming from one
patient and in an appropriate cellular model. The reproduction of the two other mutations
(p.Tyr259Cys and p.Phe95Ser) is currently ongoing. We also studied a family in which three
members are carrying a delta storage pool disease. The full exome sequencing analysis leads
us to suspect the involvement of the nucleotides transporter VNUT in this pathology.

Key words : $&;,<$",('.@#",@,"'($-%<(,<-5'P-storage pool disease, P2Y12 receptor