PROVOST

 &  WALLERT  RESEARCH   His Tag Purification

Investigating  the  Biochemistry  &  

Cellular  Physiology  of  NHE1   Purification Protocol

EST.  1998    

Theory  and  Introduction:  Ni-­‐Affinity  Chromatography  uses  the  ability  of  His  to  bind  nickel.  Six  histadine  amino  acids  at  the  end  of  a  protein  
(either  N  or  C  terminus)  is  known  as  a  6X  His  tag.  Nickel  is  bound  to  an  agarose  bead  by  chelation  using  nitroloacetic  acid  (NTA)  beads.  Several  
companies  produce  these  beads  as  His  Tagged  proteins  are  some  of  the  most  used  affinity  tags  in  today’s  market.  See  handouts  to  Qiagen  and  
Pharmacia,  two  commercial  sources  of  NTA-­‐Agarose  resins.  The  general  method  is  to  batch  absorb  the  protein  onto  the  column,  by  mixing  the  
beads  with  the  sample,  then  pouring  the  slurry  of  NTA  beads  and  protein  into  a  column,  where  low  concentrations  of  phosphate  and  imidazole  
are  used  to  remove  low  affinity  bound  proteins.  If  needed,  the  imdazole  can  be  increased  to  20  mM  before  most  His  tagged  proteins  are  eluted.  
Finally,  higher  concentrations  of  imidazole  is  used  to  elute  the  protein  from  the  NTA-­‐beads.    

Important  Points  to  Consider  For  Ni-­‐Affinity  Chromatography    

• Preparation  of  resin  –  The  NTA-­‐Agarose  beads  are  very  expensive  and  need  to  be  saved  and  recycled.  As  long  as  the  beads  have  a  light  blue  
tint  to  them,  there  is  still  nickel  bound  to  the  beads.  The  blue  is  due  to  the  metal  (think  of  the  general  chemistry  lab  where  you  precipitated  
nickel).    
• Average  binding  capacity  is  about  5-­‐10  mg  of  His  tagged  protein  per  ml  of  beads.    Depending  on  many  factors  protein  expression  can  range  
from  0.5  -­‐  20  mg  of  His  tagged  protein  per  liter  of  medium.      
• Column  and  Sample  Preparation  –  For  this  purification  you  should  use  the  plastic  column.  No  pump  is  necessary;  simply  allow  gravity  to  draw  
the  buffer  and  sample  through  the  column.    
• Buffer  selection  –  The  protocol  below  is  very  specific  for  buffer  selection.  
• Increasing  the  pH  of  the  equilibration  buffer  from  7  to  8  will  increase  the  binding  of  your  protein  to  the  NTA  beads,  but  will  also  increase  non-­‐
specific  binding  of  other  proteins.  Start  using  a  pH  7.0  buffer  unless  you  are  having  a  difficult  time  getting  the  protein  to  bind  to  the  beads.    
Lowering  pH  to  6.8  or  adding  10-­‐50  mM  imidazole  can  reduce  binding  of  endogenous  proteins  but  reduce  binding  capacity  
• Adding  imidazole  to  your  buffer,  will  change  the  pH  of  the  solution.  Double  check  the  pH  of  the  solution  after  adding  imidazole.  
• If  there  is  a  high  level  of  contaminant,  the  imidazole  in  the  equilibration  buffer  can  be  increased  to  50  –  75  mM.  
• Imidazole  has  a  higher  affinity  for  the  metal  than  does  histadine.  Look  at  the  structure  of  histadine  and  imidazole...  they  are  basically  the  
same  functional  group.  
• Fee  imidazole  has  been  known  to  denature  protein  when  freezing  and  thawing.  Therefore,  it  is  important  to  continue  to  the  next  
chromatography  before  freezing  sample.  
• If  you  are  using  this  chromatography  in  the  first  step  of  a  purification,  you  should  dialyze  the  sample  against  a  buffer  without  imidazole  
before  freezing  (1X  PBS  is  a  good  choice).    
• Elution  –  You  can  experiment  with  the  concentration  of  imidazole  and  salt  to  achieve  an  optimal  purification.    
• Regeneration  –  Return  the  resin  to  the  container  in  the  hood.  The  beads  can  be  regenerated  with  10  column  volumes  of  the  following:  1)  
MES  Buffer  wash  at  pH  5.0,  2)  wash  with  water,  3)  20%  EtOH.  Store  the  beads  in  20%  EtOH.  

Cell  lysate  Preparation:    The  key  to  preparing  a  lysate  (broken  cells)  is  to  perform  this  as  quickly  as  possible  while  keeping  the  preparation  at  low  
temperature  to  minimize  protease  degradation  and  protein  denaturation.    A  good  cell  lysate  will  be  clear  (no  particulate  and  yellow/tan  in  color)  
and  not  viscous.    Viscosity  is  due  to  genomic  DNA  and  will  cause  many  problems  during  chromatography.    Pre-­‐Chill  buffers,  centrifuge  heads  and  
other  equipment.    Keep  your  solutions  and  cell  pellets  IN  the  ice  not  ON  the  ice.    For  proteins  that  aggregate  or  membrane  proteins,  additional  
additives  include  a  final  concentration  of  10%  glycerol  (aggregation)  0.1%  Triton  X-­‐100  (aggregation  and  membrane  proteins).      
 
Lysis  Instructions:  Follow  lysis  protocol  for  instructions.    Freeze/thaw  cycles  of  lysate  will  result  in  precipitation  proteins.  
 
Column  Basics  
• 1  liter  culture  will  need  25  ml  of  beads  
• In  general,  scale  the  washes  and  elution  using  the  information  below.    A  rule  of  thumb  is  to  wash  with  10-­‐20  column  
volumes  (volume  of  packed  beads)  for  the  wash  buffer.    Elute  in  a  total  of  5-­‐10  column  volumes  of  elution  buffer.    Divide  
the  elution  into  6-­‐8  total  fractions.    High  expressing  proteins  may  need  more  elution  buffer.  
 
Important  Note:    A  quick  check  of  wash  and  elution  fractions  with  a  bradford  assay  (20  ul  sample  mixed  with  ~1  ml  of  1X  
bradford)  will  inform  you  the  relative  amount  of  protein  in  the  fraction.  
  
 
Purification  Instructions  (per  1000  ml  culture  adjust  to  the  appropriate  volumes  as  per  information  above):  
• Preparation  of  Ni-­‐Agarose  Beads/Resin:        
o Prepare  25  ml  of  beads  by  transferring  50  ml  of  a  50%  slurry  of  beads  equilibrate  into  a  clean  column.    Wash  and  equilibrate  
the  column  by  running  200  ml  of  His  Elution  Buffer  followed  by  500  ml  of  His  Binding  Buffer  through  the  column.    This  
SHOULD  be  done  ahead  of  time!    Store  prepared  beads  with  a  few  ml  of  His  Binding  buffer  at  RT.  
• Purification:      
o Save  100  ul  of  lysate.    Add  clarified  lysate  (if  frozen,  check  for  ppt  material.    If  there  is  any  clumpy  or  ppt  material  or  if  the  
lysate  is  cloudy,  centrifuge  and  keep  the  supernatant)  to  the  washed  beads.      
o Batch  Binding  -­‐  if  protein  expression  is  low  or  the  His-­‐tagged  protein  binds  with  low  affinity  then  use  a  batch  purification  
method.      
§ Combine  the  washed  beads  and  lysate  onto  a  drained  and  capped  column  or  a  50  ml  falcon  tube  for  smaller  
volumes.    Use  a  spatula  and/or  a  transfer  pipette  to  suspend  the  beads.  Tightly  cover  with  parafilm  and  incubate  
rocker  for  30  min  at  room  temp.      
§ Replace  the  column  on  the  stand  and  allow  most  of  the  beads  settle  then  open  column.  Add  frit  back  to  column.    
Reapply  the  flow  thru.    This  is  the  non-­‐binding  protein.  Continue  with  purification  
o Column  Binding  -­‐  Flow  the  clarified  lysate  through  the  column.    Save  the  eluate  as  flow-­‐through  in  one  fraction.    If  there  is  
a  concern  with  binding  efficiency  the  flow-­‐through  can  be  reapplied.    Continue  with  the  purification.  
 
After  binding  
§ Wash  beads  ~  250  ml  of  Ni-­‐Column  His  Binding  Buffer.    Save  as  flow  through  wash  in  one  fraction.  
§ Wash  the  column  with  ~500  ml  of  His  Wash  Buffer.    *This  will  remove  some  of  the  weakly  binding  protein.    (check  
flow  through  for  protein  with  quick  bradford).  Continue  with  the  His  wash  buffer  until  no  detectible  protein  is  found  
in  eluate.  
§ Elute  the  protein  with  20  x  15  ml  of  His  Elution  Buffer.  Save  ALL  fractions.    Check  for  eluted  protein  with  quick  
bradford.  
§ Check  each  fraction  for  total  protein  and  determine  purity  by  SDS-­‐PAGE  –  coomasie  stain    
 
Quick  Bradford.    ~1  ml  of  1X  bradford  plus  ~20  ul  or  one  drop  of  eluate  or  sample.    If  the  dye  turns  blue-­‐ish  there  is  protein  present  
 
His-­‐Binding  Buffer:   His-­‐Wash  Buffer:   His-­‐Elution  Buffer:  
• 50  mM  Tris-­‐Cl  (pH8.0)   • 50  mM  Tris-­‐Cl  (pH8.0)   • 50  mM  Tris-­‐Cl  (pH8.0)  
• 5  mM  Imidazole   • 300  mM  NaCl   • 50  mM  NaCl  
• 100  mM  NaCl   • 10-­‐20  mM  Imidazole   • 300  mM  Imidazole  
• 0.1  mM  EDTA   • 0.1  mM  EDTA   • 0.1  mM  EDTA  
• *  include  1  mM  PMSF  made  fresh   • include  1  mM  PMSF  made  fresh   • include  1  mM  PMSF  made  fresh