如何提高数字PCR（dPCR）的识别率

要提高数字PCR（dPCR）的识别率（即对目标核酸的检测灵敏度与准确性），需从实验设计、试剂优化、样本处理、仪器参数及数据分析等多环节系统优化。以下是具体策略，结合最新研究与实践经验总结：

​一、引物与探针设计：提升特异性的核心​

引物与探针的特异性直接影响dPCR的“假阳性”与“漏检”率，需严格遵循以下原则：

1. ​引物设计​：
   • ​长度与GC含量​：引物长度18-25 bp，GC含量40%-60%，避免连续相同碱基（如GGGG）或自身互补（防止二聚体）。
   • ​Tm值匹配​：上下游引物Tm值应接近（相差≤3℃），且高于探针Tm值8-10℃（确保引物先结合，探针后延伸）。
   • ​特异性验证​：通过NCBI BLAST比对，确保引物与目标序列高度匹配（相似度≥90%），避免与非靶标序列交叉反应。
2. ​探针设计​：
   • ​长度与标记​：探针长度20-30 bp，5'端标记荧光报告基团（如FAM、VIC），3'端标记淬灭基团（如BlackHole、DarkQuencher）。
   • ​避免干扰​：探针序列5'端前3个碱基避免为G（防止淬灭荧光），且与引物无重叠。
   • ​多重检测兼容​：若进行多重dPCR，需确保不同探针的荧光通道无串扰（如QIAcuity 5plex的Green/FAM、Yellow/HEX等通道独立）。

​二、反应体系优化：提高扩增效率的关键​

反应体系的成分与浓度直接影响靶标扩增效率，需针对性调整：

1. ​引物与探针浓度</