非因RPPA转化医学研究成果 | FFPE样本在肿瘤个体化诊疗中的应用研究

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研究背景

在大队列样本中精确定量磷酸化蛋白在生物标志物鉴定和验证方面有巨大潜力，但实体瘤细胞信号网络中磷酸化蛋白的系统定量仍具挑战性。反相蛋白微阵列（RPPA） 是一种强大的高通量蛋白组学技术，特别适用于从大规模样本中进行蛋白质定量组学分析，尤其适用于翻译后修饰（PTM）以阐明潜在的致癌机制。并且可以联合其他组学数据进行多组学分析。

尽管RPPA在应用方面做出了贡献，但仍存在一些技术瓶颈。验证RPPA适用抗体是准确定量的先决条件，但这些都使得验证过程复杂化。因此迫切需要更好的磷酸化抗体表征策略。基于此，非因生物联合北京大学肿瘤医院、纽卡斯尔大学、山东大学齐鲁医院在期刊《Scientific Reports》（IF：4.996）中发表名为“A reverse phase protein array based phospho‑antibody characterization approach and its applicability for clinical derived tissue specimens”的文章。利用与传统RPPA抗体验证程序不同的碱性磷酸酶（AP）处理兼容的裂解缓冲液，开发了一种基于反相蛋白微阵列（RPPA）的磷酸化抗体表征方法，并将其应用于新鲜冷冻组织（FF）和福尔马林固定石蜡包埋组织（FFPE）以测试其适用性。

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研究目的

非因研发团队计划开发一种基于反相蛋白微阵列（RPPA）的磷酸化抗体验证的工作流程，并验证其在FF和FFPE样本的适用性，进而增强RPPA在转化医学研究的应用潜力。

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实验设计

非因研发团队通过RPPA筛选106种磷酸化抗体，并证明AP处理可作为快速磷酸化抗体选择的独立因素。随后在临床标本中验证该工作程序的重复性和特异性，表明其在基于组织的磷酸蛋白分析方面的潜力，具有进一步的临床意义。使用相同的方法，基于黑色素瘤和肺癌FFPE样本，显示出出色的实验间可重复性和与两种组织中病理标志物的显著相关性，从而产生与临床特征相匹配的有意义的数据。研究结果为磷酸化抗体表征的高效工作流程设定了基准，该工作流程与精密肿瘤学中的高难度临床蛋白质组学兼容。

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研究结果及讨论

1.在细胞系中使用碱性磷酸酶处理进行磷酸化抗体分析

为了验证碱性磷酸酶（AP）处理蛋白的方法适用于高通量磷酸化抗体筛选，非因研发团队开发了一种新型的裂解缓冲液（AGLyse），在保持AP活性的同时可以高效裂解细胞。非因研发团队从抗体库中选择了113 种抗体（106 种抗磷酸化抗体和 7 种蛋白质特异性抗体，但不是磷酸化特异性抗体），并在 RPPA 打印之前对 8 种用 AP 处理或未处理的细胞裂解物进行了探测。结果与预期一致，从细胞裂解物的蛋白质中去除磷酸盐导致抗磷酸化抗体的结合减少，这反映在两组之间观察到的信号有明确分离（图1a）。113种抗体的logFC排名也显示出总抗体在一个方向上的富集模式（图1b，c）。

为了进一步探索AP处理是否可以作为独立的预测因素来评估磷酸化抗体，非因研发团队使用抗体评分来确定 113 种抗体对RPPA的适用性，临界值为8，结果显示67种抗体为“好”，46种抗体为“坏”。为了独立于RPPA验证基于这些抗体结果的真实性，非因研发团队选择了logFC≤-0.792的42种抗体，并在一组细胞系中进行WB验证，结果发现42种抗体中有36种（85%）在预期大小下显示出单条带，证实了该方法适用于高通量磷酸化抗体筛选。

图1

2. FFPE和FF组织标本中的蛋白质提取优化

为了验证基于AGLyse的蛋白质提取方法适用于FFPE和FF组织标本且AP处理可用于FF组织的可行性，非因研发团队通过不同处理方法对FFPE和FF样本展开探索。

为了探索FFPE样本最优的裂解方法，非因研发团队选取了5种不同的裂解方法对乳腺 FFPE 样本进行蛋白提取，使用一组14种预先验证的抗体（11种抗磷酸化抗体和3种总蛋白抗体）来比较不同的提取方法。结果显示使用五种不同提取方法制备的样品产生的RPPA信号之间的相关性各不相同，但对于所有测试靶标都在可接受范围内（图2a）。方法1~4的相关系数R2> 0.9 和 p < 0.01（图2b）。有趣的是，方法4与其他三种方法的相关性高于方法5。

图2

为了进一步探究FF样品的最佳提取方法，非因研发团队将表征良好的CLB1裂解缓冲液与方法5进行比较：使用相同的抗体比较FF组织样品的提取方法5-8，结果发现方法5对于FF组织样品裂解物读数的相关性非常高（R2≥ 0.93，p < 0.01，图 3b），所以非因研发团队继续使用已建立的方法5（不含磷酸酶抑制剂的AGLyse）在三个平行的乳腺组织选择中应用AP治疗，每个组织有3个独立的重复。使用AGLyse缓冲液（不含磷酸酶抑制剂），观察到所有使用的抗体信号降低。其中，pP38（Thr180/Tyr182）、pHER2 （Tyr1221/Tyr122） 、 pGSK3β （Ser9） 和 pERK1/2 （Tyr204）显示信号明显降低，而阴性对照（针对Akt，GSK-3β和α-微管蛋白的总抗体）响应AP处理的信号强度降低要小得多（图3c）。

图3

为了进一步验证AP处理的稳定性，非因研发团队选取两个独立乳腺组织来源的其他FF样品扩展分析，每个样品使用在先前细胞系筛选中验证的36种荧光抗体进行两次平行提取重复。观察到响应AP处理的磷酸化信号普遍降低（图4a），并且两个组织之间的整体磷酸化丰度非常相似（图4b）。实验重复之间显示高表达一致性（图4c）（R2>0.9和p<0.001）。

图4

3. 黑色素瘤FFPE样品中RPPA性能的评估

为了验证RPPA磷酸化抗体表征方法的稳定性，非因研发团队选取了63名黑色素瘤患者的三张连续FFPE切片样本进行蛋白质提取，然后用RPPA和WB同时分析，结果发现RPPA与蛋白质印迹之间的总体表达相关性均保持在相似水平（R2= 0.44–0.53，p < 0.05）（图5a）。为了弥补WB在实验间定量中重现性的不足，非因研发团队对RPPA数据根据信号强度进行绘制，结果发现三分之二的提取重复在低组和高组之间的表达有显著差异，进一步表明这两种方法之间的一致性（图5b；进一步探索另外4种经过RPPA验证的抗体（GAPDH，LAG3，PD-L1和S100），并对观察到强相关性的所有测试靶标进行了实验间比较（图 5c）。

图5

4. 用RPPA探测肺癌FFPE组织

为了再次验证RPPA磷酸化抗体表征方法应用于FFPE衍生组织标本的技术稳定性和兼容性，非因研发团队使用三种肺癌亚型与正常肺组织样本进行测试，包括非小细胞肺癌（NSCLC）患者20例，其中腺癌（ADC）10例，鳞状细胞癌（SCC）10例，小细胞肺癌（SCLC）患者10例，并且纳入10个相邻的非癌性肺上皮样本，总共采集了 120 张 FFPE 切片。无监督聚类分析和PCA分析结果表明非癌性组织提取物与癌组织提取物显著分离以及三种肺癌亚型彼此之间的部分分离（图6a，b）。当组织样本组根据其临床亚型进行分组时，可以更清楚地理解这一点（图6c）。SCLS提取物显示出TTF1的表达水平高于其他提取物，这也在IHC中得到证实（图6d）。值得注意的是，所有其他标志物在正常肺组织中的基线表达，ADC的轻微上调和SCC的进一步升高以及SCLC中最高的表达，表明与疾病侵袭性相关的潜在表达特征（图6e）。对于EGFR和p40，由于两种抗体株分别可用于RPPA，因此对两者进行了相互测试并显示出最佳一致性，再次确认了FFPE用于衍生组织标本的技术稳定性和兼容性。

图6

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研究结论

非因研发团队利用与传统RPPA抗体验证程序不同的碱性磷酸酶（AP）处理兼容的裂解缓冲液，开发了一种基于反相蛋白阵列（RPPA）的磷酸化抗体表征方法适用于新鲜冷冻（FF）和福尔马林固定石蜡包埋组织（FFPE），可以作为快速磷酸化抗体选择的独立因素，具有进一步的临床意义，且在基于组织的磷酸蛋白分析方面有很大潜力。非因生物目前在RPPA技术上已储备多项发明专利，并会在RPPA转化医学研究领域持续深耕。