一文读懂启动子/增强子/沉默子的活性检测

在人体约30万亿个细胞中，每个细胞都携带着相同的DNA“说明书”，但为什么有的细胞变成皮肤细胞，有的却成为神经细胞？答案就藏在基因表达的精密调控中。在这场生命活动的“分子交响乐”里，启动子、增强子和沉默子如同三位指挥家，通过复杂的协作决定哪些基因该“奏响”、哪些该“沉默”。从受精卵到完整生命体，从健康细胞到疾病状态，启动子、增强子和沉默子构成的调控网络始终在演绎着精妙的分子芭蕾。

图1 基因转录调控元件（Maston et al., 2006）。

启动子/增强子/沉默子元件

01 启动子

启动子通常位于基因的起始位置（上游区域），包含多个功能模块：①核心启动子：含有“TATA框”（如TATAAA序列），是RNA聚合酶精准结合的“停泊位点”；②近端调控区：包含CAAT框、GC框等元件，帮助招募转录辅助因子。人类基因组中，约70%的基因启动子位于富含“CpG岛”的区域（即胞嘧啶和鸟嘌呤密集的DNA片段），这种结构特征使得启动子更容易被调控蛋白识别。当RNA聚合酶结合启动子时，会像钥匙插入锁孔般引发DNA双链局部解旋，启动转录。但这个过程并非自发——它需要转录因子的帮助。例如：通用转录因子TFIID能识别TATA框，像“定位桩”一样引导聚合酶就位。

图2 启动子元件结构特征（Andersson et al., 2020）。

02 增强子

增强子（Enhancer）是远距离提升基因转录活性的DNA调控元件，增强子距离启动子较远，其中某些增强子距离核心启动子多达1兆碱基（1 Mb）。增强子可位于基因上游、下游甚至内含子中，无论正反方向排列均能发挥作用。增强子通过“DNA环化”与启动子物理接触，当调控蛋白（如Mediator复合物）结合增强子时，会牵拉DNA形成环状结构，将增强子直接递送到启动子附近。这种空间重构能：募集组蛋白乙酰化酶，松解染色质结构；聚集转录机器组件，形成“转录工厂”。

图3 增强子介导转录激活原理（Panigrahi and O'Malley., 2021）。

03 沉默子

沉默子元件（Silencer）是通过重塑染色质结构或阻断增强子-启动子接触等方式，负向调控基因表达的非编码DNA序列。沉默子的作用机制可分为三类：

①沉默子被抑制性转录因子（repressive transcription factors）结合，这些转录因子可以介导沉默子与启动子之间的特异性短程或长程相互作用，导致目标基因的转录抑制；

②沉默子通过阻止增强子与目标基因启动子的相互作用来抑制基因表达。这种机制使得沉默子能够在特定细胞类型或组织中抑制基因表达；

③沉默子被抑制性转录因子结合，进而招募组蛋白去乙酰化酶（例如NuRD）、甲基转移酶（如组蛋白甲基转移酶SETDB1和DNA胞嘧啶5甲基转移酶）以及异染色质蛋白1等，这些因子的共同作用导致染色质可及性降低，从而实现基因转录的沉默。

图4 沉默子抑制转录活性原理图（Pang et al., 2023）。

启动子/增强子/沉默子元件的活性检测

双荧光素酶报告基因实验是一种用于研究基因表达调控的高灵敏度检测技术。该实验系统通常包含两种荧光素酶：萤火虫荧光素酶（报告基因）和海肾荧光素酶（内参基因）。实验流程包括：将目标基因的启动子或调控序列插入含萤火虫荧光素酶的报告载体，与海肾荧光素酶载体共转染至细胞中；通过裂解细胞并分别加入底物（萤火虫底物D-luciferin和海肾底物Coelenterazine），检测两者的发光值。海肾荧光素酶作为内参，用于校正转染效率和细胞活性差异，提升数据可靠性。该技术广泛应用于启动子或其它调控元件活性分析，具有高灵敏度和低背景干扰的优势。我们以双荧光素酶报告基因实验来检测启动子/增强子/沉默子元件的活性。

01 启动子活性分析

目前可用于启动子活性分析的双荧光素酶报告基因载体有很多，例如pGL3-Basic,pGL4.10等，此类载体在萤火虫荧光素酶报告基因上游缺乏一个启动子，将需要验证的启动子序列插入到萤火虫荧光素酶报告基因上游，以空载载体作阴性对照。选择内参载体时，通常建议优先选择TK启动子驱动的载体（如pRL-TK或pGL4.74），因为其表达活性较低，不会显著干扰主报告基因（如pGL3-Basic、pGL4.10载体中的萤火虫荧光素酶）的表达。Rae-Whitcombe等人将pADPN启动子插入到pGL4.10载体上来分析葡萄糖对pADPN启动子活性的影响，其中pGL4.10代表空载（阴性对照）。在三种细胞CHO,CHO-IR，HepG2加入葡萄糖后，启动子活性出现显著增加。

图5 启动子元件结构特征（Andersson et al., 2020）。

02 增强子活性分析

单独的增强子元件不具备启动基因表达的功能，需要与启动子共同作用来提升启动子活性，从而促进基因的表达。因此检测增强子活性需要特殊的双荧光素酶报告基因载体，例如pGL3-Promoter，pGL4.23等。pGL3-Promoter的萤火虫荧光素酶报告基因上游带有一个SV40启动子，在SV40的上游有一个多克隆位点（MCS），可以用来插入待验证的增强子序列。阴性对照可以为pGL3-Basic(不带启动子),pGL3-Promoter空载（带有SV40启动子）。

图6 pGL3-Promoter载体图谱

增强子序列可以位于基因的上下游，以及内含子区域。Lum等人为了验证HMGB1基因是否受到第一个内含子的155到2061bp区域的调控，将这段区域进行不同的截短片段并插入到pGL3-Promoter载体。发现不同Intron 1的片段都能促进萤火虫荧光素酶报告基因表达，说明Intron 1的155到2061bp区域具有增强子元件功能。

图7 HMGB1基因的Intron 1增强子活性验证（Lum et al., 2001）。

03 沉默子活性验证

沉默子活性检测和增强子活性检测方法类似，单独沉默子并不能够调控基因的表达。检测沉默子活性时候，需要在萤火虫荧光素酶报告基因上游带有一个启动子。用来检测沉默子活性的双荧光素酶报告基因载体可以是pGL3-Promoter，pGL4.53等，其中pGL4.53载体带有PGK启动子，可将沉默子序列插入到PGK启动子上游，然后以空载pGL4.53（无沉默子序列，仅带有PGK启动子）作为阴性对照。

图8 pGL4.53质粒图谱

相同沉默子在不同细胞往往发挥着不一样的功能。Zhu等人通过Ss-STARR-seq测序结果选取了15个沉默子，将这些沉默子序列插入荧光素酶报告基因载体pGL4.53中，用空载体（无插入序列）作为对照，转染到小鼠胚胎干细胞（mESCs）和小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs），然后检测萤火虫荧光素酶活性。实验结果显示，这些序列在两种细胞类型中展现出不同的基因调控功能，有些沉默子在mESCs中表现为抑制基因表达，而在MEFs中则不具备沉默子的功能。

图9 不同沉默子序列在mESCs和MEFs中的活性检测（Zhu et al., 2025）。

参考文献

[1]Andersson R, Sandelin A. Determinants of enhancer and promoter activities of regulatory elements[J]. Nature Reviews Genetics, 2020, 21(2): 71-87.

[2]Lum H K, Lee K L D. The human HMGB1 promoter is modulated by a silencer and an enhancer-containing intron[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Structure and Expression, 2001, 1520(1): 79-84.

[3]Maston G A, Evans S K, Green M R. Transcriptional regulatory elements in the human genome[J]. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet., 2006, 7(1): 29-59.

[4]Panigrahi A, O'Malley BW. Mechanisms of enhancer action: the known and the unknown. Genome Biol. 2021 Apr 15;22(1):108. doi: 10.1186/s13059-021-02322-1. PMID: 33858480; PMCID: PMC8051032.

[5]Pang B, van Weerd J H, Hamoen F L, et al. Identification of non-coding silencer elements and their regulation of gene expression[J]. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2023, 24(6): 383-395.

[6]Rae-Whitcombe S M, Kennedy D, Voyles M, et al. Regulation of the promoter region of the human adiponutrin/PNPLA3 gene by glucose and insulin[J]. Biochemical and biophysical research communications, 2010, 402(4): 767-772.

[7]Zhu X, Huang L, Li G, et al. Genome‐Wide Silencer Screening Reveals Key Silencer Modulating Reprogramming Efficiency in Mouse Induced Pluripotent Stem Cells[J]. Advanced Science, 2025: 2408839.