【文献速递】ChIP-seq如何解析转录因子调控机制，典型应用案例解析（一）

在生理状态下，肺泡II型（AT2）细胞通过激活自我修复程序，促进增殖并分化为肺泡I型（AT1）细胞以维持上皮稳态。然而，特发性肺纤维化（IPF）患者的AT2细胞呈现加速衰老特征，导致肺泡修复障碍并加剧肺损伤及纤维化进程。2024年7月，哈尔滨医科大学梁海海团队联合上海工程技术大学单宏丽教授、同济大学附属上海肺科医院李志新博士在Experimental & Molecular Medicine（IF=12.9）发表的重要研究揭示了YAP1的关键作用：尽管YAP1已知对细胞生长和器官发育至关重要，但其在肺纤维化中的机制此前尚不明确。该团队通过实验证明，YAP1/TEAD1复合物通过转录激活过氧化物还原酶3（Prdx3）的表达，显著改善线粒体功能障碍，从而抑制AT2细胞衰老并缓解纤维化。这一发现不仅阐明了"YAP1/TEAD1-Prdx3"轴调控AT2细胞衰老的新机制，更为肺纤维化治疗提供了潜在靶点策略。

一、研究思路

二、关键结果展示

01 YAP1在肺纤维化中的表达变化

作者首先通过整合单细胞测序数据和实验验证，系统揭示了YAP1在肺纤维化中的差异化表达模式。生物信息学分析显示，IPF患者的AT1和AT2细胞中YAP1表达显著下调，而肺成纤维细胞中YAP1表达却明显上调（图1a，b）。接着作者构建了博莱霉素（BLM）诱导的小鼠肺纤维化模型。免疫荧光染色结果显示，BLM处理组小鼠肺组织中AT2细胞标志物Sftpc与YAP1的共定位信号显著减弱（图1c），而肺成纤维细胞标志物S100A4与YAP1的共定位信号增强（图1d），这一发现与单细胞测序结果相互印证。进一步的分子水平检测表明，BLM处理的MLE-12细胞中YAP1的蛋白表达（图1e）和mRNA水平（图1f）均显著降低。这些结果共同表明，在肺纤维化进程中，AT2细胞中YAP1的表达下调可能通过影响肺泡上皮稳态参与IPF的病理发展。

图 肺纤维化过程中AT2细胞中YAP1表达降低。

02 YAP1缺失加剧肺纤维化

为探究YAP1在肺纤维化中的作用，作者通过将YAP1fl/fl小鼠与Sftpc-Cre小鼠杂交构建了AT2细胞条件性YAP1敲除小鼠（YAP1-cKO）（图2a-d），并通过Western blot和免疫荧光分析验证了YAP1在AT2细胞中的成功敲除（图2c-d）。肺功能测试结果显示，BLM处理的野生型（WT）小鼠肺顺应性（Cst）和吸气量（IC）显著降低，而YAP1-cKO小鼠在BLM诱导后呼吸功能进一步恶化（图2e）。Micro-CT分析表明，AT2细胞中YAP1的缺失加剧了BLM诱导的肺纤维化程度（图2f）。Western blot和qRT-PCR检测发现，YAP1-cKO小鼠中纤维化相关标志物（如Fn1和α-SMA）的蛋白及mRNA表达水平显著升高（图2g-h）。此外，Masson三色染色、免疫组织化学（IHC）分析及羟脯氨酸含量测定进一步证实，YAP1敲除小鼠的胶原沉积和肺纤维化程度均显著高于WT小鼠（图2i-k）。综上，AT2细胞中YAP1的缺失会加重BLM诱导的肺纤维化。

图 AT2细胞中YAP1基因敲除加重BLM诱导的肺纤维化。

03 YAP1过表达缓解肺纤维化

为探究YAP1过表达对肺纤维化的抑制作用，作者构建了AT2细胞条件性YAP1过表达小鼠模型（YAP1-cKI）（图3a-d）。Western blot和免疫荧光分析证实YAP1在AT2细胞中成功过表达（图3c,d）。肺功能测试和Micro-CT结果显示，YAP1过表达显著改善了BLM诱导的肺顺应性（Cst）和吸气容量（IC）下降，并有效缓解肺结构重塑（图3e,f）。在分子水平上，WB和qRT-PCR分析表明YAP1过表达显著抑制了BLM处理后纤维化标志物（Fn1和α-SMA）在蛋白和mRNA水平的升高（图3g,h）。组织学分析进一步显示，YAP1过表达可抑制胶原沉积、减少肌成纤维细胞活化并降低羟脯氨酸含量（图3i,k）。这些结果共同证明，AT2细胞中YAP1的过表达能够有效抑制BLM诱导的肺纤维化。

图 YAP1在AT2细胞中的过表达减轻肺纤维化。

04 YAP1通过调控AT2细胞衰老与再生影响肺纤维化进程

为探究YAP1是否通过抑制AT2细胞衰老及促进肺泡再生来缓解肺纤维化，作者通过基因编辑小鼠模型发现：在BLM诱导的肺纤维化模型中，与WT小鼠相比，YAP1-cKO小鼠表现出以下病理特征：（1）肺泡再生能力显著下降，表现为AT1/AT2细胞标志物Aqp5/Sftpc信号减弱（图4a）；（2）肺组织结构损伤加重，炎症浸润加剧（图4b）；（3）细胞凋亡增加，衰老相关蛋白p16/p21表达上调（图4c）、SASP因子分泌增多（图4d），且SA-β-半乳糖苷酶（SA-β-GAL）活性升高（图4e）。相反，YAP1-cKI小鼠则呈现保护性表型：（1）AT2细胞凋亡受抑制，Aqp5/Sftpc信号增强（图4f）；（2）肺组织重塑和炎症反应减轻（图4g）；（3）衰老相关标志物p21及SASP因子表达下调（图4h-i），SA-β-GAL活性降低（图4j）。这些结果明确揭示了YAP1的作用机制：其缺失会加速AT2细胞衰老与凋亡，而过表达则通过抑制细胞衰老、促进肺泡再生，从而改善肺纤维化病理进程。

图 YAP1在BLM致肺损伤和衰老中的作用。

05 YAP1通过与TEAD1相互作用转录激活Prdx3

作者深入探究了YAP1抑制细胞衰老的分子机制。作为转录辅激活因子，YAP1通过与转录因子TEAD1结合形成复合物调控下游靶基因表达。通过整合ChIP-seq和蛋白质组学分析（图5a,b），发现YAP1/TEAD1主要调控线粒体功能和氧化应激相关信号通路，并从中鉴定出31个重叠基因，其中线粒体抗氧化蛋白Prdx3与YAP1呈现显著调控相关性（图5c,d）。WB和qRT-PCR实验证实，YAP1过表达可显著提升Prdx3的蛋白和mRNA水平，而敲低YAP1则产生相反效果（图5e,f）。ChIP实验进一步验证了YAP1/TEAD1复合物对Prdx3启动子的直接调控作用（图5g）。结合JASPAR预测和分段荧光素酶报告基因实验，精确定位YAP1/TEAD1在Prdx3启动子上的功能结合区域为-1202至-531bp（图5h）。值得注意的是，当使用verteporfin阻断YAP1-TEAD1相互作用或引入YAP1S94A突变时，YAP1对Prdx3的转录激活能力显著降低（图5i），这充分证实了YAP1/TEAD1-Prdx3调控轴在抑制细胞衰老中的核心作用。

图 YAP1/TEAD1直接靶向 Prdx3。

06 YAP1通过上调Prdx3的表达来抑制细胞衰老和线粒体功能障碍

研究表明，线粒体功能障碍是诱导细胞衰老的关键因素。作者首先在MLE-12细胞中证实，Prdx3能够显著抑制BLM诱导的细胞衰老和线粒体功能障碍（补充图1a-i）。进一步探究发现，YAP1通过调控Prdx3的表达发挥保护作用：（1）Western blot显示，YAP1过表达可下调衰老标志物p16和p21的表达，但该作用被si-Prdx3抵消（图6a）；（2）SA-β-GAL活性检测和细胞形态分析表明，si-Prdx3导致YAP1过表达细胞的衰老表型增强（图6b）；（3）凋亡相关蛋白Bax和Cyt-C的表达受YAP1抑制，而si-Prdx3可逆转这一效应（图6c）；（4）γH2AX免疫荧光显示，YAP1通过Prdx3减少DNA损伤（图6d）。YAP1通过转录激活Prdx3表达，改善线粒体功能障碍（包括ROS稳态、膜电位及动态平衡），进而抑制细胞衰老和凋亡，为肺纤维化治疗提供了新靶点。

图 Prdx 3的沉默消除了YAP 1对衰老和线粒体功能障碍的影响。

07 Prdx3的过表达抑制小鼠肺纤维化

通过腺相关病毒AAV5-Prdx3在BLM诱导前14天处理WT小鼠，特异性增强AT2细胞中Prdx3的表达（图7a）。实验结果显示，Prdx3过表达显著改善了肺纤维化表型：（1）功能层面恢复BLM损伤小鼠的呼吸能力并缓解肺结构重塑（图7b,c）；（2）分子水平上抑制纤维化标志物（Fn1、α-SMA）在蛋白和mRNA层面的异常上调（图7d,e）；（3）组织病理学分析显示胶原沉积减少、α-SMA阳性细胞减少及羟脯氨酸含量降低（图7f-h）；（4）同时减轻炎症浸润（图7i）并抑制细胞衰老，表现为SA-β-gal活性下降和p21表达下调（图7j,k）。超微结构观察证实Prdx3过表达可改善线粒体形态异常（脊丢失和肿胀）（图7l），并通过调控线粒体动力学蛋白（Drp1/Mfn2）表达恢复线粒体功能（图7m）。这些发现表明，Prdx3通过抑制肺泡上皮细胞衰老和改善线粒体功能障碍发挥抗肺纤维化作用。

图 Prdx3抑制小鼠实验性肺纤维化。

参考文献

Su W, Guo Y, Wang Q, et al. YAP1 inhibits the senescence of alveolar epithelial cells by targeting Prdx3 to alleviate pulmonary fibrosis[J]. Experimental & Molecular Medicine, 2024, 56(7): 1643-1654.