- PCR反应依靠DNA双链的分离和重组进行，需要以DNA模板为基础反应物质。
样本准备
- PCR流程:
- 样品准备 ➜ 液氮研磨 ➜ RNA 提取 ➜ 浓度/纯度检测
- RNA ➜ 加引物 + RT 酶 ➜ cDNA 合成
- PCR 体系配置 ➜ 退火温度调整 ➜ 检测扩增结果 ➜ 如有问题进行程序优化或换引物
| 样品类型 | 是否推荐液氮研磨 | 原因说明 |
|---|---|---|
| 植物组织（叶片、根、种子） | 非常推荐 | 纤维素丰富，细胞壁坚硬，液氮有助于充分裂解 |
| 动物组织（肝、肌肉） | 视情况而定 | 柔软组织可用匀浆器或组织研磨器代替 |
| 血液、细胞培养物 | 不需要 | 无需机械研磨，直接裂解即可 |
| 细菌、真菌 | 可用酶或超声 | 有细胞壁，可用酶（如Lysozyme）裂解，或用珠磨仪 |
| 病毒样本（如 HIV RNA） | 不需要 | 通常使用裂解液直接破膜，无需研磨 |
RNA → cDNA原理
- 所需材料
| 类型 | 成分 |
|---|---|
| 模板 RNA | 提取自细胞、血液、病毒（如 HIV RNA） |
| 引物 | Oligo(dT)、随机引物（Random Hexamer）或基因特异引物 |
| 逆转录酶 | 如 M-MLV、RevertAid、HiScript |
| dNTPs | 四种脱氧核苷酸（A, T, C, G） |
| 缓冲液 | RT Buffer（维持pH + 提供 Mg²⁺） |
| （可选） | RNase抑制剂（防止 RNA 降解） |
- 反应体系配置（20 µL体系举例）
| 组分 | 用量示例（µL） | 说明 |
|---|---|---|
| RNA 模板（≤1 µg） | 1–2 | 纯度高，无DNA污染 |
| 引物（10 µM） | 1 | oligo(dT) 或 Random Hexamer |
| dNTP（10 mM） | 1 | 终浓度 0.5 mM |
| 5× RT Buffer | 4 | 维持酶活 |
| 逆转录酶（200 U/µL） | 1 | 常用 RevertAid, M-MLV 等 |
| RNase Inhibitor（可选） | 0.5 | 防止 RNA 被降解 |
| 无RNA酶的水（ddH₂O） | 补足至 20 µL | 控体系体积 |
- 热循环程序
1. 65°C, 5 min （退火引物）
2. 冷却至 4°C，加酶
3. 42–50°C, 30–60 min （逆转录合成）
4. 70°C, 5 min （终止反应，灭活酶）
5. 冷却至 4°C （保存）
- 注意事项
| 项目 | 建议 |
|---|---|
| RNA 纯度 | OD260/280 ≥ 1.8，避免DNA污染（推荐加 gDNA wiper） |
| 引物选择 | 随机引物适合病毒检测，oligo(dT)适合 mRNA |
| 保存 | 合成好的 cDNA 可 -20 ℃ 保存 6个月，避免反复冻融 |
- 在 RNA 实验中，避免核糖核酸酶（RNase）污染是至关重要的，因为 RNase 非常稳定、活性强且广泛存在于皮肤、环境和材料中，一旦污染就可能迅速降解 RNA，导致实验失败。需要避免 RNase 污染：
-
无RNA酶的实验环境：使用专用 RNA 实验台（或 PCR 柜）；实验前 70% 乙醇或 RNaseZap 擦拭所有操作表面；工作区域使用一次性无尘纸垫或灭菌铝箔覆盖；限定只处理 RNA 的区域、器具和人员。
-
戴手套 + 更换频繁： 实验全程佩戴一次性手套；每次接触门把手、计算机或其它非无菌表面后换新手套；手套也可能带有 RNase，尤其是重复使用的。
-
使用专用无 RNase 试剂和耗材： 使用 RNase-free 标注的试剂盒、试剂、水（DEPC-treated 水或商业 RNase-free 水）；吸头、离心管等耗材使用灭菌无 RNase 的，或经高温（121°C）高压灭菌后使用；避免使用已经开封并长时间暴露的液体试剂。
-
DEPC（焦碳酸二乙酯）处理：普通水和溶液可以用 DEPC 处理（0.1% DEPC 处理过夜，次日高压灭菌）以灭活 RNase； 注意：DEPC 不能用于含氨基酸、Tris、DTT 等活性基团的缓冲液。
-
低温处理 & 快速操作：RNA 提取、转录、储存等过程应尽量放在冰上或 4°C 条件下操作；样本不要长时间暴露于室温；操作中速度要快，尤其是裂解组织、提取上清这一步骤。
-
使用 RNase 抑制剂：在反转录、RT-qPCR 等体系中添加 RNase 抑制剂（如 RNasin）；特别推荐用于小量样本或细胞提取物处理。
-
RNA 样本的储存：RNA 最好溶于 RNase-free 水或 TE 缓冲液中；分装储存，避免反复冻融；可加入 RNA Protect 溶液或 TRI Reagent 等稳定剂；冷冻储存：-80°C，或在液氮中长时间保存。
-
RNA → cDNA实现：试剂盒 从样本中提取病毒 RNA & cDNA
-
在病毒检测、基因表达分析等实验中，第一步一般为从样本中提取RNA。从 RNA 获取 cDNA（互补DNA）是从样本中提取DNA模板的关键步骤。
-
试剂盒更适合入门，且购买的试剂盒均配有说明书和推荐程序，需要仔细阅读。例如：FastKing cDNA 第一链合成试剂盒 ( 去基因组 )(KR116)
-
up主 小铭要退休 的视频 获取cDNA、扩增基因，完整讲解了 从 RNA 获取 cDNA 并进行扩增的实现流程和注意细节。
-
RNA 提取部分（重点：样品准备 + 防降解）
| 步骤 | 要点 |
|---|---|
| 工具要求 | 所有 EP 管、枪头需为 RNase-Free（无核酸酶） |
| 样品量控制 | 不推荐装满 2 mL EP 管，防止研磨不充分、提取效率低 |
| 液氮研磨建议 | 建议使用 45 Hz × 30 s × 2次，60 Hz 易碎管 |
| 裂解试剂（Trizol等） | 含 RNase 抑制剂 + 有机试剂，务必通风 + 快速操作 |
| 震荡+离心 | 加滤仿后剧烈震荡再离心 → 上层为水相，转移时避免吸到中间层或有机层 |
| 浓度检测标准 | OD260/280 ≈ 1.8–2.0，OD260/230 > 2 表示纯度较好 |
- cDNA 合成（逆转录）
| 项目 | 要点说明 |
|---|---|
| 试剂选择 | 选择可用于常规 RT-PCR 的逆转录试剂（如 RevertAid, HiScript） 避免仅适用于 qPCR 的 RT SuperMix |
| 引物类型 | 可选 Oligo(dT)、Random Hexamer 或基因特异性引物 |
| RNA 投入量 | 严格按说明书配比，RNA 不是越多越好，过量会抑制反应 |
| 注意事项 | 避免污染、反应体系配置要冷链操作，RNA可提前加热变性 |
- PCR 扩增与常见问题
| 项目 | 要点说明 |
|---|---|
| 酶选择说明书 | 不同 DNA 聚合酶变性温度不一：94/95/98 °C 需根据说明书设定 |
| 退火温度设置 | 起始可设 56 °C，若非特异性条带多，可升至 58–60 °C；若无条带，可降至 52 °C |
| 延伸时间 | 72 °C，时间取决于酶速率和产物大小，一般 1kb/min |
| 循环数 | 一般 35 次，如无条带可增加至 38–40 |
| 无条带时建议 | 检查 PCR 程序、适当加样量、更换酶、优化引物（如设计在 UTR 区域） |
| 杂带太多时建议 | 杂带远离目标带：可切胶回收；杂带干扰目标带：优化 PCR 或重设引物 |
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| 品牌（公司） | 产品名称 | 编号 | 方法 | 适用样本 | 规格 | 价格参考 | 适用说明 |
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