核酸投入量、核酸转化率、检测灵敏度

拷贝数

1. 核酸投入量

  1ngDNA大概含有317个拷贝。
  单个脱氧核糖核苷酸分子量平均为300，一个碱基对为600，人类染色体组约有31.647亿对碱基，一个分子量单位相当于1.66×10-27 kg，而1ng=10^-9kg。
  因此1ng DNA有多少个拷贝计算方法如下：
  1ng DNA=10^{-9/(31.647*10}830021.6610^-24)≈317个拷贝数。
 
  如果我们的panel核酸投入量为50ng，也就意味着共计有50*317=15850个基因组拷贝。
  核酸转化率和检测灵敏度是影响核酸投入量的两个关键因素

2. 核酸转化率

  通常组织样本的核酸转化率在20%-30%之间。
  在DNA打断、转管、PCR扩增、建库、上机及生信分析的过程中，都会对原始分子模板产生一定的损耗，进而导致只有部分原始分子模板转化为有效测序分子模板(去除PCR重复读取之后的深度)，通常来讲，组织的核酸转化率在20%左右(杂交捕获平台，各家公司有所不同)。
  以20%为例，投入50ngDNA，共计有15850个拷贝，而最终只有3170个拷贝转化为有效测序分子模板。如果核酸转化率为10%，如需要3170个有效测序分子模板时则需要100 ng DNA。
  因此，在灵敏度不变的情况下，核酸转化率越低的公司则需要更高的核酸样本量。

3. 检测灵敏度

  肿瘤基因中常见的重要突变，一般灵敏度需要在0.5%左右（组织样本）。
  某突变，检测灵敏度为0.5%，以10条突变分子模板为阈值线，则需要有10/0.5%=2000条有效测序分子模板，也就是说该位点测序深度2000X，10条reads发生突变（正或负模板链），此时AF值为0.5%。按照20%的核酸转化率计算，所需原始分子模板最少为2000/20%=10000条有效测序分子模板，也就是需要10000/317=31.5ng DNA，如果灵敏度为0.1%，核酸转化率为20%不变，那么就需要10/0.1%/20%/317=157.7ngDNA。
 
  因此，相同的核酸转化率下灵敏度要求较高的公司则需要更高的核酸样本量。

4.各肿瘤NGS公司重点：提高核酸转化率

  对于肿瘤基因检测，各家公司的灵敏度大致相同；因此，提高核酸转化率降低核酸投入量则成为了肿瘤基因检测公司重点优化对象，而建库试剂盒优化则是整个优化的重点。
  目前，各家公司最主要的优化方式是通过对探针的优化和分子标签(UMI)的优化进而达到提高转化率的效果。

5.干实验测序深度的确认

5.1 饱和测序

  对于胚系检测（预期AF为50%），30X就已经足够了，此时已经完全区分测序错误reads、正确reads。

5.2 理想的最低深度

  肿瘤测序时，因肿瘤细胞的占比没那么高，再考虑肿瘤异质性、组织切片纯度、突变入血率等原因，预期频率没有那么高，通常是5%、3%、1%左右，如果是血液会低至0.1%。

  如果我们在1%时，追求饱和测序，那测序的深度将会达到2500X。所以需要一个理想的测序深度，也就是能完成对阳性位点和阴性位点进行区分的最低深度。

5.3 深度确定策略

  提高我们的测序深度，从而使阳性信号分布和错误信号分布产生可以识别的差别来满足我们的性能需求。

   可以看到随着深度的增加，阳性信号分布和错误信号分布的交集区域（无法有效分辨真假）会逐步减少直至勉强可以分开，按照图中预设值是700X.

参考文献：
（1）不算太冷的知识点: 1ngDNA 有多少基因组拷贝
（2）你家panel核酸要求量和别家公司为什么不一样？
（3）天天都说高深度测序，怎么确定要测多深呢？