常见实验技术∶ 免疫染色 (IHCICCIF) Get 全流程!

IHC/ICC/IF 总迷糊? 免疫染色为啥感觉那么多？

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Section.01

免疫染色知多少?

免疫染色 (Immunostaining) 是一项重要的生物学技术，主要用于检测组织切片中的特定抗原并获取有关细胞结构的信息。

免疫染色是基于抗体与其靶抗原的特异性结合 (图 1)。抗原抗体复合物的检测依赖于与抗体偶联的标记物。使用酶时，需要酶的比色法或化学发光法底物。酶催化反应生成有色产物，可使用光学显微镜检测。对于荧光染料，可使用荧光显微镜测量荧光信号，无需额外的底物[1]。

图 1. 免疫染色的典型工作流程。

免疫染色始于细胞或组织制备，其中特定细胞或组织样本被固定以保留其结构。然后将样本与封闭缓冲液孵育，以防止抗原和抗体之间的非特异性结合。随后，将样本与特异性结合目标抗原的一抗孵育，再与连接荧光染料或酶的二抗孵育。清洗去除多余抗体后，使用封固剂将样本封固在载玻片上。最后，使用合适的显微镜观察抗原-抗体复合物。

免疫染色：直接法 or 间接法?

免疫染色主要使用两种方法：间接免疫染色法和直接免疫染色法。

间接法：同时使用一抗和二抗。一抗可特异性结合目标抗原。一抗通常在动物体内通过注射特定抗原而产生 (例如山羊、小鼠或兔子)。二抗通常与可检测标记物（例如酶或荧光染料）偶联，并与一抗结合。为防止交叉反应，最好使用与产生一抗的物种不同的二抗。多个二抗可以与每个一抗相互作用，从而增强可检测信号。此外，一种二抗可以与多种一抗一起使用。
直接法：使用与特异性结合抗原的可检测标记物偶联的单一抗体。该方法只需一步抗体孵育，比间接法更简单、更快捷。然而，由于直接法使用单一抗体，其灵敏度低于间接法，而且由于可用的探针/酶偶联一抗有限，其应用受到限制。

图 2. 直接法和间接法示意图。

两种方法各有优势，研究人员可参考下面表格 (表 1)[1]，根据实验目的选择合适的方法！

表 1. 直接和间接免疫染色方法的特点

免疫染色：ICC、IHC 与 IF?

ICC 与 IHC 均属于免疫染色。免疫组化 (Immunohistochemistry, IHC)
是用于检测组织切片中特定抗原或蛋白质，广泛应用于病理学，以诊断癌症等疾病和研究组织特异性蛋白质测定。当应用于细胞学制备时，通常称为免疫细胞化学 (Immunocytochemistry, ICC)，其适用于多种细胞学样本，例如细胞块、风干玻片、乙醇固定玻片、直接涂片、细胞离心涂片和液基细胞学 (Liquid-based cytology, LBC) 样本[2][3]。ICC 常用于识别细胞中特定生物标志物的存在、亚细胞定位和原位大分子相互作用[1]。

免疫荧光 (Immunofluorescence, IF) 也是利用抗体和抗原的结合特异性，是免疫染色的一种广泛应用的例子。IHC 通常使用多种不同的酶标记物来检测目标抗原。(当然，IHC 也可升级为多重荧光染色的 mIHC)。ICC 通过使用与抗体偶联的荧光染料或酶，可以分别在荧光显微镜和光学显微镜下可视化目标抗原。IF 利用荧光显微镜检测与抗体结合的荧光染料，此外，IF 可进行多种荧光染色，允许研究人员进行多重标记，IF 的多重染色常用于评估大分子的共定位[1]。

注意：对于多重染色，需要选择发射光谱不重叠的荧光染料，以防止光谱重叠导致信号错误解读。

表 2. 不同类型免疫染色的特点[1]

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ICC/IF: 实操流程

往期我们为大家介绍了免疫组化，本期我们来了解下 ICC/IF 究竟如何做？

第一步：样品准备

细胞免疫荧光技术是一种基于抗体与标记物相互作用的技术。它通过特异性的抗体与细胞表面或细胞内分子结合，再通过标记物在荧光显微镜下进行观察。实验流程通常包括样品制备、固定、通透、封闭、抗体孵育、复染、封片和观察 8 个部分。

图 3. ICC/IF 实验流程图。

目的

根据实验设计，准备状态良好的细胞样品。细胞培养是实验的基础，细胞状态直接影响实验结果。

步骤

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基本步骤：

1. 准备盖玻片或共聚焦小皿。盖玻片需提前浸泡在 70% 乙醇中，盖玻片完全干燥后移至细胞培养板中，整个过程注意无菌操作。

2. 铺细胞。在包被的盖玻片或板上铺适当的细胞，使后续固定细胞时，融汇度达到 50-60%。如果细胞过密或过稀，正常细胞结构可能会受到影响。

3. 收集样品。针对贴壁细胞，细胞继续培养 12 h，细胞牢牢贴壁后，收集样品进行后续操作。而对于悬浮细胞，可以通过甩片进行。

Tips:

① 尽量选用新鲜制备的样本，并确定样品中抗原分子的表达丰度；

② 后续所有操作，动作要轻柔，避免细胞脱落；

③ 后续所有操作都需避免干片。

第二步：固定

目的

使用固定剂（如甲醇、丙酮、多聚甲醛等）处理细胞，使蛋白质变性凝固，从而固定细胞形态和结构。同时，固定剂还能减少或终止内源性或外源性细胞内分解酶的反应，防止组织细胞自溶，保护抗原性。

固定剂如何选？

步骤

1. 固定：使用 4% 的多聚甲醛固定细胞 10 ~ 15 min；

2. 洗涤：使用 PBS 缓冲液清洗 3 次，以去除残留的固定液。

Tips:

① 初次实验，建议从 4% 的多聚甲醛,固定 15 min 开始尝试，倘若没有达到预期效果，再调整固定时间或更换另一种固定剂。

② 较长的孵育时间通常会导致更高的固定程度，直至表位可能过度固定。孵育时间短可能导致表位保存不良和样品固定不足。最佳固定时间需要根据经验确定。

第三步：通透

目的

通过去污剂部分溶解细胞膜，形成孔洞，从而使抗体能够到达细胞内表位，与细胞内的抗原结合。（该步骤可选做；通透步骤会破坏细胞膜，细胞膜表面抗原不适合选择通透实验）

图 4. 细胞膜打孔处理示意图。

通透剂如何选？

步骤

1. 通透：加入 0.1–0.25% Triton X-100 (PBS 配制)，覆盖细胞，室温下通透 5-10 min；

2. 洗涤：使用 PBS 缓冲液清洗 3 次，以去除残留通透液。

Tips:

① 通透剂的浓度和孵育时间应针对所用样品进行优化。

第四步：封闭

封闭液中的成分能够与细胞表面的非特异性位点结合，从而阻止抗体与这些位点的非特异性结合。

目的

根据实验设计，准备状态良好的细胞样品。细胞培养是实验的基础，细胞状态直接影响实验结果。

封闭液的选择

可以选择与二抗相同来源的血清或者 BSA 等，例如，若二抗为山羊抗小鼠，应选择山羊血清作为封闭剂。

步骤

使用 2-10% 的 BSA/山羊血清，室温或 37℃ 封闭 1 h。

Tips:

① 封闭溶液不应含有一抗的宿主动物血清，因为这可能会导致高背景。

② 注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。

第五步：抗体孵育

目的

使抗体充分与目的蛋白抗原结合，决定了荧光信号的位置和特异性，进而影响实验结果的准确性和可靠性。

注意：该步骤可选择 (i) 直接检测，一抗直接与荧光基团偶联。(ii) 间接检测，使用合适的荧光标记二抗检测一抗。这两种方法各有优点和缺点，其中，间接检测是最常用的检测方法。

抗体的选择

单染：一抗要选择任一宿主来源的抗体，二抗选择对应的抗一抗宿主的抗体。例如，一抗是小鼠来源，二抗要选择抗小鼠的抗体 (如山羊抗小鼠，驴抗小鼠等)。
双染/多染：在进行多个荧光标记实验时，一抗要选择不同宿主来源的抗体，二抗选择对应的抗一抗宿主的抗体。同时要注意选择具有高区分度的荧光二抗，避免荧光重叠。例如，在进行三色荧光标记时，一般选用绿色、蓝色和红色这三种荧光基团，以确保每个信号都能被清晰地区分出来。

步骤

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基本步骤：

(以间接检测为例)：

1. 一抗孵育：根据研目标抗原和样品特性选择符合要求的一抗，并按照说明书要求稀释一抗，加入到样品中并在 4℃ 条件下孵育过夜 (12 ~ 16 h)。

2. 洗涤：回收一抗工作液，用 TBST/PBST 摇床缓慢清洗 3 次，每次 5~10 min，以去除未结合的抗体。洗涤次数和时间可根据实验条件调整。

3. 二抗孵育：根据一抗的种类及样品特性 (二抗携带的荧光需要与样品自带荧光不冲突) 选择合适的荧光标记的二抗，在室温下避光孵育 1 h。稀释和使用方法应遵循说明书。

4. 洗涤：去除/回收二抗工作液，用 TBST/PBST 摇床缓慢清洗 3 次，每次 5 ~ 10 min，以去除未结合的抗体。洗涤次数和时间可根据实验条件调整。

Tips:

① 孵育荧光二抗之后，一定要注意避光保存！

② 确定合适的二抗工作浓度浓度，避免无信号或背景过高现象的发生；

③ 注意湿盒的保湿效果，避免样品的干燥；