qiime2扩增子分析个人笔记

起个头

基于qiime2-2023.5版本的16s分析流程，新手在第一次完成这一连串的中遇到了许多问题，现记录在本帖中。由于conda和qiime2安装流程比较常规，便不再记录了。

一、原始数据获取

本人基于文章提供的NCBI_Project号从ENA（https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/home）中获得下载的脚本。

右上角输入项目号

选择需要的样本后点击红框的按钮获得下载的脚本。

之后在服务器相应的样本文件夹中bash一下脚本就可以下载数据了。

也可在windows系统中直接点下载选中的文件，然后导入服务器中。

二、导入数据

1.制作manifest文件

首先在NCBI中获得样本的metadata文件

输入项目号，选完所需要的样本后在send to中选择run selector然后go！

metadata出现啦！点击即可下载！
但是这个metadata的第一列是run，把这个列名理解成sample id即可！

根据metadata文件制作manifest文件
双端序列文件可以用以下代码（示例）：

awk -F',' 'BEGIN {OFS="\t"} NR==1 {print "sample-id", "forward-absolute-filepath", "reverse-absolute-filepath"} 
           NR>1 {print $(NF-2), "your_path/"$1"_1.fastq.gz", "your_path/"$1"_2.fastq.gz"}' SraRunTable.csv > manifest

单端序列文件可以用以下代码（示例）：

awk -F',' 'BEGIN {OFS="\t"} NR==1 {print "sample-id", "absolute-filepath"} 
           NR>1 {print $(NF-2), "your_path/"$1".fastq.gz"}' SraRunTable.csv > manifest

索引可以改成你想要的，如$(NF-2)中NF是总长度，NF-2则是倒数第三列的索引。

2.数据导入qiime2中

这是双端导入的格式：

qiime tools import \
  --type 'SampleData[PairedEndSequencesWithQuality]' \
  --input-path manifest \
  --output-path paired-end-demux.qza \
  --input-format PairedEndFastqManifestPhred33V2

这是单端导入的格式：

qiime tools import \
 --type 'SampleData[SequencesWithQuality]' \
 --input-path manifest \
 --output-path single-end-demux.qza \
 --input-format SingleEndFastqManifestPhred33V2

导入数据可视化（查看原始数据质量）

qiime demux summarize \
   --i-data paired-end-demux.qza \ #单端序列换成single开头的文件
   --o-visualization demux-raw-summary.qzv

在这里https://view.qiime2.org/查看可视化文件（将qzv文件导入）

三、去噪、生成OTU

1.双端序列

qiime dada2 denoise-paired \
  --i-demultiplexed-seqs paired-end-demux.qza \
  --p-n-threads 0 \
  --p-trim-left-f 0 --p-trim-left-r 0 \
  --p-trunc-len-f 0 --p-trunc-len-r 0 \
  --o-table table.qza \
  --o-representative-sequences rep-seqs.qza \
  --o-denoising-stats denoising-stats.qza

其中p-n-threads为线程，自行调节即可。截断位点可以通过figaro软件得到dada2插件正反向截断位点信息，参考：https://www.jianshu.com/p/66ebd1d4558a

可视化特征表、代表序列及统计信息

qiime feature-table summarize \
  --i-table table.qza \
  --o-visualization table.qzv \

qiime feature-table tabulate-seqs \
  --i-data rep-seqs.qza \
  --o-visualization rep-seqs.qzv

qiime metadata tabulate \
    --m-input-file denoising-stats.qza \
    --o-visualization denoising-stats.qzv

OTU表导出

qiime tools export \
   --input-path table.qza \
   --output-path export #输出目录而不是文件
# 将biom格式转换成tsv格式便于查看
biom convert \
   -i feature-table.biom \
   -o feature-table.tsv \
   --to-tsv

2.单端序列

首先根据碱基质量采用默认参数过滤序列

qiime quality-filter q-score \
  --i-demux single-end-demux.qza \
  --o-filtered-sequences demux-filtered.qza \
  --o-filter-stats demux-filter-stats.qza

可视化质控统计结果

qiime metadata tabulate \
  --m-input-file demux-filter-stats.qza \
  --o-visualization demux-filter-stats.qzv

Deblur去噪
输入文件为质控后的序列，设置截取长度参数，生成结果文件有代表序列、特征表、样本统计。

qiime deblur denoise-16S \
  --i-demultiplexed-seqs demux-filtered.qza \
  --p-trim-length 400 \
  --p-sample-stats \
  --o-representative-sequences rep-seqs.qza \
  --o-table table.qza \
  --o-stats deblur-stats.qza

可视化去噪统计结果

qiime deblur visualize-stats \
  --i-deblur-stats deblur-stats.qza \
  --o-visualization deblur-stats.qzv

可视化特征表

qiime feature-table summarize \
  --i-table table.qza \
  --o-visualization table.qzv \

四、物种注释

首先下载训练集
16s：Silva 138 99% OTUs full-length sequences

wget -c https://data.qiime2.org/2023.5/common/silva-138-99-nb-classifier.qza

物种注释

qiime feature-classifier classify-sklearn \
  --i-classifier /users/chenhong/amplicon/silva-138-99-nb-classifier.qza \
  --i-reads rep-seqs.qza \
  --o-classification taxonomy.qza

可视化物种注释

qiime metadata tabulate \
  --m-input-file taxonomy.qza \
  --o-visualization taxonomy.qzv

可视化堆叠图

qiime taxa barplot \
  --i-table table.qza \
  --i-taxonomy taxonomy.qza \
  --o-visualization taxa-bar-plots.qzv

总结

先写到这，笔记后续再补充。