三代测序预处理.pdf

根据给定的文件信息，本文将对三代测序技术中PacBio RS II和Sequel系统的预处理流程及相关知识点进行详细介绍。 三代测序技术，尤其是PacBio RS II和Sequel系统，是基于单分子实时测序（SMRT）技术的测序平台。它们能够提供长读长、高精度的序列数据，这在基因组组装和结构变异检测等方面有着重要意义。PacBio平台的测序芯片称为SMRT细胞，其中包含成千上万的零模式波导（Zero-Mode Waveguides，ZMW），每个ZMW都能捕捉单个DNA聚合酶进行实时测序的过程。 在PacBio RS II的预处理过程中，首先会得到三个质量等级的ZMW：P0代表未检测到高质量读数，P1代表检测到高质量读数，而P2则表示检测到信号但未达到高质量读数标准。预处理的关键步骤是校正测序错误，PacBio测序的错误主要由11%的插入错误、4%的删除错误和1%的错配错误组成。对这些错误的校正通常会用到基础局部对齐与逐步精化的算法（BLASR）进行单分子序列的比对。 PacBio测序数据预处理的一个重要方面是无GC偏差的覆盖度分析。GC含量的变化会显著影响某些测序技术的覆盖度，而PacBio测序技术在这方面展现出了优势，即使在GC含量波动的区域也能保持相对均匀的覆盖度。 在介绍文件中，提到了文件格式转换、软件安装和运行流程。文件格式转换主要是将PacBio RS II的threebax.h5格式数据转换为Sequel系统的bam格式数据。这一过程可以通过FALCON-formatter实现，并且在GitHub上有相应的项目与转换指南。 关于软件的安装，需要安装SMRTAnalysis 2.3用于PacBio RS II，以及SMRTLink v5.1.0用于PacBio Sequel系统。软件可以从PacBio官方网站上下载，也可以通过GitHub上的链接获取更多信息和安装指南。 运行流程方面，提供了使用命令行工具smrtlink/smrtcmds/bin/pbsmrtpipe的实例，可以通过这个命令启动预处理的pipeline，并通过$SMRT_ROOT/smrtlink/smrtcmds/bin/pbsmrtpipe的帮助命令来获取使用方法。 此外，文件中还提到了软件运行配置文件的路径，数据输入文件的原始subreads xml文件以及流程参数文件。通过创建dataset xml文件，可以自己配置数据输入文件，该文件可以通过datasetcreate命令来生成，并且GitHub上SMRT-Link页面提供了创建dataset xml文件的详细指南。 文中还提到了一个pipeline的presets xml文件的示例，其中定义了任务选项，如其他过滤器和读取长度等，这些参数在实际预处理流程中可以进行自定义调整。输出目录通常包括logs/html/replacedReports/，该目录中包含了输出图像和工作流程的报告。 通过上述知识点的梳理，我们可以了解到PacBio三代测序预处理的复杂性以及技术细节，这对于理解三代测序技术以及如何处理三代测序数据至关重要。通过对三代测序预处理流程的深入了解，科研工作者能够更加高效地进行基因组学研究，尤其是长读长测序数据的利用。