LAS TINCIONES INTRODUCCION:
La tincin (trmino ms comn) o coloracin es una tcnica auxiliar en microscopa para mejorar el contraste en la imagen vista al microscopio. Implica agregar un colorante especfico (ADN, protenas, lpidos, carbohidratos, etc.) a un sustrato para cualificar o cuantificar la presencia de un determinado compuesto. Esto es similar al marcado fluorescente. Las tinciones y colorantes se usan con frecuencia en biologa y en medicina para destacar estructuras en tejidos biolgicos para observacin, a menudo con la ayuda de diferentes tipos de microscopios. Las tinciones pueden ser usadas para definir y examinar tejidos en bruto (resaltando, por ejemplo, fibras musculares o tejido conectivo), poblaciones celulares (clasificando diferentes clulas sanguneas) u orgnulos dentro de clulas individuales. Tinciones biolgicas son tambin usadas para marcar clulas en citometra de flujo y para marcar protenas cidos nucleicos en electroforesis en gel. En su mayor parte los microorganismos son demasiado pequeos para observarse a simple vista: protozoos, algas, hongos, bacterias y virus. La coloracin celular y tejidos son una combinacin de fenmenos fsicos y qumicos de absorcin: los fenmenos fsicos de absorcin, capilaridad y smosis participan en cierto grado. La afinidad de colorantes bsicos por los tejidos cidos y viceversa indican que hay reaccin qumica. La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad especfica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son molculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos. Ejemplos de colorantes catinicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son molculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas protenas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina cida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipdicos de la clula, usndose a menudo para revelar la localizacin de las gotculas o depsitos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudn. Algunos colorantes teirn mejor slo despus de que la clula haya sido tratada con otra sustancia qumica, que no es un colorante por s mismo.
Esta sustancia se denomina mordiente; un mordiente habitual es el cido tnco. El mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora s podr atacar el colorante. Si se desea simplemente incrementar el contraste de las clulas para la microscopa, son suficientes los procedimientos simples de tincin. El azul de metileno es un buen colorante simple que acta sobre todas las clulas bacterianas rpidamente y que no produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente til para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no celular no se tie. Tipos de Tinciones: Tincin Simple: utiliza un solo colorante. Tincin de Gram: utiliza varios colorantes (cristal violeta, Yodo, lavado con alcohol, Safranina) Tincin cido Resistente: Una vez teidos, conservan su color resistiendo al lavado con cido mineral reducido. En esta tincin las bacterias cido resistentes conservan el colorante primario color rosa o rojo, los dems microorganismos son decolorados por el cido y toman el color azul. Tincin de Giensa: el colorante se aplica a un frotis de sangre y se utiliza cuando se sospeche de protozoos en la sangre para observar materias ncleos de la clulas. Tincin de Esporas: se usa verde de malaquita en contraste con safranina. Tincin de Cpsula: colorante nigrosuna, aqu se observa microorganismos encapsulados creando resistencias. Tincin de Flagelos: se usa mordiente el cual aumenta el tamao del microorganismo. Endsporas: son unos cuerpos resistentes que se producen en el interior de la clula los cuales contienen los componentes necesarios para conservar la vida. Las esporas pueden situarse en el centro de la clula o en situaciones excntricas cerca de un extremo de la misma. Levaduras: son esfricas, elpticas y cilndricos, su tamao vara notablemente. Son hongos cuya forma corriente y dominante de crecimiento es unicelular. Las Cpsulas: son estructuras grueso viscosas gelatinosas que rodean las clulas de algunas especies.
Tincin de Ziehl Neelsen
La tincin de Ziehl-Neelsen (BAAR) es una tcnica de tincin diferencial rpida y econmica, para la identificacin de microorganismos patgenos, por ejemplo M. tuberculosis. Fue descrita por primera vez por dos mdicos alemanes, Franz Ziehl (1859 a 1926), un bacterilogo y Friedrich Neelsen (1854 a 1894), un patlogo. Fundamento Las paredes celulares de ciertos parsitos y bacterias contienen cidos grasos (cidos miclicos) de cadena larga (50 a 90 tomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloracin con alcohol-cido, despus de la tincin con colorantes bsicos. Por esto se denominan cido-alcohol resistentes. Las micobacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los parsitos coccdeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de cido-alcohol resistencia. La coloracin clsica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva solidificacin de los cidos grasos de modo que el colorante ya no puede salir de las bacterias. Por otro lado, el calentamiento aumenta la energa cintica de las molculas del colorante lo cual tambin facilita su entrada a las bacterias. Las bacterias que resisten la decoloracin son de color rojo y la que no se ven de color azul. Protocolo:
1. Colocar una gota de H20 al porta objetos
2. En condiciones escpticas colocar un asado de la cepa (extender la muestra y dejar secar) 3. Colocar un pedazo de papel filtro o papel absorbente de menor tamao que la laminilla 4. Se empapa con fucsina fenicada y se coloca la laminilla sobre una platina caliente cuando se observe desprendimiento de vapores se cuentan 5 minutos durante los cueles debe tener cuidado de que no se seque el colorante se deja enfriar 5. Se enjuaga con agua corriente (llave) 6. Se agrega alcohol cido de 2 a 3 minutos 7. Se enjuaga con agua corriente (llave) 8. Se aade azul de metileno o verde de malaquita de 1 a 2 minutos 9. Se enjuaga con agua corriente (llave ) 10.Se observa en el microscopio con el objetivo 100x
Nota:
Positivo: coloracin roja Negativo: coloracin azul o verde (depende del colorante de contrate)
Tincin de Gram
La tincin de Gram o coloracin Gram es un tipo de tincin diferencial empleado en microbiologa para la visualizacin de bacterias, sobre todo en muestras clnicas. Debe su nombre al bacterilogo dans Christian Gram, que desarroll la tcnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfologa celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximacin a la diferenciacin bacteriana, considerndose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color violeta y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa. Fundamento El cristal violeta (colorante catinico) penetra en todas las clulas bacterianas (tanto Gram positivas como Gram negativas). El lugol est formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio), el cual est presente para solubilizar el yodo. El I2 entra en las clulas y forma un complejo insoluble en solucin acuosa con el cristal violeta. La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloracin, ya que en la misma es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos s lo hacen. Para poner de manifiesto las clulas Gram negativas se utiliza una coloracin de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina. Despus de la coloracin de contraste las clulas Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen azules. La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la tcnica. Sirve para hacer una tincin de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas. Al trmino del protocolo, las Gram positivas se vern azul-violceas y las Gram negativas, se vern rosas (si no se hizo la tincin de contraste) o rojas (si se us, por ejemplo, safranina). Algunos microorganismos retienen el colorante violeta, an despus de tratarlos con un decolorante, y el color no se modifica al aadir ste; otros pierden con facilidad el primer tinte, y toman el segundo. Los que fijan el violeta, se califican de gram positivos, y los que pierden la primera coloracin y retienen la segunda, de gram negativos.
Protocolo:
1. 1.- Colocar una gota de H20 al porta objetos
2. En condiciones escpticas colocar un asado de la cepa (extender la muestra y dejar secar) 3. Se flamea colocar 1 gota de metanol (para fijar) 4. Cubrir con cristal violeta por 1 minuto 5. Se enjuaga con agua corriente (llave) 6. Se agregar logol por 1 minuto 7. Se enjuaga con agua corriente (llave) 8. Se decolorar con alcohol cetona (hasta ya no percibir rastros de cristal violeta ) 9. Se enjuaga con agua corriente (llave ) 10.Cubrir con safranina por 1minuto 11.Se enjuaga con agua corriente (llave) y escurrir 12.Se observa en el microscopio con el objetivo 100x Nota: Positivo: coloracin violeta Negativo: coloracin rosas Aqu puede ver las diferencias estructurales y qumicas de los dos tipos de pared bacteriana: Pared Gram + capa densa y uniforme de 200 a 800 A) cidos teicoicos polisacridos protenas (pocas veces) glicopptido (50% del peso seco) Pared Gram capa interna delgada de 20 a 30 A cubierta por capas externas de densidad menor) lipopolisacridos lipoprotenas
protenas
glicopptido (10% del peso seco)
Tipos de formas de bacterias:
