Transcripcin
2007 Mnica Marn Seccin Bioqumica, Facultad de Ciencias, UdelaR
Replicacin
retrotranscripcin
ADN
ARN
PROTEINAS
Traduccin
Transcripcin
ARN
ARNm (ARN mensajero) ARNt (ARN de transferencia) ARNr (ARN ribosomal)
Pequeos ARNs reguladores
Dificultad para mostrar la existencia del ARNm
ARNm (ARN mensajero) 1- 3 % del ARN total celular ARNt (ARN de transferencia) ARNr (ARN ribosomal)
ARN
ARNm es muy inestable
ARN ribosomales bacterianos 5S 16S y 23S enmascaraban al ARNm S: unidades Svedberg. se refiere a la velocidad de sedimentacin en la centrifugacin
Transcripcin: sntesis del ARN, ADN dependiente
Siempre
Requiere un molde de ADN Enzima: la ARN polimerasa Tres etapas: - Iniciacin - Elongacin - Terminacin
Transcripcin en procariotas:
Una nica ARN polimerasa Todos los promotores son reconocidos por la misma enzima Los ARNm tienen:
Extremo 5ppp (tri fosfato) Extremo 3 : estructura de un terminador o nada en particular Principal modificacin post transcripcional de los ARNm: su propia degradacin (vida media 2-3 min)
Burbuja de la transcripcin
La reaccin de polimerizacin:
Inicialmente se identific una enzima capaz de polimerizar ARN in vitro, pero sin molde!! Mas adelante se encontr la ARN polimerasa ADN dependiente:
Mg++
(NMP) n
(NMP) n+1 + PPi
los metales en la reaccin de polimerizacin
Estructura de la ARN polimerasa de E. coli
Holoenzima:
PM (kDa)
2, , , , : reconoce
promotor el
Sintetiza los 3 tipos de ARNs
ARNm ARNt ARNr
Iniciacin de la transcripcin
Requiere:
Reconocimiento de la seal especfica en el ADN que indique el inicio. Formacin del complejo cerrado en una determinada orientacin (determinacin de la hebra molde) Separacin de las hebras, (formacin del complejo abierto) Inicio de la sntesis del ARN
Promotor: seal de iniciacin de la transcripcin en el ADN
Cmo identificar y aislar los promotores? ADN purificado + ARN polimerasa + DNAsa (exonucleasa)
Inicio de la transcripcin: formacin del complejo ARNpol - promotor
Complejo Cerrado
Complejo Abierto
ADN
promotor
Elongacin
Anlisis comparativo de la secuencia de los promotores aislados ( 80 pb)
No hay una homologa de secuencia significativa entre ellas Solo hay 2 pequeas regiones mas conservadas (consenso) :
Situadas en - 10 y - 35
- 35
- 10
+1
4 elementos comunes identificados en promotores de E. coli :
+1: En 10 : En 35: una purina, G o A T80 A95 T45 A60 A50 T96 T82 T84 G78 A65 C54 A45 1
Separacin entre ambos sitios: 17
Protena de unin al ADN
Huella (Footprinting)
Localizacin de los sitios de unin de protenas en el ADN puede ser precisa
Efecto de mutaciones
Promotores fuertes y dbiles, segn cunto ARN se sintetice a partir de ellos. Los dbiles constitutivos inducibles, regulados por activadores y represores
Sobre la terminacin de la transcripcin:
No es tan exacta como la iniciacin
Hay dos formas de terminacin: independiente dependiente
Terminador
independiente
Poli A
Repetidos invertidos
Terminadores independientes del factor
Se caracterizan por : -la presencia de una regin rica en AU / AT y - la formacin de una estructura en horquilla, en el ARN recin sintetizado
Terminacin
-dependiente
Transcripcin en clulas eucariotas
3 ARN polimerasas que dan diferentes productos: ARN pol I : ARN r ARN pol II : ARNm ARN pol III : ARN pequeos: ARNr 5S y ARNt Con diferente sensibilidad a la alfa amanitina Importante procesamiento de los transcriptos modificaciones post transcripcionales
Alfa-amanitina: inhibidor diferencial de ARN polimerasas eucariotas
amanita
Otros inhibidores de la transcripcin
Cordicepina
Actinomicina D
Principales modificaciones postranscripcionales en el ARNm de clulas eucariotas En los ARNm :
En el extremo 5 En el extremo 3 Eliminacin de intrones
Modificacin del extremo 5 del ARNm en eucariotas
Trifosfato 7 metil guanosina
7mG
Modificacin del extremo 3 del ARNm en eucariotas
ADN
AATAAA TTATTT AAUAAA AAUAAA
(poliA-polimerasa) 3 (endonucleasa)
ARNm 5
AAUAAA
AAAAAAAAAAAA....A
3: poliadenilacin en eucariotas
Factor specificidad de clivaje, CPSF Activador de clivaje, Cstf CTD, dominio C terminal
Poliadenilacin del ARNm en eucariotas
PAP (pA polimerasa)
poliA binding proteins
ARN
200 adeninas en cola poli A
Y la terminacin de la transcripcin? 2 modelos:
1) Extremo 5 sin cap desestabiliza el complejo ADN- ARNp 2) La disociacin de los factores de poliadenilacin del CTD (ARNp) favorecen la disociacin.
Procesamiento de ARNr y ARNt
El ~1% del genoma de E. coli codifica para estos ARNs, pero constituyen el 99% del ARN total de la bacteria Ambos se transcriben como transcriptos largos (pre-ARNr)
Estructura de un transcripto pre-ARNr en E. coli
RNasa III libera los ARNr 16S y 23 S
Procesamiento postranscripcional del ARNt Tyr
Ribonucleasa P : una ribozima
Crea el extremo 5 de los tRNAs Su estructura consiste en: Una molcula de ARN de 377 nt Una cadena polipeptdica de 20 kDa Ambos componentes son necesarios para una actividad cataltica completa En condiciones no fisiolgicas el ARN puede cortar esas secuencias con precisin.
Intrones y exones
Experimentos de hibridacin ADN / ARNm analizados por microscopa electrnica
Ovoalbmina de pollo protena: 386 aa gen: 7700 pb
Intrones y exones de la hemoglobina
Cmo se eliminan los intrones sin alterar las secuencias codificantes?
Cules son las seales en los cidos nucleicos, en el ARN, que indican los lmites de los intrones? cul es el mecanismo que lo asegura?
Intrones del Grupo II Intrones procesados por el espliceosoma
ramificacin
Spliceosoma
150 protenas (snRNP y proteinas) 5 ARNs (snRNAs)
Complejo temprano
Corte y empalme alternativo
Sub-grupo de exones es conservado en la maduracin del ARNm, los otros son procesados como si fueran intrones.
7 formas de la -tropomiosina (rata)
(sistema contrctil de diversos tipos celulares)
RESUMEN Modificaciones en los ARNm eucariotas:
En eucariotas: Iniciacin de la transcripcin por la ARNpol II
Para la sntesis de ARNm y algunos snRNAs Las 12 subunidades de la ARNpol II son insuficientes para iniciar la transcripcin Se necesitan al menos 5 factores adicionales: TFIID, TFIIA, TFIIB, TFIIF, TFIIE, TFIIH (expresin basal) Participan otros factores para regular la transcripcin
Complejo mnimo de iniciacin de la transcripcin en eucariotas (expresin basal)
Factor subunidades kDa
Estructura de un promotor eucariota
Potenciador
GC
CAAT
-100
-80
-20
+1
Iniciacin de la transcripcin por la ARNpol II en eucariotas
TBP+TAF=TFIID CTD: dominio Ctl de una subunidad de la ARNpol II
CTD es fosforilado
