Toxicon 43 (2004) 303310

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Principales alcaloides de la rana Brasilea Dendrobatidae Epipedobates flavopictus: 251D pumiliotoxina, histrionicotoxina y decahidroquinolinas
Mrcia Renata Mortaria, Elisabeth N. Ferroni Schwartza,*, Carlos Alberto Schwartza, Osmindo Rodrigues Pires Jr.a, Marcello Moreira Santosb, Carlos Bloch Jr.c, Antonio Sebbena
Laboratorio Toxicologa del Departamento de Ciencias Fisiolgicas, Instituto de Ciencias Biolgicas, Universidad de Brasilia, Campus Universitario, Brasilia, DF 70910-900, Brasil Instituto de Qumica, Universidad de Brasilia, Brasilia, DF 70910-900, Brasil Laboratorio de espectrometra de Massa, EMBRAPA-CENARGEN, PO BOX 02372, Brasilia, DF, Brasil Recibido el 2 de diciembre del 2003; revisado 26 de diciembre del 2003, aceptado 06 de enero 2004.

Resumen Flavopictus Epipedobates, Dendrobatidae, es una pequea rana aposemtica en Brasil Cerrado bioma. En el presente trabajo, hemos aislado y caracterizado qumicamente los alcaloides ms abundantes en el extracto cutneo extracto de E. flavopictus. Las muestras se recogieron en Pirenpolis (Goia, Brasil), su piel fue retirada y se extraida con metanol, y se present a la purificacin por HPLC y la identificacin por cromatografa de gases y espectrometra de masas. Pumiliotoxin 251D, histrionicotoxin 285 Da y dos decahidroquinolinas, 219A y 243a, fueron identificados. La 251D pumiliotoxin fue probada en la rana aislado nervio citico y el msculo leon aislado de cobayo. La 251D pumiliotoxin reducido ligeramente la amplitud de los potenciales de accin de la rana del nervio citico. La piel extracto crudo de E. flavopictus y la 251D pumiliotoxin produce contracciones rtmicas y aumento de la tensin muscular en el leon aislado de cobaya. 2004 Elsevier Palabras clave: flavopictus Decahydroquinoline Ltd. Epipedobates; Todos Dendrobatidae; los alcaloides; derechos Pumiliotoxin; reservados. Histrionicotoxin;

1. Introduccin La piel de los anfibios es una morfolgica, bioqumica y fisiolgicamente un rgano complejo que cumple muchas funciones importante para la supervivencia de los animales, tales como la respiracin, regulacin del agua , la excrecin, control de temperatura, la reproduccin, camuflaje, as como, anti- depredadores, anti-microbiano, y defensa anti-hongos. Las glndulas de la piel de anfibios granulares son el sitio de la sntesis de una amplia gama de compuestos qumicos cuyas categoras principales son las aminas bigenas, esteroides, alcaloides y pptidos (protenas incluidas) (Clarke, 1997).
* Autor correspondiente. Tel.: 55-61-307-2160; fax: 55-61274-1251.E-mail address: [email protected] (E.N.F. Schwartz). 0041-0101/$ - see front matter q 2004 Elsevier Ltd. All rights reserved. doi:10.1016/j.toxicon.2004.01.001

Los alcaloides son compuestos de base, generalmente con nitrgeno presente en un anillo, y tienen una distribucin restringida en la naturaleza, principalmente de origen vegetal (Pelletier, 1983 citado en Daly et al. (1987)). Ms de 500 alcaloides de 22 diferentes clases estructurales se han detectado en la piel de varios gneros de diferentes familias de ranas y sapos (Daly et al., 2002). Estos alcaloides se consideraron inicialmente como 'Dendrobatidae alcaloides " porque se pensaba que eran sintetizados por estas ranas. Sin embargo, cuando se cran en cautiverio, ranas dendrobtidos no tena alcaloides detectables en su piel. Ahora parece que estos alcaloides son de origen alimentario (Daly et al, 1994a;. Daly, 1998), que para las ranas como consta de artrpodos. Estos incluyen los alcaloides batrachotoxins, que son activadores potentes y selectivos canales de sodio dependientes de voltaje, el histrionicotoxins

(HTXs), que son potentes bloqueadores no competitivos de los receptores nicotnicos de los canales dependientes, la pumiliotoxins (PTX) y derivados relacionados, que realizan actividades de miotnica y cardiotnico, debido a efectos sobre los canales de sodio y calcio, y epibatidina, que tiene una potente actividad antinociceptiva por agonista actividad en los receptores nicotnicos. Otras clases de alcaloides de la piel de los anfibios son pirrolidinas y piperidinas, decahidroquinolinas (DHQs), pyrrolizidines, indolizidines diferentes, quinolizidines y gephyrotoxins tricclicos, pirrolizidin oximas, pseudophrynamines, coccinellines, y cyclopentaquinolizidines (Daly, 1998). En el presente trabajo, hemos aislado y caracterizado qumicamente los alcaloides ms abundantes del extracto cutaneo de flavopictus Epipedobates, y hecho unos estudios preliminares farmacolgicos con una fraccin del alcaloide que se obtiene. 2. Materiales y mtodos 2.1. Los animales y la extraccin de alcaloides Cincuenta y cinco ejemplares adultos de E.flavopictus se recogidos en Pirenpolis, Goia, Brasil. Para obtener extractos de la piel fresca, los animales fueron lavados cuidadosamente en agua y despus de la destruccin del sistema nervioso de la piel fueron retiradas. Las pieles se pesaron entonces, cortando en pedazos ms pequeos y sometidos a tres extracciones en metanol. Las extracciones combinadas se filtraron y se concentr a presin reducida y se conservar congelada (-22 C) para su utilizacin posterior. 2.2. Ensayo de letalidad Ratones: (20.0 +-1.0g) se utilizaron para determinar la letalidad de la piel E. flavopictus extracto. E. flavopictus extracto de piel (12,5 a 100,0 mg) se disolvi en 200 ml de solucin salina (0,9% NaCl) y se inyecta i.p. en ratones, n = 5 para cada dosis. El nmero de animales muertos se determin despus de 24 hr la LD50 aproximado se calcula mediante el anlisis probit (Finney, 1971). 2.3. Alcaloides de purificacin El extracto crudo de la piel fue semi-purificada por una modificacin de Daly et al. (1987, 1992). En resumen, el extracto de metanol fue diluido con un volumen igual de agua. El metanol acuoso se extrajo tres veces, cada tiempo con igual volumen de cloroformo. El combinado de extractos de cloroformo se concentraron al vaco para que se aada el mismo volumen de n-hexano. El combinado extracto, nhexane/cloroformo, se extrajo tres veces con igual volumen de 0,1 N HCl. La combinacin de HCl 0,1 N

fracciones se ajustaron a pH 9 con 1N acuosa de amoniaco seguida por la re-extraccin en cloroformo tres veces, cada tiempo con un volumen igual de cloroformo. El combinado capas de cloroformo se seca sobre sulfato de sodio anhidro y despus se evapora al vaco hasta sequedad. Los residuos resultantes de alcaloide fueron disueltos en metanol, para qu 100 ml correspondi a 100 mg del peso original de las pieles. Esta fraccin de alcaloides se carg en una fase inversa CLC-SAO Shimpack ( 6.0 *150 mm Shimadzu, Japan)) en virtud de un gradiente de acetonitrilo desde 0 hasta 100% en 60 minutos a una velocidad de flujo de 1 ml /min. El eluyente fue monitoreada por absorbancia UV a 224 nm y se recogieron fracciones y se extrajo tres veces en cloroformo. El combinado de extractos de cloroformo se secaron en N2 y analizados por la cromatografa de gases y espectrometra de masas. Cromatografa de gases Los anlisis se llevaron a cabo con las fracciones de alcaloides en una columna OV-2 (30 m, 5 fenilsiloxane%). La columna se program 100-2508 a las 10 8C por minuto con una caudal de 20-25 cm3/min de nitrgeno. Las fracciones tambin se analizaron por espectrometra de masas MALDI-TOF con un Voyager-DE STR (PerSeptive Biosystems). Las muestras de 1 ml de cada fraccin se mezclaron con 3 ml de una solucin saturada de cido a-ciano-hidroxicinmicos. Las muestras se cristalizaron a temperatura ambiente, y sus masas analizadas bajo las siguientes condiciones: acelerar la tensin de 20 kV, el lser fija en 1850 mJ/cm2, el retraso de 100 ns y en el reflector modo monoisotpico. 2.4. Ensayo neurotxicos ('single sacarosa-gap ") Las muestras utilizadas en los experimentos electrofisiolgicos se prepararon en forma adecuada de la siguiente manera. Solucin de Ringer contiene en mM: NaCl 111, KCl 1.9, CaCl2 1.1, NaHCO3 2.4, pH 7,2 ajustado con el CO2. Potencial de accin compuesto (AP) de la rana (Rana catesbeiana) del nervio citico se grabo con una tcnica modificada de sacarosa sola brecha (Strong et al., 1973). Los experimentos se llevaron a cabo en temperatura ambiente (24-28 8C). Registros experimentales en comparacin con los registros de control del manejo de nervios en las mismas condiciones para la prueba. Los promedios de un mnimo de cinco experimentos se muestran. 2.5. Suave ensayo muscular Cerdos de Indias hombre (Cavia porcellus) fueron privados de alimentos durante 24 horas y asesinados por lesin cervical seguida de decapitacin. Segmentos que contienen 3-4 cm del extremo distal del leon fueron utilizados. Despus de que el contenido intraluminal se enrojeciera, los segmentos leon se suspendieron en 10 ml de baos gaseosas en

solucin de Tyrode (en milmetros: NaCl 137, KCl 3, CaCl2 2, MgCl2 6H2O 1, NaHCO3 12, glucosa 6, NaH2PO4 0,4, pH 7.0) mantuvo a los 32 8C. Los segmentos de leon se equilibraron por 60 min. Respuestas musculares isomtricas se registraron en un Narco polgrafo con transductores de fuerza Narco (modelo F-60). Extracto de piel y pumiliotoxin respuestas 251D se obtuvieron en forma no acumulativa de los segmentos ileales. La acetilcolina (1028 M de concentracin final) se utiliz (Sigma, St Louis, MO) . 304 M. Mortari R. et al. / Toxicon 43 (2004) 303-310 3. Resultados 3.1. Ensayo de letalidad La DL50 del extracto de la piel E. flavopictus se determina como 45,7 mg de piel fresca por ratn (2,28 g / kg), y la LD100 fue equivalente a 75,0 mg de la piel fresca por ratn. 3.2. Alcaloides de purificacin El procedimiento de purificacin de la piel de E.flavopictus por extraccin por HPLC en fase inversa dando lugar a la separacin de cuatro fracciones principales (Fig. 1). Estas fracciones de elucin fueron probadas por un solo sacarosa-brecha con nervio citico de rana y por el leon de cobayo al bioensayo neurotxicos y actividades miotxicos, respectivamente. Adems, estas cuatro fracciones fueron analizadas por cromatografa de gases y la espectrometra de masa. La cromatografa de gases (fig. 2a) y la espectrometra de masas (Fig. 2b) los perfiles de la fraccin de una muestra un pico de alcaloide con un peso molecular de 251 Da (fragmento iones de patrn en m = z 236, 208, 194, 178, 166, 150, 137, 122, 105, 84, 70, 55) identificado como 251D pumiliotoxin sobre la base de trabajos previos publicados por Daly et al. (1980) y Daly y Spande (1986). GC y MS perfiles de la fraccin 1 tambin mostr phtalats como contaminantes, probables del almacenamiento tubos (Spande et al., 1992a). El anlisis de la fraccin 2 (Fig. 3) revel la presencia de principal alcaloide con un peso molecular de 285 Da

(fragmento iones de patrn en m = z 284, 233, 218, 204, 190, 162, 148, 134, 96, 73, 45) sugiere 285A HTX sugiriendo. Las figuras. 4 y 5 mostrar el resultado de la ocurrencia de 219A DHQs (ms abundantes fragmento de iones en m = z 202) y 243a (fragmento ms abundante iones en m = z 178), respectivamente, en el extracto de piel de E. flavopictus; el componente de la masa principal de los cuales fraccin se masa confirmada por MALDITOF espectrometra (datos no muestrados). 3.3. Ensayo neurotxicos (solo sacarosa-GAP) La fraccin 1 (equivalente a 222 mg de una piel fresca / ml) tomando medidas para reducir ligeramente la amplitud de puntos de acceso cuando se aplica en los nervios rana (Fig. 6A). Este efecto se revirti parcialmente por aclarar. 3.4. Suave ensayo muscular El extracto de piel cruda de flavopictus E. (datos no mostrados) y la fraccin 1 (equivalente a 0,5 mg de piel fresca / ml) produce la contraccin rtmica y el aumento muscular tensin en los segmentos de leon de cobayo (Fig. 6B). Estos efectos son totalmente reversibles despus de enjuagar la preparacin. 4. Discusin Dendrobatidae es una familia de anuros neotropicales, que est dividido en nueve gneros: Aromobates, Colosthetus, Cryptophyllobates, Mannophryne, Nephelobates, Allobates, Epipedobates, Dendrobates (Minyobates) y Phyllobates (Frost, 2002). En conjunto, los ltimos cuatro gneros son un nico linaje evolutivo de veneno ranas dardos caracteriza por la coloracin de advertencia brillante y alcaloides defensivos piel (Caldwell, 1996; Summers y Clough, 2001). Hay indicios de que la toxicidad y la coloracin han evolucionado a la par de este veneno de la familia de ranas. Esta correlacin es consistente con la evolucin de la hiptesis de aposematism como una explicacin para el la evolucin de la coloracin brillante de esta familia (Summers y Clough, 2001).

Fig. 1. perfil Cromatograma de extracto de piel de flavopictus E. exhibiendo cuatro fracciones principales. HPLC condiciones: la columna de fase inversa (6.0* 150 mm); gradiente de acetonitrilo 000 a 100% en 60 minutos a una velocidad de flujo de 1 ml / min, controlado por absorbencia UV a 224 nm.

Fig. 2. cromatografa de gas (A) y la espectrometra de masas (B) los perfiles de la fraccin 1 que muestra un pico de alcaloide con un peso molecular de 251 Da (Patrn de fragmentos de iones en m = z 236, 208, 194, 178, 166, 150, 137, 122, 105, 84, 70, 55), lo que sugiere la ocurrencia de PTX 215D.

Fig. 3. Fraccin 2 cromatograma de gases (A) y espectrograma de masas (B) que revela un alcaloide principal, con peso molecular de Da 285A (iones fragmento m = z patrn de 284, 233, 218, 204, 190, 162, 148, 134, 96, 73, 45), lo que sugiere la ocurrencia de un histrionicotoxin. a saber, Mantella de la familia de Madagascar Mantellidae

Fig. 4. Fraccin 3 de gas cromatograma (A) y espectrograma de masas (B) que revela un fragmento de iones principales en m = z 179, lo que sugiere la presencia de 219A decahydroquinoline.

Esta toxicidad en la familia Dendrobatide est relacionado con la presencia de alcaloides especficos. Algunos de estos alcaloides son altamente txicos, como el batrachotoxins, y la PTX allopumiliotoxins (aPTXs), y epibatidina, mientras que otros, por ejemplo, el DHQs, el HTXs y izidines,

tienen baja toxicidad, pero probablemente todava funcionan como obstculo para los depredadores debido a los efectos amargo y desagradable de la cavidad bucal (Myers y Daly, 1976;. Myers et al, 1978). Dendrobatidae alcaloides se sabe ahora que existe en las familias de anuros otro.

Fig. 5. Fraccin de 4 cromatograma de gases (A) y espectrograma de masas (B) que revela un fragmento de iones principales en m = z 202, lo que sugiere la presencia de 243a decahydroquinoline.

Fig. 6. (A)

citico, y las contracciones rtmicas y un aumento de la tensin muscular en Guinea aislados cerdo leon. Mensah-Dwumah y Daly (1968) han demostrado la pumiliotoxin-Una clase, pumiliotoxin B, causada dependiente de la dosis contracciones rtmicas y movimientos peristlticos en los segmentos de leon que fueron bloqueados por la tetrodotoxina. La PTX demostr tener actividad cardiotnico y miotnica debido al parecer a los efectos estimulantes de canales de sodio funcin, con un aumento simultneo en la movilizacin de Ca2 de sitios extracelulares e intracelulares(Albuquerque et al, 1981;. Gusovsky et al, 1988).. 251D Pumiliotoxin fue asignado a la pumiliotoxin-A clase que se describieron por primera vez en Dendrobates pumilio en A mediados de los aos 1960 (Daly y Myers, 1967). PTX-Una clase de alcaloides, incluyendo PTX 251D, est ampliamente distribuido en Dendrobates y 251D fue detectado como un rastro de alcaloides en aurotaenia Phyllobates (Daly et al., 1987). PTX 251D Tambin se ha encontrado en las especies Epipedobates, tales como E. espinosai y silverstonei E. y como alcaloide principal en E. tricolor, y de especies Minyobates, bombetes M., claudiae M. minutus M., M.steyermarki (Daly et al., 1987). La fraccin mayor, llamada fraccin 2, fue identificado por cromatografa de gases y espectrometra de masas como HTX-clase alcaloide de 285 285A Da sugiriendo. Este HTX es un muy alcaloide comn en la piel dedrobatid, y por lo general se produce con 283A y 285C, que son difciles de separar (Daly et al., 1987). HTXs se aisl por primera vez Dendrobates histrionicus (Daly et al., 1971) y como una clase se caracteriza por masas de iones fragmento del espectro de m = z 96 (C6H10N) (Daly y Spande, 1986) y 218 y 162 (Spande et al., 1992a). Fracciones 3 y 4 fueron identificados como DHQs 219A y 243a, respectivamente, aunque 219A DHQs y 243a han cis y trans-isoformas, slo un anlisis de RMN puede determinar qu ismero ocurre en flavopictus E.. DHQs son relativamente alcaloides txicos nombrado por terminologa ms antigua como "pumiliotoxin C" (Daly et al., 1969 citado en Daly et al. 1987). Algunos de estos alcaloides, incluyendo C pumiliotoxin, muestran un espectro de masas con un ion padre muy pequeo y un de iones nicos fragmentos importantes en m = z 152 (C10H18N). Otros, como 219A y 243a tambin bicclico aminas secundarias, pero el rendimiento de iones fragmento importante en m = z 178 y 202, respectivamente, en lugar de a m = z 152 (Daly et al., 1987). Hay muchas evidencias de que estos alcaloides no son relacionados con factores genticos, pero que

"sola sacarosa -brecha" con la rana (Rana catesbeiana) del nervio citico. Efecto despus de la aplicacin de la fraccin 1 (equivalente a 222 mg de una piel fresca / ml) mostr una ligera reduccin en los puntos de acceso ' amplitud. (B) cuya preparacin del leon en respuesta a (a) Acetilcolina 1.028 M, (b) Fraccin 1 (equivalente a 0,5 mg fresca piel / ml). Los efectos son totalmente reversibles despus del lavado (W) de la de preparacin.

(Garraffo et al, 1993a;.. Daly et al, 1996), en Sur Amrica Melanophryniscus de la familia Bufonidae (Garraffo et al., 1993b) y el australiano Pseudophryne de la familia Myobatrachidae (Daly et al., 1990). No pocos trabajos sobre la composicin de la piel del gnero Epipedobates. Spande y colaboradores (1992a, b) epibatidina aislado de el veneno de la rana Epipedobates tricolor ecuatoriana, que es un analgsico muy potente con el mecanismo no opioide de accin (Badio y Daly, 1994). El extracto de piel de flavopictus E. mostr una alta toxicidad (LD100 de 75.0 mg de piel fresca) en comparacin con otros dendrobtidos como Dendrobates auratus (60-100 mg piel), D. granuliferus (60 mg de la piel), y D. pumilio (60 mg piel) (Daly et al., 1978). Los sntomas observados despus de i.p. administracin en los ratones fueron trastornos respiratorios, del aparato locomotor deterioro, convulsiones intensa, postracin, salivacin, piloereccin y la muerte despus de 5-12 minutos, similar a los que se encuentran para Dendrobates en Daly et al. (1978). En el presente trabajo se estudi el principal alcaloide fracciones obtenidas de HPLC. La fraccin 1 fue identificado por cromatografa de gases y espectrometra de masas como PTX 251D. Este alcaloide producido una ligera reduccin en los puntos de acceso la amplitud de la rana del nervio

son de origen alimentario, que para ranas como consta de los artrpodos. Dendrobates auratus criados en jaulas al aire libre y alimentados con los artrpodos que se encuentran en la hoja camada fueron capaces de acumular las toxinas en su piel, las ranas criados en moscas de la fruta no se (Daly et al., 1992). Un investigacin sobre pequeos artrpodos colectados en diferentes sitios en una isla panamea, demostr que estos mixtos colecciones de artrpodos que figura PTX 307A, 323B alloPTX, un indolizidine 5,8-disustituidos (205A o 235B), y DHQ 195A (Daly et al., 2002). En un artculo reciente elegante, iso223F DHQ y PTX (TH) - 251D se alimenta a las ranas veneno de los gneros dendrobtidos Dendrobates, Epipedobates y Phyllobates. Los dos alcaloides se acumulan en la piel sin cambios, excepto para las tres especies de Dendrobates, donde aproximadamente el 80% de la acumulacin de PTX (TH)-251D fue estereoselectivamente hidroxilados de APTX (TH)-267A. Estos datos condujeron a la evidencia para el desarrollo evolutivo de un linaje de ranas dendrobtidos de un pumiliotoxin enantioselectiva 7 - hidroxilasa que convierte una txicos PTX (TH)-251D a una ms txicos APTX (TH)267A (Daly et al., 2003). Especializacin en una dieta que consiste principalmente de Myrmicinae hormigas parece ser un factor clave en la evolucin, de alcaloide el secuestro, ya que las hormigas no representan una parte importante de la dieta de algunas ranas dendrobtidos. Las ranas del gnero Dendrobates, cuyas especies contienen alcaloides, que figura 50 a 73% hormigas en los anlisis de estmago, mientras que el gnero no txico Colostethus se encontr que contena de 12 a 16% de las hormigas (Caldwell, 1996). Sin embargo, Colostethus talamancae y C. alimentacin inguinal con una mezcla de 5,8disustituidos Indolizidine 209B, 195A y decahydroquinoline HTX 285C durante 5 semanas no se acumul alcaloides en la piel (Daly et al., 1994b). Las hormigas compuesto por slo el 12% del volumen de presas en E. flavopictus, un patrn similar al de la Amazona no venenosas especies en cuyo elemento principal es la dieta las termitas (Biavati, Wiederhecker y Colli, comunicacin personal). Todos los estudios realizados con la dieta han dendrobtidos ha hecho en las especies tropicales de la selva tropical E.flavopictus que se encuentran en diferentes regiones del Cerrado de Brasil, que habitan en ambientes rocosos cerca de los ros (Haddad y Martins, 1994). Es posible que las termitas pueden constituir un supuesto fuente de alcaloides en este entorno. Es evidente que la fuente diettica de alcaloides y la relacin entre el consumo y la toxicidad siguen siendo los reto para la investigacin adicional.

Agradecimientos Este estudio fue apoyado por FUNDAC Un ~ o Universidad de Brasilia. Los autores agradecen al Departamento de la Polica Federal de Bras'lia (DF) para el uso de la GC-MS. Referencias Albuquerque, EX, Warnich, Melaque JE, MA, Kauffman, FC, Tamburini, R., Nimit, Y., Daly, J.W. de 1981. La farmacologa de pumiliotoxin-B. I. La interaccin con sitios de calcio en la retculo sarcoplsmico del msculo esqueltico. Mol. Pharmacol. 19, 411-424. Badio, B. Daly, J.W. de 1994. Epibatidina, un analgsico potente y agonista nicotnico. Mol. Pharmacol. 45 (4), 563-569. Caldwell, J.P. de 1996. La evolucin de myrmecophagy y es correlatos en ranas venenosas (familia Dendrobatidae). J. Zool. Soc. Lond. 240, 75101. Clarke, B.T. de 1997. La historia natural de la piel de los anfibios secreciones, su funcionamiento normal y potencial mdico aplicaciones. Biol. Rev. 72, 365-379. Daly, J.W. de 1998. Treinta aos del descubrimiento de los alcaloides de artrpodos en piel de los anfibios. J. Nat. Prod. 61, 162-172. Daly, J.W., Myers, C.W. de 1967. La toxicidad del veneno de Panam rana (Dendrobates): algunos aspectos biolgicos y qumicos. Ciencia 156, 970. Daly, J.W., Spande, T.F. de 1986. En: Pelletier, S.W., (Ed.), La qumica, la farmacologa y la biologa de alcaloides de la anfibios, Alcaloides: Qumica Biolgica y perspectivas, vol. 4. Wiley, New York,p. 1. Daly, JW, Tokuyama, T., Habermehl, G., Karle, IL, Witkop, B., 1969. Froschgifte. Isolierung und von struktur pumiliotoxin C. Justo Liebigs Ann. Chem. 729, 198. Daly, JW, Karle, I., Myers, CW, Tokuyama, T., Agua, JA, Witkop, B., 1971. Histrionicotoxins: anlisis de rayos Roentgen de la novela y alnico spiroalkaloids acetilnicos aislado de un rana colombiana, histrionicus Dendrobates. Proc. Natl Acad. Ciencia. EE.UU. 68, 1870. Daly, JW, Brown, GB, Mensah-Dwumah, M. Myers, CW, 1978. Clasificacin de los alcaloides de la piel de poisondart neotropicales ranas (Dendrobatidae). Toxicon 16, 163-188. Daly, JW, Tokuyama, T., Fujiwara, T., Highet, RJ, LL Karle, 1980. Una nueva clase de alcaloides indolizidine del veneno de rana Dendrobates tricolor. X-ray anlisis de 8-hidroxi-8-metil-6- 92metilo (hexylidene)-1-azabiciclo [4,3,0] nonano. J. Am. Chem. Soc. 102, 830-836. Daly, J.W., Myers, C.W., Whittaker, N., 1987. clasificacin ms de los alcaloides de la piel de ranas venenosas neotropicales (Dendrobatidae), con un estudio general de sustancias txicas nocivas

en el anfibios. Toxicon 25 (10), 1023-1095. Daly, JW, Garraffo, HM, Pannell, LK, Spande, TF, 1990. Alcaloides de ranas australianas (Myobatrachidae): pseudophrynamines y pumiliotoxins. J. Nat. Prod. 53, 407-421. Daly, JW, Secunda, SI, Garraffo, HM, Spande, TF, Wisnieski, A., Nishihira, C., Cubierta, J.F. de 1992. La variabilidad en alcaloides perfiles de ranas venenosas neotropicales (Dendrobatidae): gentica frente a los determinantes ambientales. Toxicon 30 (8), 887-898. Daly, JW, Garraffo, HM, Spande, TF, Jaramillo, C., Rand, S., 1994a. La dieta fuente de alcaloides de la piel de ranas venenosas (Dendrobatidae)? J. Chem. Ecol. 20, 943-955. Daly, JW, Secunda, SI, Garraffo, HM, Spande, TF, Wisnieski, A., Cubierta, J.F., 1994b. Un sistema de captacin de alcaloides en la dieta ranas venenosas (Dendrobatidae). Toxicon 32 (6), 657-663. Daly, JW, Andriamaharavo, NR, Andriantsiferana, M. Myers, C.W. de 1996. Madagascar, las ranas venenosas (Mantella) y su piel alcaloides. De la maana. Mus. Novitates 3177, 1-34. Daly, JW, Kaneko, T., Wilham, J., Garraffo, HM, Spande, TF, Espinosa, A. Donnelly, MA, 2002. Alcaloides bioactivos de la rana piel: bioprospeccin combinatoria revela que pumiliotoxins tener una fuente de artrpodos. Proc. Natl Acad. Ciencia. EE.UU. 99 (22), 13996-14001. Daly, JW, Garraffo, HM, Spande, TF, Clark, VC, Ma, J., Ziffer, H., Cubierta, J. F. Jr., 2003. Evidencia de un enantioselectiva pumiliotoxin 7-hidroxilasa en las ranas veneno de la dendrobtidos Dendrobates gnero. Proc. Natl Acad. Ciencia. EE.UU. 100 (19), 11092-11097. Finney, D.J. de 1971. Anlisis Probit, tercera ed., La Universidad de Cambridge Press, Cambridge, Reino Unido, 368pp. Frost, D.R. de 2002. Especies de anfibios del mundo: una en lnea de referencia. V2.21 (15 de julio de 2002). Base de datos electrnica disponible en http://research.amnh.org/herpetology/amphibia/in dex.html. Consultado el 02 de noviembre 2003. Garraffo, HM, Cceres, J. Daly, JW, Spande, TF, Andriamaharavo, N.R., Andriantsiferana, M., 1993. Alcaloides en M. R. Mortari et al. / Toxicon 43 (2004) 303-310 309 Ranas de Madagascar (Mantella): pumiliotoxins, indolizidines, quinolizidines y pyrrolizidines. J. Nat. Prod. 56, 1016-1038. Garraffo, HM, Spande, TF, Daly, JW, Baldessari, Gros, A., Por ejemplo, 1993b. Alcaloides de sapos bufonid (Melanophryniscus): decahidroquinolinas, pumiliotoxins y homopumiliotoxins, indolizidines, pyrrolizidines y quinolizidines. J. Nat. Prod. 56, 357-373. Gusovsky, F., Rossignol, DP, McNeal, ET, Daly, JW, 1988. Pumiliotoxin B se une a un sitio en el sodio dependientes de voltaje canal que se

alostricamente junto a otros sitios de unin. Proc. Natl Acad. Ciencia. EE.UU. 85, 1272-1276. Haddad, C.F.B., Martins, M., 1994. Cuatro especies de Brasil ranas venenosas relacionados con Epipedobates pictus (Dendrobatidae): taxonoma y observaciones de historia natural. Herpetologica 50 (3), 282-295. Mensah-Dwumah, M. Daly, J.W. de 1968. Farmacolgica de alcaloides de ranas venenosas (Dendrobatidae). Toxicon 16, 189-194. Myers, C.W., Daly, J.W. de 1976. Evaluacin preliminar de la piel toxinas y vocalizaciones en los estudios taxonmicos y evolutivos de ranas venenosas (Dendrobatidae). Toro. De la maana. Mus. Nat. Hist. 157, 173-262. Myers, C.W., Daly, Malkin J.W., B., 1978.Un peligrosamente txicos rana nueva (Phyllobates) utilizado por los indgenas Embera 'del oeste Colombia, con la discusin de la fabricacin de cerbatanas y dardos envenenamiento. Toro. De la maana. Mus. Nat. Hist. 161, 307-366. Pelletier, S.W. de 1983. En: Pelletier, S.W., (Ed.), La naturaleza y el definicin de un alcaloide, Alcaloides: Qumica y Biolgica Perspectivas, vol. 1. Wiley, New York, p. 1. Spande, T.F., Garraffo, H.M., Daly, J.W., 1992a. Identificacin de histrionicotoxins por GC-MS y GC-FTIR: de fotos y productos qumicos artefactos y revisado las asignaciones de RMN de13C. Tetraedro 48 (10), 1823-1836. Spande, TF, Garraffo, HM, Edwards, microondas, Yeh, HJC, Pannell, L. Daly, J.W., 1992b. Epibatidina: una novela (Chloropyridyl)-azabicycloheptane con potentes analgsicos actividad de una rana venenosa de Ecuador. J. Am. Chem. Soc. 114, 3475-3478. Strong, P.N., Smith, J.T., Keana, J.F.W. de 1973. Un cmodo bioensayo para la deteccin de concentraciones nanomolares de la tetrodotoxina. Toxicon 11, 433-438. Summers, K., Clough, M.E. de 2001. La evolucin de la coloracin y toxicidad en la familia rana venenosa (Dendrobatidae). Proc. Natl Acad. Ciencia. EE.UU. 98 (11), 6227-6232. 310 M. Mortari R. et al. / Toxicon 43 (2004) 303-310