FORMULACIN DE AGARES

INSTITUTO TECNOLOGICO SUPERIOR DE SAN MARTIN TEXMELUCA

INGENIERIA AMBIENTAL MICROBIOLOGIA FORMULACION DE AGARES JOSE ANTONIO LEDEZMA CORTES 11060039 14 DE FEBRERO 2013

Jos Antonio Ledezma Cortes

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FORMULACIN DE AGARES EL AGAR BILIS Y ROJO VIOLETA

USO
El Agar Bilis y Rojo Violeta es un medio utilizado para la deteccin y recuento de organismos coliformes en Agua, leche y otros materiales de importancia sanitaria. EXPLICACION El Agar Bilis y Rojo Violeta es utilizado como uno de los procedimientos para llevar a cabo la deteccin, enumeracin e identificacin presuntiva de microorganismos coliformes. En este medio las colonias de coliformes presentan una morfologa tpica que permite su identificacin presuntiva y que debe ser confirmada mediante reacciones bioqumicas. En este medio, la peptona provee la fuente de carbono y nitrgeno necesaria para el desarrollo de los microorganismos. El extracto de levadura provee vitaminas del complejo B para estimular el crecimiento. Las sales biliares y el cristal violeta actan como inhibidores de microorganismos Gram positivos. La lactosa es la fuente de carbohidratos y el rojo neutro acta como indicador para evidenciar el cambio de pH como consecuencia de la fermentacin de la lactosa. El Agar acta como agente solidificante.

FORMULA
Extracto de Levadura 3.0 Peptona de Gelatina 7.0 Mezcla de Sales Biliares 1.5 Lactosa 10.0 Cloruro de Sodio 5.0 Rojo Neutro 0.03 Cristal Violeta 0.002 Agar Bacteriolgico 15.0 pH final 7.4 0.2

PREPARACION
Suspender 41.5g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con agitacin suave hasta su completa disolucin y hervir durante un minuto. Enfriar a una temperatura entre 45-50C. No sobrecalentar. Procedimiento: 1. Seguir las recomendaciones apropiadas para la toma y procesamiento de las muestras. 2. Colocar una alcuota de 1.0 mL de la muestra en una placa de Petri estril. 3. Adicionar 10 mL del medio enfriado a una temperatura de 45-50C y mezclar suavemente. 4. Dejar solidificar el medio e incubar a 35-37C por 18 a 24 horas. Se recomienda la incubacin a 32C para muestras de productos lcteos. 5. Examinar las colonias de color rojo a prpura, de 0.5 mm de dimetro rodeadas por un halo con precipitado.

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AGAR MACCONKEY
USO El Agar MacConkey es un medio selectivo y diferencial recomendado para el cultivo y aislamiento de microorganismos Gram negativos a partir de muestras clnicas, de alimentos, agua, productos lcteos y productos farmacuticos. En este medio se aslan y diferencian bacilos entricos Gram negativos fermentadores y no fermentadores de la lactosa. EXPLICACION El Agar MacConkey en su frmula original fue utilizado para diferenciar cepas de Salmonella typhosa de otros miembros del grupo coliformes. La frmula fue modificada para mejorar el crecimiento de cepas de Salmonella y Shigella y con ello tambin se mejoraron las reacciones diferenciales entre los microorganismos patgenos entricos y el grupo coliforme. El Agar MacConkey contiene cristal violeta y sales biliares como inhibidores de organismos Gram positivos. Las colonias aisladas de bacterias que fermentan la lactosa son rosadas y pueden estar rodeadas de una zona de precipitado de sales biliares el cual es debido a una cada en el pH por la fermentacin de la Lactosa. Las colonias que no fermentan la lactosa (como las de S. typhi, S. paratyphi y S. disentery) permanecen incoloras. FORMULACION Digerido Pancretico de Gelatina 17.0 Digerido Pptico de Tejido Animal 1.5 Digerido Pancretico de Casena 1.5 Lactosa 10.0 Rojo Neutro 0.03 PREPARACION Mtodo: Suspender 50g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con agitacin suave hasta su completa disolucin y hervir durante un minuto. Esterilizar en autoclave a 121C (15 libras de presin) durante 15 minutos. Enfriar a una temperatura entre 45-50C y vaciar en placas de Petri estriles. Procedimiento: Inocular las placas por estra o con hisopo, asegurndose de que con cualquiera de los dos mtodos se tengan colonias aisladas. Incubar las placas a 35 0.2C durante 18 a 24 hrs. Si no hay desarrollo a las 24 horas, re incubar las placas por 24 horas ms. Sales Biliares 1.5 Cloruro de Sodio 5.0 Cristal Violeta 0.001 Agar Bacteriolgico 13.5 Ph 7.1 0.2

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FORMULACIN DE AGARES AGAR MUELLER HINTON

USO El Agar Mueller Hinton es un medio utilizado para realizar las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana en microorganismos aerbicos por el mtodo de Bauer-Kirby. Este medio tambin es conocido como Agar M-H. EXPLICACION Bauer, Kirby, Sherris y Tuck recomendaron el Agar de Mueler Hinton para llevar a cabo las pruebas de susceptibilidad a antibiticos, utilizando un solo disco impregnado con una alta concentracin de un antimicrobiano. El Agar Mueller Hinton cumple con los requerimientos de la Organizacin Mundial de la Salud y est especificado en la FDA. Este medio es el seleccionado por la NCCLS (National Commitee for Clinical Laboratory Standards) para realizar las pruebas de susceptibilidad, por su alta reproducibilidad, su} bajo contenido de substancias inhibidoras y el crecimiento satisfactorio que presentan la mayora de los patgenos no fastidiosos. Con este medio se han llevado a cabo una gran cantidad de estudios sobre susceptibilidad antimicrobiana. En este medio la infusin de carne y la peptona de casena proveen la fuente de nitrgeno, vitaminas, arbn y aminocidos. El almidn es agregado para absorber cualquier metabolito txico y el agar es adicionado como agente solidificante. FORMULACION Infusin de Carne 300.0 Almidn. 1.5 Peptona de Casena H 17.5 Agar Bacteriolgico 17.0 pH 7.4 0.2 PREPARACION Mtodo: Suspender 38 g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con agitacin suave hasta su completa disolucin y hervir durante un minuto. Esterilizar en autoclave a 121C (15 libras de presin) durante 15 minutos. Dejar enfriar a una temperatura entre 45-50 C y vaciar en placas de Petri estriles Para obtener} desarrollo de Neisseria enfriar el medio a 45-50 C y agregar sangre de borrego desfibrinada estril al 5% calentada a 80 C. Para realizar pruebas de oxacilina y meticilina con estafilococcos , el medio deber ser suplementado con 2% de cloruro de sodio. Procedimiento: Consultar las referencias apropiadas para la tcnica de susceptibilidad en placa por el mtodo de difusin.

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AGAR NUTRITIVO
USO El Agar Nutritivo es utilizado para el cultivo de una amplia variedad de microorganismos. EXPLICACION A principios de 1900 la APHA (American Public Health Association) sugiri esta formulacin como un medio de cultivo estndar para el anlisis de agua. El Agar Nutritivo se encuentra descrito en los Mtodos Estndar de la APHA y de la AOAC (Association of Oficial Analytical Chemists) para el anlisis de agua, leche y sus derivados, alimentos y otros materiales. El Agar Nutritivo sigue siendo un medio ampliamente utilizado para el cultivo de microorganismos no fastidiosos. En este medio el extracto de carne y la peptona aportan la fuente de nitrgeno, vitaminas y carbono. El agar es adicionado como agente solidificante. FORMULACION Peptona de Gelatina 5.0 Extracto de Carne 3.0 Agar Bacteriolgico 15.0 pH 6.8 0.2 PREPAPARACION Mtodo: Suspender 23 g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con agitacin suave hasta su completa disolucin y hervir durante un minuto. Esterilizar en autoclave a 121C (15 libras de presin) durante 15 minutos. Dejar enfriar a una temperatura entre 45-50C y vaciar en placas de Petri estriles. Procedimiento: 1. Inocular las placas con una asada y sembrar por el mtodo de estra. 2. Incubar las placas a 35 C durante 18 a 24 horas.

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AGAR SAL Y MANITOL

USO El Agar Sal y Manitol es utilizado para el aislamiento y diferenciacin de estafilococos a partir de muestras clnicas y diversos materiales. EXPLICACION El Agar Sal y Manitol fue formulado por Chapman para obtener el aislamiento de estafilococos, inhibiendo el crecimiento de otras bacterias al utilizar una alta concentracin de sal. Al adicionar cloruro de sodio al 7.5% al Agar Rojo de Fenol y Manitol, observ un abundante crecimiento de cepas patgenas de estafilococos (coagulasa positivos) que formaban colonias y halos amarillos a diferencia de las cepas no patgenas que dan colonias pequeas de color rojo y sin cambio en el color del medio. En este medio las peptonas y el extracto de carne proporcionan la fuente de carbono, nitrgeno, vitaminas y minerales. El D.manitol es el carbohidrato. La alta concentracin de cloruro de sodio inhibe el crecimiento de flora acompaante. El rojo de fenol acta como indicador de pH. El agar es adicionado como agente solidificante. FORMULACION Digerido Pptico de Tejido Animal 5.0 Digerido Pancretico de Casena 5.0 Extracto de Carne 1.0 Agar Bacteriolgico 15.0 PREPARACION Mtodo: Suspender 111 g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con agitacin suave hasta su completa disolucin y hervir durante un minuto. Esterilizar en autoclave a 121C (15 libras de presin) durante 15 minutos. Dejar enfriar a una temperatura entre 45-50C y vaciar en placas de Petri estriles. Procedimiento: 1. Inocular las placas por el mtodo de estra. 2. Incubar las placas a 35 2 C durante 24 a 48 horas Cloruro de Sodio 75.0 D-Manitol 10.0 Rojo de Fenol 0.025 pH 7.4 0.2

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AGAR SALMONELLA SHIGELLA

USO El Agar Salmonella Shigella , tambin conocido como Agar SS, es utilizado para el aislamiento de especies de Salmonella y Shigella a partir de muestras clnicas y de alimentos EXPLICACION El Agar Salmonella Shigela es una modificacin del Agar Desoxicolato y Citrato descrito por Leifson. El Agar Salmonella Shigella tiene un desempeo superior a otros medios para el aislamiento de especies de Salmonella y Shigella. Ewing y Bruner encontraron que el Agar SS tiene la ventaja de que puede ser utilizado con inculos grandes de muestras clnicas en las que se pretende poner de manifiesto la presencia de especies de Salmonella y Shigella caudill reporta resultados muy satisfactorios con el uso del Agar SS para el aislamiento de Shigella hormaeche y col. usaron el Agar SS junto con otros medios para el aislamiento de Shigella como el agente causal de diarreas infantiles. En este medio las sales biliares No. 3 y el verde brillante actan como inhibidores de bacilos Gram positivos, de la mayora de bacilos coliformes y del swarming en Proteus spp., mientras que permiten el crecimiento de Salmonella spp. El tiosulfato de sodio y el citrato frico permiten la deteccin de la produccin de H2S. La lactosa proporciona la fuente de carbohidratos, el rojo neutro y el verde brillante actan como indicadores de pH y el agar es agregado como agente solidificante. FORMULACION Extracto de Carne 5.0 Mezcla de Peptonas 5.0 Lactosa 10.0 Mezcla de Sales Biliares 8.5 Verde Brillante 0.33 pH 7.0 0.2C PREPARACION Mtodo: Suspender 60 g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con agitacin suave hasta su completa disolucin y hervir durante un minuto. Enfriar a una temperatura entre 45-50 C y vaciar en placas Petri estriles. No esterilizar en autoclave. Procedimiento: 1. Recolectar las muestras en contenedores estriles o con hisopos estriles transportados en un medio de transporte. 2. Sembrar las muestras por el mtodo de la estra para obtener colonias aisladas, 3. Incubar las placas a 35-37 C durante 24 a 48 horas y examinar el crecimiento. Jos Antonio Ledezma Cortes Pgina 7 Citrato de Sodio Tiosulfato de Sodio Citrato Frrico Rojo Neutro Agar Bacteriolgico 8.5 8.5 1.0 0.025 13.5

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AGAR SOYA TRIPTICASENA USO El Agar Soya Tripticasena es un medio utilizado para promover el crecimiento de microorganismos fastidiosos y adicionado de sangre para observa reacciones hemolticas. EXPLICACION El Agar de Soya Tripticasena provee un excelente soporte de crecimiento para organismo aerobios y anaerobios, segn lo demostr Leavit en 1955. Este medio es recomendado en los procedimientos microbiolgicos de control de aguas , cosmticos y en la industria farmacetica. De aguerdo con la Farmacopea. Clnicamente se utiliza para diferenciar especies de Haemophylus debido a que no contiene los factores X y V requeridos para su crecimiento. As mismo este medio puede ser utilizado como base para preparar medios suplementados como el Agar Sangre y Agar Glosa Chocolate. En este medio las peptonas proveen la fuente de nitrgeno y minirales. El azcar de la Peptona de Soya provee la fuente de carbohidratos. El Cloruro de Sodio tiene su funcin en el balance osmtico y el Agar es incorporado como agente solidificante. FORMULACION Peptona de Casena 15.0 Peptona de Soya 5.0 Cloruro de Sodio 5.0 Agar Bacteriolgico 15.0 pH 7.3 0.2 PREPARACION Mtodo: Suspender 40 g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con agitacin suave hasta su completa disolucin y hervir durante un minuto. Esterilizar en autoclave a 121C ( 15 libras de presin) durante 15 minutos. Dejar enfriar a una temperatura entre 45-50C y vaciar en placas de Petri estriles. Para preparar Agar Sangre, adicionar ascticamente sangre desfibrinada estril al 5% despus de esterilizar y enfriar el medio.

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FORMULACIN DE AGARES AGAR TCBS

USOPECIFICACIONES El Agar TCBS es utilizado como medio selectivo para el aislamiento y cultivo de Vibrio cholerae. EXPLICACIION El Agar TCBS, por las iniciales de Tiosulfato-Citrato-Bilis-Sacarosa, es preparado de acuerdo con la frmula de Kobayashi y col. siendo una modificacin del medio de Nakanishi. En el Agar TCBS crecen todas las especies de Vibrio patgenas para el humano excepto V. hollisae. Las muestras pueden ser de materiales tanto clnicos como no clnicos. El Agar TCBS es altamente selectivo para las especies de Vibrio debido a sus componentes nutricionales y a la alta concentracin de sales y es ampliamente utilizado en placa para el primoaislamiento. Este medio junto en el Agua Peptonada Alcalina es utilizado para el aislamiento de V.cholerae y otras especies a partir de muestras fecales. En este mediio el extracto de levadura y las peptonas proporcionan la fuente de nitrgeno, vitaminas y aminocidos. El citrato de sodio, el tiosulfato de sodio y la bilis actan como agentes inhibidores de microorganismos Gram positivos y coliformes dando alcalinidad al medio. La sacarosa es el carbohidrato fermentable. El cloruro de sodio promueve el crecimiento. El tiosulfato de sodio es la fuente de sulfuro y el citrato de hierro es un indicador para detectar la produccin de H2S. El azul de timol y de bromotimol actan como indicadores de pH. El agar bacteriolgico es agregado como agente solidificante. FORMULCION Extracto de Levadura Cloruro de Sodio Citrato de Sodio Citrato de Hierro Agar Bacteriolgico PREPARACION Mtodo: Suspender 86 g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con agitacin suave hasta su completa disolucin y hervir durante un minuto. Enfriar a una temperatura entre 45-50 C y vaciar en placas Petri estriles. No esterilizar en autoclave. Procedimiento: Sembrar las muestras tan pronto lleguen al laboratorio. Muestras como hisopos rectales, heces, pescado y otros alimentos pueden ser depositadas directamente en el medio. Se recomiendan colocar inculos pesados ya que los vibrios tienden a morir rpidamente, esto especialmente cuando las muestras no son frescas. Si las muestras tienen que ser transportadas al laboratorio, se recomienda utilizar el medio de Cary Blair como medio de transporte. Las muestras no deben ser congeladas. Incubar las placas protegidas. 5.0 10.0 10.0 1.0 14.0 Sacarosa 20.0 Peptona de Casena 5.0 Peptona de Carne 5.0 Tiosulfato de Sodio 10.0 Bilis disecada 5.0 Colato de Sodio 3.0 Azul de Timol 0.04 Azul de Bromotimol 0.04 pH final 8.6 0.2

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FORMULACIN DE AGARES AGAR DEXTROSA Y PAPA

USO El Agar Dextrosa y Papa es un medio utilizado para el cultivo de hongos y levaduras a partir de muestras de alimentos, derivados de leche y productos cosmticos. EXPLICACION El Agar Dextrosa y Papa puede ser suplementado con antibiticos o cidos para inhibir el crecimiento bacteriano. Este medio es recomendado para realizar el recuento colonial. Tambin puede ser utilizado para promover el crecimiento de hongos y levaduras de importancia clnica. La base del medio es altamente nutritiva y permite la esporulacin y la produccin de pigmentos en algunos dermatofitos. Algunos procedimientos sealan bajar el pH del medio a 3.5 0.1 con cido tartrico al 10 %, para inhibir el crecimiento bacteriano. La infusin de papa promueve un crecimiento abundante de los hongos y levaduras el agar es adicionado como agente solidificante. FORMULCION Infusin de Papa 200.0 Dextrosa 20.0 Agar Bacteriolgico 15.0 pH 5.6 0.2 PREPARACION Mtodo: Suspender 39 g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con agitacin suave hasta su completa disolucin y hervir durante un minuto. Esterilizar en autoclave a 121C (15 libras de presin) durante 15 minutos. Enfriar a una temperatura entre 45-50 C y vaciar en placas de Petri estriles. Procedimiento: Consultar las referencias apropiadas sobre procedimientos y mtodos estndar.

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FORMULACIN DE AGARES AGAR BASE DE CALDO

USO El agar Base de Caldo Tetrationato es utilizada para el enriquecimiento de especies de Salmonella. EXPLICACION La Base de Caldo Tetrationato es utilizada como un medio de enriquecimiento selectivo para especies de Salmonella que pueden estar presentes en pequeas cantidades y que compiten con otras bacterias de la flora intestinal. Las salmonellas pueden ser daadas durante el procesamiento de los alimentos, sometindose a bajas temperaturas, calor, desecacin, radiacin y adicin de preservativos. Aun cuando las clulas daadas no desarrollen en medios de cultivo selectivos, al estar presentes, stas pueden causar dao al ser ingeridas con los alimentos. Mueller demostr la efectividad del Caldo Tetrationato para el enriquecimiento de bacilos tifodicos y paratifodicos y la inhibicin de coliformes. En una modificacin del medio de Mueller, Kauffman increment el nmero de aislamientos positivos de Salmonella. La base de Caldo Tetrationato est especificada en los Mtodos Estndar para las pruebas de Salmonella. En este medio la peptona provee la fuente de carbono,} nitrgeno, vitaminas y aminocidos. La selectividad del medio est dada por la combinacin del tiosulfato de sodio y tetrationato (el tetrationato es formado en el medio con la adicin de yodo y yoduro de potasio en solucin). Los organismos que tienen la enzima tetrationato reductasa proliferan en el medio. Las sales biliares suprimen el desarrollo de coliformes e inhiben el crecimiento de bacterias Gram positivas. El carbonato de calcio neutraliza y absorbe los metabolitos txicos.

FORMULACION Mezcla de Peptonas Sales biliares pH PREPARACION Mtodo: Suspender 46 g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con agitacin suave hasta su completa disolucin y hervir durante un minuto. No esterilizar en autoclave. Adicionar 20 mL de solucin yodo-yodurada (6 g de yodo en cristales y 5g de yoduro de potasio en 20Ml de agua) antes de utilizarse. Dispensar en tubos estriles y utilizar inmediatamente. Procedimiento: Referirse a los procedimientos y Mtodos Estndar para el aislamiento e identificacin de Salmonella. Jos Antonio Ledezma Cortes Pgina 11 5.0 1.0 8.4 0.2 Carbonato de Calcio Tiosulfato de Sodio 10.0 30.0

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CALDO INFUSIN CEREBRO CORAZN
USO

El medio de Infusin Cerebro Corazn es utilizado para el cultivo de microorganismos fastidiosos como estreptococos, neumococos y meningococos. Este medio tambin es conocido como BHI por sus siglas en ingls. EXPLICACION El medio de Infusin Cerebro Corazn es una modificacin de las formulaciones desarrolladas por Rosenow Hayden en las que se adicion infusin de cerebro de ternera y difosfato de sodio. El medio de Infusin Cerebro Corazn est especificado en varios procedimientos estndares para la industria alimenticia y el anlisis de aguas. Tambin es recomendado por la NCCLS para preparar el inculo para las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana. En este medio la infusin de carne de corazn y de cerebro de ternera as como la peptona proveen la fuente de carbono, nitrgeno sulfuro y vitaminas. La dextrosa acta como fuente de energa. El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico del medio. El fosfato disdico acta como buffer. FORMULCAION Infusin de Cerebro de Ternera Infusin de Corazn de Res Peptona de Gelatina pH PREPARACION Mtodo: Suspender 37g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con agitacin suave hasta su completa disolucin y hervir durante un minuto. Dispensar en tubos de vidrio, tapar y esterilizar en autoclave a 121C (15 libras de presin) durante 15 minutos. Procedimiento: Inocular los tubos con una o dos gotas de la muestra con una pipeta estril. Los hisopos pueden ser insertados dentro de los tubos. Para su utilizacin en las pruebas de susceptibilidad, consultar las referencias apropiadas. Para cultivar microorganismos anaerobios se deben incubar los tubos en condiciones de 200.0 250.0 10.0 7.4 0.2 Cloruro de Sodio Fosfato Disdico Dextrosa 5.0 2.5 2.0

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