PRODUCCION DE ETANOL A PARTIR DE YUCA MEDIANTE BIOREACTOR DE TANQUE AGITADO CON CONTROL DE VARIABLES AUTOR: Qco. Msc.

AMLETO LEON TLLEZ Y COLABORADORES DOCENTE INVESTIGADOR UNIVERSIDAD AUTONOMA DE BUCARAMANGA, UNAB Email: [email protected] [email protected]

RESUMEN DEL PROYECTO: El proyecto consiste bsicamente en producir etanol a partir del almidn aislado de la yuca raz sin cscara, dicho almidn (polisacrido de glucosa) se somete a hidrlisis qumica, de tal forma que se produzcan azcares fermentables, que son sometidos a una fermentacin anaerbica por accin de la levadura Saccharomyces cerevisiae obtenindose as una solucin etanlica. Ambas etapas, hidrlisis y fermentacin anaerbica son realizadas en el Bioreactor de Tanque Agitado controlando las variables de pH, Temperatura, Agitacin, Tiempos de hidrlisis y de fermentacin y Concentracin de sustratos. Los experimentos de produccin de etanol en el Bioreactor estn planteados de acuerdo a un diseo factorial de experimentos que permite el anlisis estadstico de los resultados.

Lo innovador del proyecto en la obtencin de etanol por va Biotecnolgica a partir del almidn de yuca, es la aplicacin del Bioreactor con control de variables para las dos etapas del proceso, hidrlisis qumica y fermentacin anaerbica. Estas etapas se realizan en forma continua, y en el mismo bioreactor; para tal efecto ste cuenta con accesos para la toma de muestras y para la adicin de nutrientes y estabilizadores del bioproceso.

I. INTRODUCCION Este proyecto se enmarca dentro del inters del gobierno colombiano, expresado en la Ley 693 de Septiembre 19 de 2001, por la cual se dictan normas sobre el uso de alcoholes carburantes, se crean estmulos para su produccin, comercializacin y consumo, y s0e dictan otras disposiciones. Dicha Ley reza as en su artculo primero: "A partir de la vigencia de la presente ley, las gasolinas que se utilicen en el pas en los centros urbanos de ms de 500.000 habitantes tendrn que contener componentes oxigenados tales como alcoholes carburantes, en la cantidad y calidad que establezca los Ministerios de Minas y Energa, y del Medio Ambiente para cada regin del pas.

La Resolucin prev que a ms tardar el 27 de Septiembre de 2005 las primeras ciudades donde se vender gasolina mezclada con etanol sern Cali, Bogot, Medelln y Barranquilla y sus respectivas reas metropolitanas.

En Bucaramanga, Cartagena, Ccuta y Pereira ser obligatorio a partir del 27 de septiembre del 2006. Posteriormente, la medida se aplicar para el resto del pas.

De acuerdo con la Asociacin de Recursos Renovables del Canad, el agregado de un 10% de etanol al combustible trae los siguientes beneficios: reduccin de un 30% de las emisiones de monxido de carbono y disminucin entre un 6% y un 10% de reduccin de las emisiones de dixido de carbono a la atmsfera.

En este contexto, el bioalcohol surge como una fuente energtica limpia y renovable; asimismo, presentan una potencialidad como materia prima para la sntesis del producto hoy de origen petroqumico. Por tanto, es una de las alternativas ms atrayentes a la hora de considerar sustitutivos vlidos del petrleo.

Dentro de los cultivos no convencionales, la yuca es uno de los ms prometedores para la obtencin de etanol en nuestro pas, debido a su alto contenido de hidratos de carbono fcilmente fermentables, la rusticidad de la planta y los altos rendimientos obtenidos.

II. MATERIALES Y METODOS A. AISLAMIENTO DEL ALMIDN DE YUCA . La extraccin del almidn de la yuca se realiz de acuerdo a los siguientes pasos: Primero Lavado; con el fin de retirar tierra y otras impurezas que trae la yuca. Segundo, Descortizado; se realiza a mano, teniendo el cuidado de no retirar tambin parte del tubrculo con la cscara. Tercero, Rallado; se hace con el fin de desintegrar las clulas de las races para dejar libre e almidn. Cuarto, Tamizado; que consisti en colar la yuca rallada previamente, lavndola con agua abundante, para separar el almidn de la fibra 10 mL H2O/g, yuca sin cscara, el tamiz corresponde a un tamao de grano de 0.1 mm. El almidn es arrastrado por el agua a travs del tamiz y la fibra permanece en ste, con la cual se logra separarlo. Quinto, sedimentado; Consisti en decantar la lechada que sale del tamiz para separar los grnulos del agua y por ltimo el Secado; Tanto el almidn como la fibra se secan en una estufa a 60C de temperatura y durante 24 horas.

B. HIDRLISIS DEL ALMIDON DE YUCA Se realiz Hidrlisis Acida, controlando la temperatura de reaccin , presin de reaccin, concentracin del cido y del almidn. Con el almidn hidrolizado se obtienen azcares fermentibles mediante rompimiento de las cadenas de glucosa. La Hidrlisis se llev a cabo en Autoclave Marca All American, hecha en aluminio fundido con tubo metlico flexible de escape, manmetro y control de vlvula, su cierre es de metal a metal sin empaques de caucho, y de volumen de 15 L. Los pasos que se siguieron en la Hidrlisis de almidn por va qumica fueron los siguientes: Se pes una cantidad de almidn para un volumen de 800mL y para una concentracin dada de cido en un erlenmeyer de 1L que fue llevado al autoclave x condiciones de 15 psi, durante 30 minutos a una temperatura de 120C, terminada la hidrlisis se filtra al vaco y luego se determina la cantidad de azcar obtenida. Diseo de experimentos para la hidrlisis del almidn de yuca por va qumica Diseo Factorial Completo Se utiliza en la planeacin de experimentos que produzcan una informacin confiable en el menor nmero de ensayos. El nmero de experimentos que se deben efectuar es 2n donde n es el nmero de variables independientes de dicho proceso. Determinacin de las variables y sus niveles El primer paso a seguir es la escogencia de las variables que puedan ser controladas durante el proceso y sus niveles mas adecuados. Despus de una bsqueda bibliogrfica y ensayos preliminares se consideran las variables ms influyentes como independientes. Los dems valores de las variables del proceso se mantienen constantes.

Los valores mas apropiados de las variables del proceso, se dan como un rango dentro del cual se determinan los niveles apropiados para el diseo. El nivel mximo se simboliza como (+) y el nivel mnimo como(-). La variable dependiente o respuesta se simboliza como Y. En el caso de que cada experimento se realiza como replica, la respuesta Y es el promedio de las dos respuestas, como se expone a continuacin:

Y1 =
Y11, Y12 = Respuesta del experimento y su replica. Y1 = Promedio de la respuesta.

(Y11 + Y12 )
2

Para poder determinar la precisin de la experimentacin se hace un anlisis estadstico utilizando experimentos de control. Con los datos del anlisis estadstico se plantea el modelo matemtico que describe la significacin de las variables en el proceso. Obtenidos los anteriores resultados se calcula los efectos simples, dobles y triples de las variables como se indica a continuacin De acuerdo a los ensayos preliminares las variables seleccionadas (n) y sus niveles mximos (+) y mnimos (-) para la hidrlisis del almidn por va qumica fueron: Concentracin de almidn (nivel superior 18%, nivel inferior 6%),

Concentracin de Acido Clorhdrico (nivel superior 0.10N, nivel inferior 0.05, mediante buffers), y el Tiempo de Hidrlisis (nivel superior 30y nivel inferior 10).

Manteniendo constante la temperatura de 120C, la presin de 15 psi y el volumen de hidrlisis de 800 mL. Se realizaron cuatro experimentos denominados de Control (simbolizados como 0 en la matriz del diseo) que no son ms que cuatro replicas con valores de variable intermedio de a los valores superior e inferior como lo muestra la matriz del diseo con el fin de evaluar el lmite de confiabilidad de los experimentos de la matriz de diseo factorial e identificar los efectos significativos de la accin de las variables en forma individual o conjunta.

El Porcentaje de Rendimiento de la Hidrlisis se obtiene mediante la relacin del Azcar Tericamente esperado con respecto al valor ledo experimentalmente de acuerdo a la siguiente relacin:

360 g de glucosa Y= 342 g de almidn * X gramos de almidn * 0.9 = Azcar Terico

Donde: 360 g de glucosa corresponden al peso de dos molculas de glucosa que se hidrolizan de una unidad monomrica (maltosa) del almidn. 342 g peso de una unidad monomrica de almidn. 0.9 es la fraccin que indica que el 90% del almidn hidrolizan a azcar, tomando un 10% en prdida por almidn que no se alcanza a hidrolizar. Azcar experimental % Rendimiento = * 100

Azcar terica Tabla 1. Matriz de Diseo (2n ) para la Hidrlisis del Almidn de yuca

Concentracin de Experimento HCl [HCl] (N:mol/L) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 0.05 0.10 0.05 0.10 0.05 0.10 0.05 0.10 0.075 0.075 0.075 0.075

Concentracin de Almidn [AL] en (%)

Tiempo de hidrlisis [t] en (minutos) % Rend

6 6 18 18 6 6 18 18 12 12 12 12

10 10 10 10 30 30 30 30 20 20 20 20

70.4 69.8 71.4 70.5 84.3 88.2 77.5 90.2 84.8 85.2 84.3 83.6

C. DISEO DE EXPERIMENTOS PARA LA FERMENTACION ALCOHOLICA De acuerdo a referencias bibliograficas y ensayos preliminares las variables seleccionadas (n) y sus niveles mximos (+) y mnimos (-) para la fermentacin de los hidrolizados de almidn a alcohol por parte del Saccharomices cerevisiae fueron: La Temperatura (nivel superior 37C, nivel inferior 25C), el pH (nivel superior 6.0, nivel inferior 4.0, mediante buffers), y la concentracin de azcares reductores totales (nivel superior 12%, nivel inferior 6%). Manteniendo constante la

concentracin del inoculo, flujo de aire, la concentracin de sales, y el tiempo de la hidrlisis (96 horas).

El Porcentaje de Rendimiento de la Fermentacin Alcohlica se obtiene mediante la relacin entre la cantidad real de alcohol producido y la esperada tericamente en base a la concentracin de azcar de la solucin a fermentar. Se expresa en porcentaje entre el volumen de alcohol determinado y el volumen esperado tericamente. Si se trata de X gramos de azcar, maltosa, el volumen de alcohol esperado tericamente ser:

X g de maltosa Y= 100 mL de solucin

184 g de alcohol * 360 g de maltosa

500 * 0.79

En donde: Y = mL de alcohol terico, 184 es el peso de 4 molculas de alcohol etlico que por fermentacin se producen a partir de una molcula de maltosa o dos de glucosa, 360 es el peso de una molcula de maltosa equivalente a dos de glucosa, 0.79 es la densidad del etanol en g/mL, 500 es el volumen en mL medido para cada fermentacin.

Alcohol experimental % Rendimiento = Alcohol Terico * 100

TABLA 2. Matriz del Diseo con los experimentos de Control para la fermentacin Alcohlica

Experimento 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

T 25 37 25 37 25 37 25 37 32 32 32 32

%AZU 6 6 12 12 6 6 12 12 9 9 9 9

pH 4 4 4 4 6 6 6 6 5 5 5 5

% Rend 76.2 82.2 84.7 86.4 78.2 84.2 85.2 89.1 89.3 87.4 88.6 86.8

D. BIOREACTOR DE TANQUE AGITADO Diseo y construccin del Biorreactor: El Biorreactor esta construido en acero inoxidable para asegurar la calidad en los procesos. Esta compuesto por un ventilador, un motor de 60 r.p.m., agitador con tres paletas ajustables y un cortaespuma, en la parte externa de la tapa estn ubicados un manmetro, una vlvula de seguridad, un termopozo fijo para termocupla removible (tipo J), una resistencia removible, cuatro bafles o cortacorrientes situados en las paredes del tanque interno, el dispersor de aire fijo en la base unido a una vlvula de aguja, la chaqueta y tres vlvulas de bola, a continuacin se describen cada uno de ellos:

Accesorios del Biorreactor: Sistema de enfriamiento. Este sistema permite bajar las altas temperaturas generadas durante el proceso de esterilizacin y mantenerla luego bajo la accin de la resistencia (40W) a una temperatura determinada.

Este sistema de enfriamiento integra dos cajas elaboradas en aluminio, de las cuales una se ubica a nivel superior respecto a la otra.

Sistema de control. Se dise para llevar a cabo el proceso de esterilizacin, mantener la temperatura ptima durante el tiempo de desarrollo y crecimiento de la levadura en el Biorreactor, control del sistema de agitacin, encendido y apagado de motobombas de acuerdo a los requerimientos.

Visualizador. Para seleccionar este dispositivo se procedi a buscar en el mercado un control

electrnico de temperatura especfico para las condiciones de trabajo de la termocupla tipo J, la cual maneja un rango de temperatura de 0C a 400 C. El modelo XMTA 93301 fue el que mejor se adapt a las necesidades de funcionamiento del sistema de control del Biorreactor; el cual maneja un voltaje de trabajo de 110V y una frecuencia de 50/60Hz.

III. RESULTADOS

A. RESULTADOS DEL AISLAMIENTO DEL ALMIDON DE YUCA

Tabla 3. PORCENTAJES DE EXTRACCIN DE ALMIDON DE YUCA SEGN METODOLOGIA PESO YUCA INICIAL (g) Muestra N1: 2280.6 Muestra N2: 3423.4 Muestra N3: 2876.4 VALORES PROMEDIOS 2860.1 356.2 2493.9 1010.6 40.2 89.3 326.6 2519.8 1047.4 41.5 92.4 418.2 3005.2 1241.1 41.3 91.7 PESO CASCARA (g) 323.7 PESO YUCA SIN CASCARA (g) 1956.9 PESO ALMIDON EXTRAIDO (g) 743.3 % ALMIDON %RENDIMIENTO (% ALMIDON (BASE YUCA SIN TEORICO: 45%) CASCARA) 38.0 84.0

TABLA 4. COMPOSICIN QUMICA DEL ALMIDON EXTRAIDO

MUESTRA ANALISIS % HUMEDAD % PROTEINA % GRASA % CENIZAS % FIBRA % CARBOHIDRATO Muestra N1 6.4 0.22 0.10 0.20 0.10 93.0 Muestra N2 6.1 0.31 0.12 0.21 0.10 93.1 Muestra N3 5.7 0.24 0.14 0.16 0.10 93.7

VALOR PROMEDIO 6.06 0.25 0.12 0.19 0.10 93.3

B. RESULTADOS DE LA HIDRLISIS DEL ALMIDON Tabla 5. Martiz del Diseo con los experimentos de Control Concentracin de Experimento HCl [HCl] (N:mol/L) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 0.05 0.10 0.05 0.10 0.05 0.10 0.05 0.10 0.075 0.075 0.075 0.075 6 6 18 18 6 6 18 18 12 12 12 12 10 10 10 10 30 30 30 30 20 20 20 20 70.4 69.8 71.4 70.5 84.3 88.2 77.5 90.2 84.8 85.2 84.3 83.6 Concentra-cin de Almidn [AL] en (%) Tiempo de hidrlisis [t] en (minutos) % Rend

MODELO MATEMTICO DE LA HIDRLISIS DEL ALMIDON DE YUCA

% Re n dim iento = 77.78 + 4.52 X 1 + 14.5 X 3 + 2.2 X 1 X 2 + 3.77X1X3 + 2.12X1X2X3

X1 =
X2 =

HCl 0.075 0.025

X3 =

t 20 10

C. RESULTADOS DE LA FERMENTACIN ALCOHOLICA

Experimento 1 2

T 25 37

%AZU 6 6

pH 4 4

% Rend 76.2 82.2

25

12

84.7

4 5 6 7 8 9 10 11 12

37 25 37 25 37 32 32 32 32

12 6 6 12 12 9 9 9 9

4 6 6 6 6 5 5 5 5

86.4 78.2 84.2 85.2 89.1 89.3 87.4 88.6 86.8

Modelo Matemtico resultante de la fermentacin Alcohlica

%Rendimiento = 83.2 + 4.4X1 + 6.1 X2 + 1.8 X3 - 1.6 X1 X2

X1 =

T 32 7

X2 =

A 9.0 5.0

X 3 = pH 5

IV. DISCUSIN DE RESULTADOS Los resultados del anlisis de la yuca raz sin cscara, nos muestra alto contenido de carbohidratos, diferentes a los carbohidratos de la fibra, representados por la ENN (Extracto No Nitrogenado = almidn, pectina y otros azcares) que fue del orden del 86.5 en promedio, representado fundamentalmente por el porcentaje de almidn, para nuestros propsitos nos resulta significativamente importante, toda vez que, el ENN es de fcil fraccionamiento hidroltico, generando as concentraciones altas de azcares reductores totales con alto potencial de conversin a etanol por accin de las levaduras especializadas para tal efecto. -De acuerdo al Ministerio de Agricultura, Colombia en el 2001 produjo 2 millones de toneladas de yuca, en 180.000 Ha de cultivo, de las cuales se desperdician alrededor del 5%, lo que corresponde a 100.000 toneladas de yuca, con un valor potencial muy alto para producir etanol. -De acuerdo a los resultados obtenidos del anlisis del contenido de almidn en la yuca que est del orden del 80%, se tienen entonces 80.000 tonelada de almidn que tericamente se pueden obtener unos 240.000 metros cbicos de etanol.

- Los porcentajes de almidn obtenidos, producto del aislamiento para tres muestras de Yuca, de acuerdo a la metodologa descrita fueron de : 38.0, 41.3 y 41.5 para un promedio de 40.2%. El contenido total de

carbohidratos del almidn de yuca es del orden del 93%, lo que lo hace un excelente sustrato para la obtencin de azcares simples.

- El la hidrlisis del almidn de yuca se encontr un mximo rendimiento del 90.2% a las condiciones siguientes: Concentracin de cido Clorhdrico 0.1 N, % de Almidn de 18% y un tiempo de Hidrlisis de 30 minutos, dichas condiciones son fciles de reproducir.

- El modelo matemtico que describe el proceso de hidrlisis contiene las variables con sus efectos individuales, dobles y triples. Demostrando la susceptibilidad del proceso a los cambio de los valores de variables. El efecto mayor es el relacionado con la accin conjunta entre las concentracines de almidn y cido clorhdrico lo que significa que stas es la variable de mayor significado.

- En la fermentacin de los azcares reductores por la Saccharomyce cerevisiae el mejor de los experimentos fu a las condiciones de pH 6.0, concentracin de azcares reductores totales de 12g/100mL y temperatura de 37C con un rendimiento del 89.1% equivalente a 6.4% de etanol. En el modelo matemtico resultan como variables significativas la temperatura, el pH y la concentracin de azcar, al igual con las variables conjuntas u efectos dobles de la temperatura y porcentaje de almidn.

- Los resultados de esta investigacin demuestran claramente que es factible realizar la fermentacin del almidn de Yuca en etanol a travs de una previa hidrlisis cida del almidn y de un organismo de fermentacin del azcar que no digiere el almidn como el Saccharomyces.

- En el diseo y puesta en marcha del Bioreactor de tanque agitado con variables de control cumpli, dentro de las limitaciones propias del diseo, controlar las ms importantes variables del proceso como la Temperatura, tiempo de reaccin, Velocidad de Agitacin, concentracin celular, flujo volumtrico, Productividad, Concentraciones de biomasa y sustrato en el equilibrio en las fases de hidrlisis y fermentacin.

V. RECONOCIMIENTOS A las Ingenieras en Biorecursos; Liliana Corredor Silva, Marcela Forero Oses y Cristina Amparo Novoa Jaimes de la Universidad Manuela Beltrn, en el Diseo y Control electrnico del Bioreactor de tanque agitado.

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