UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDESTE
Comunicaciones Cientficas y Tecnolgicas 2000
Comparacin de distintos mtodos para medir la actividad enzimtica
del ltex de Carica papaya
Glibota, Gustavo S. - Garro, Oscar A. - J udis, Mara A.
Facultad de Agroindustrias - UNNE.
Cte. Fernndez 755 - (3700) Pcia. R. S. Pea - Chaco - Argentina.
Tel./Fax: +54 (03732) 420137 - E-mail:
[email protected] ANTECEDENTES
La papana es una mezcla compleja de enzimas con actividad protreolticas y peroxidasas contenidas en el
exudado de Carica papaya (mamn). Dos son las enzimas proteolticas mas conocidas: la papana
propiamente dicha y la quimopapana.
Adems de las aplicaciones farmacuticas, las proteasas son utilizadas en distintos procesos industriales, tales
como tiernizacin de carnes, elaboracin de cueros, detergentes, cervezas, quesos, panes, protenas
modificadas para alimentacin humana y animal, procesado de fibras textiles y tratamiento de efluentes
industriales.
Su importancia econmica es considerable, ya que representa las dos terceras partes del mercado de enzimas.
Con vistas al aprovechamiento integral del vegetal Carica papaya, especialmente los restos del fruto, se
analiz los distintos mtodos para medir la actividad proteoltica de esta enzima bajo distintos sustratos y
condiciones.
MATERIALES Y METODOS
El buffer en que disolvi el ltex fue buffer fosfato 0.05 N, Ph 7
El ltex usado como testigo fue de la marca SIGMA, ltex crudo secado al sol con actividad 1,7 U Baee / mg
slido.
La enzima se disolvi en buffer, se centrifug a 3000 g y se filtr previamente.
Se utiliz la tcnica del Baee para comprobar su actividad.
La tcnica consiste en la hidrlisis de un sustrato sinttico BAEE (N-Benzoil-L-arginina Etil ster
Hidroclordrico Mtodo titulomtrico (Shwert and Tanaka 1955).
Procedimiento: La reaccin se monitorea manteniendo el Ph en 6.2 a 25C en un recipiente conteniendo 5ml
de solucin con el sustrato, 5ml de sol. 3M NaCl , 5ml de buffer activador, agregando a esto 0.1ml de enzima
en solucin.
Se registr los l agregados del titulante (NaOH 0.01-0.02 N) por minuto para mantener el PH constante.
La actividad de la enzima se calcul de la siguiente manera:
unidad/mg = ml de base adicionada/min normalidad 1000
mg de enzima agregado
unid/ml = 0.05 N df 1000 unid/mg sol = unid./ml. enz.
T V mg sol/ml enz
0.05: volumen de hidrxido en ml usado para mantener el ph en 6.2
N : normalidad del hidrxido
df: factor de dilucin
T : tiempo en minutos
V: vol enzima usado en ml
Una unidad hidroliza un micromol de baee por minuto a 25C y Ph 6.2.
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDESTE
Comunicaciones Cientficas y Tecnolgicas 2000
Se calculo la protena contenida en el ltex para obtener la relacin de la concentracin de enzima - actividad
de la misma.
La cantidad de protena se midi por espectrofotometra ultra violeta a 280 nm. (UV) con lampara de sodio,
utilizando un espectrofotmetro BECHMAN. Para medir la concentracin de protena, la muestra se filtr y
centrifug previamente. Se utiliz la misma solucin buffer como blanco.
Para calcular la cantidad de protenas se utiliz la siguiente formula:
mg protena/ml = A
280
nm 0.4 (Balls, 1939).
MTODOS PROBADOS
Mtodos de medicin de actividad: Se indag sobre las tcnicas que nos permita cuantificar la actividad
enzimtica de las muestras.
Mtodo colorimtrico con precipitacin de protenas con TCA:
Este mtodo consisti en hidrolizar un sustrato como la casena, luego se precipit la protena con TCA (cido
tricloro actico) al 30%, una vez precipitada y filtrada la protena, se ley el sobrenadante (aminocidos) por
espectrofotometra a 280nm.
Se utiliz 5ml de solucin de casena al 0.1% en cada muestra y se agreg 0.1ml de enzima en cada tubo.
Mtodo de coagulacin de leche (Balls and Hoover):
Se determin el tiempo de coagulacin de una muestra de 10 ml de leche descremada, luego de agregada una
determinada concentracin de enzima.
Cambio en la variacin del ph:
Se midi el cambio de Ph durante la accin de la enzima en una muestra de 5ml de leche descremada.
Mtodo del BAPA (colorimtrico):
Se disolvi el sustrato BAPA en buffer tris 0.05M y Ph 8
El BAPA (Benzoil - arginina - Paranitroanilina) en presencia de una proteasa se descompone obtenindose la
p-nitroanilina que tiene una coloracin amarilla. El cambio de coloracin y la intensidad depende de la
actividad de la enzima.
Las muestras se midieron en un espectrofotmetro a 410 nm.
El tiempo al que se midi la reaccin fue de 6 hs. A 25C
DISCUSION DE RESULTADOS
La enzima de referencia (SIGMA) fue controlada con el mtodo de la hidrlisis titulomtrica, dando una
actividad de 1,71Baee / mg de ltex seco, la especificacin del fabricante fue 1,70 Baee / mg de ltex seco.
unid/ml = 0.05 0.108 1 1000 unid/mg sol = 1.028
5.25 1 0.6
Unid/ml = 1.028 unid/mg sol = 1.713 BAEE
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDESTE
Comunicaciones Cientficas y Tecnolgicas 2000
Mtodo titrimtrico (BAEE)- Medicion de
actividad en la papaina de referencia
y = 0,1116x
R
2
= 0,9977
0
10
20
30
40
50
0 200 400 600
NaOH agregado en microlitros
t
i
e
m
p
o
(
m
i
n
)
y = 400x
R
2
= 1
0
100
200
300
400
500
600
0 0,5 1 1,5
Abs
u
g
d
e
p
r
o
t
e
n
a
La medicin de protena indic un resultado proporcional a la concentracin de ltex disuelto
Punto de coagulacin de las
protenas de la leche
0
1
2
3
4
5
0 2000 4000 6000
tiempo (seg)
m
l
d
e
e
n
z
i
m
a
Evolucin del PH en la hidrlisis
6,25
6,35
6,45
6,55
6,65
6,75
0 50 100 150 200
tiempo (min)
P
H
2,5 5 10 20
Se sigui la cintica de la hidrlisis con el punto de coagulacin de la leche con los ml de enzima agregados y
el cambio de Ph a distintas concentraciones de enzima (2.5, 5, 10 y 20 mg/ml).
BAPA (mtodo colorimtrico)
R
2
= 0,984
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0 10 20
ug enzima/ml
A
b
s
Colorimtrico con precipitacin de
protenas con TCA
10 5
2,5
1,25
0,625
0,3125
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 5 10
ug /ml
A
b
s
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDESTE
Comunicaciones Cientficas y Tecnolgicas 2000
CONCLUSIONES
Mtodo colorimtrico con precipitacin de protenas con TCA:
No se obtuvo una curva regresin aceptable a la proporcin de enzima en las muestras, salvo a
concentraciones muy baja de la misma y con mucho error.
Cambio en la variacin del ph:
Este mtodo permite calcular una actividad mayor o menor de una enzima y otra pero no se pudo obtener una
relacin linealizada que permita calcular cuantitativamente la actividad.
Mtodo de coagulacin de la leche:
Idem al mtodo anterior, no se tiene una relacin lineal entre la concentracin y el tiempo de coagulacin, no
se determina muy bien el punto de coagulacin (principalmente a largos tiempos) por lo que hay que realizar
muchas repeticiones con gran variabilidad.
Mtodo colorimtrico del BAPA:
Este mtodo es usado para medir la actividad de la tripsina, cuya actividad proteoltica bajo estas condiciones
es varias veces superior, por lo que la absorvancia medida en los ensayos fue de valores muy bajos, los que
pueden presentar un cierto error de precisin.
Mtodo de hidrlisis del BAEE:
Permiti obtener resultados proporcionales a la concentracin de enzima as como un ajuste regresional.
Este mtodo fu usado como referencia por su exactitud.
Su inconveniente es que se tiene que realizar un ensayo por vez y su costo es elevado.
BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
AOAC Official Methods of Analysis(1990).
Balls, A.K, and Lineweaver,H. Isolation and properties of crystalline papain. J. Biol. Chem. 130, 699.
(1939)
Beacon Enzyme Assays. Sensitive Protease Assay. http://www.panvera.com/appguide/bcnprot.html.
Bouzas,J. O. & Bertoni, M. (1980). Evaluacin de la actividad antitriptica en productos de soja. Ajuste
del mtodo de sustrato sinttico. Anales Asoc. Quim. Arg., 68, 81-93.
Kakade, M. L; Simons,N and Liener, E. (1969). An evaluation of natural vs synthetic substrates for
measuring the antitryptic activity of soybean. Agricultural Research. Vol 46. P 518-526.
Kakade,M.L, Simons,N and Liener,E; 1969 An evaluation of natural vs. Synthetic substrates for
measuring antitrryptic activity of soybean samples. Agricultural Research. Vol 46. 518-526.
Moreno J, Gianelli M. Purificacin Parcial de enzimas proteolticas a partir de extracto de kiwi y
determinacin de parmetros mximos de actividad. X Seminario latinoamericano y del Caribe de ciencia
y tecnologa de alimentos. 1997. Bs. As
Rugeiro C. 1988 Mamao. Editorial Univ. Pernanbuco.
