INTRODUCCIN

Las formas bacterianas pueden ser examinadas al microscopio de dos maneras:

observando muestras frescas de clulas vivas, y observando clulas muertas teidas con
ciertos colorantes. Las bacterias vivas carecen de color en preparaciones acuosas,
mientras que en preparaciones teidas, aumentan su contraste con el del medio
circundante y se hacen ms visibles, es decir, se logra distinguir claramente la estructura
bacteriana y los tipos morfolgicos existentes.
En microbiologa resultan de uso frecuente para la observacin de microorganismos las
tinciones simples, diferenciales y las tinciones de estructuras. Para el presente informe se
utiliz tinciones simples con colorantes bsicos.
MARCO TERICO
Tincin Simple
Las tinciones se basan en la utilizacin de colorantes que pueden clasificarse como
naturales o sintticos. Los naturales se utilizan principalmente con fines histolgicos.
La mayor parte de los colorantes que se utilizan para teir bacterias son sintticos,
muchos de ellos son las anilinas y los derivados del benceno.
Se habla de coloracin simple cuando una muestra extendida se tie con un solo
colorante. Si la preparacin se tie con safranina, las bacterias adquiriran un color rojo, si
se utiliza azul de metileno, se teirn de azul, si por el contrario se tien con cristal violeta,
las bacterias aparecern teidas de color violeta, es decir adquirirn el color del nico
colorante que se utiliz. Este procedimiento permite distinguir la morfologa y estructuras
internas de la clula bacteriana, como por ejemplo, la presencia de endospora bacteriana.
Existen coloraciones especiales que permiten poner de manifiesto estructuras bacterianas
como por ejemplo: flagelo, cpsula, endosporas, etc.
Colorantes
Sustancias orgnicas coloreadas que se utilizan para colorear otros objetos; solubles en
medio cido, neutro o bsico, que poseen una estructura molecular no saturada, Es decir
son electrnicamente inestables y por eso absorben energa a determinada longitud de
onda, si fueran estables absorberan todas o rechazaran todas.
Los grupos responsables de la absorcin de la luz se llaman:
Cromoforos: Son todos aquellos compuestos que tienen electrones resonando a
determinada frecuencia y por eso absorben y luz al unirse refuerzan la absorcin
de radiacin.
Auxocromos: Son los responsables de la fijacin al sustrato a teir, son capaces
de fijar la molcula del colorante y en algunos casos intensificar la labor de los
cromforos.

CROMOFOROS AUXOCROMOS
Grupo etileno C - C Grupo sulfonico - H2SO4
Grupo carbonilo R - C = O Grupo Carboxlico R - COOH
Grupo nitroso - N = N - Grupo Hidroxilo R OH
Grupo nitro - NO2 Grupo Aminito - NH2
Grupo azo

Cloro Cl2
Grupo azoxi

Bromo Br2
Grupo quinoideo


Colorantes cidos: como por ejemplo la eosina, colorante cargado en forma negativa,
se une a componentes celulares cargados positivamente. Estos componentes cargados
positivamente se denominan acidfilos, porque tienen afinidad por los colorantes cidos.
Por ejemplo, estos colorantes se unen a grupos aminos de las protenas. Estas protenas
pueden pertenecer al citoesqueleto de la clula o hallarse en la matriz extracelular.
Debido al elevado contenido de protenas del citoplasma la eosina es un excelente
colorante citoplasmtico. La eosina se une tambin a las membranas plasmticas, sin
embargo, se desconoce la naturaleza qumica de esta unin. Las clulas que presentan
un gran desarrollo de membranas (muchas mitocondrias, mucho retculo endoplasmtico
liso, etc.) son sumamente acidfilas, o sea, se tien intensamente con la eosina.
Colorantes bsicos: como por ejemplo el azul de metileno, colorante cargado
positivamente, se une a componentes celulares cargados negativamente. Estos
componentes cargados negativamente se denominan basfilos, porque tienen afinidad
por los colorantes bsicos. Por ejemplo, estos colorantes se unen al ncleo y ciertas
regiones del citoplasma.
Como caso particular, la hematoxilina no tiene carga, para teir un tejido se la une a un
mordiente que junto a la hematoxilina forman una laca. La laca es bsica y por lo tanto se
une a cargas negativas de la clula o matriz extracelular.
Colorantes neutros: son colorantes en los que la porcin cida y la bsica colorean.
Tien las partes bsicas de una clula de un color y las partes cidas de otro. Tien el
ncleo de un color y el citoplasma de otro. Ej. El eosinato de azul de metileno.
Colorantes indiferentes: tien aquellas estructuras o sustancias que los disuelven ms
fcilmente que el lquido en que estn preparados. Un ejemplo es el colorante sudan, un
colorante de lpidos.

Agar
El agar, o agar -agar, es un polisacrido que se obtiene de algas del gnero Gelidium,
algas que se han utilizado en la cocina tradicional japonesa, por sus propiedades
gelificantes, desde hace muchos siglos. Tambin se obtiene de otras algas, entre ellas
especies de los gneros Gracillaria, de las que procede actualmente la mayora del agar,
y de Gelidiella y Pterocladia, que aportan pequeas cantidades. El agar de mejor calidad
de obtiene de Gelidium, aunque en los ltimos aos se ha extendido mucho la obtencin a
partir de cultivos marinos de Gracillaria, que son ahora la fuente principal de este
polisacrido. En Espaa se obtiene sobre todo de Gelidium corneum. En el listado de
aditivos alimentarios de la Unin Europea, el agar es el E-406.
El agar se considera formado por la mezcla de dos tipos de polisacridos, la agarosa y la
agaropectina. La agarosa es el componente principal, representando alrededor del 70%
del total. Tanto la agarosa como la agaropectina tienen la misma estructura bsica.
Los geles de agar se forman a concentraciones de menos del 1% de polisacrido, y son
transparentes, duros y quebradizos. Esta ltima propiedad los diferencia de la mayora de
los otros geles de polisacridos, que son ms elsticos. Adems tienen la propiedad
particular de presentar una gran histresis trmica. Es decir, mientras que el gel se forma
(en el caso del agar de Gellidium) a una temperatura de alrededor de entre 30C, volver
de nuevo a la disolucin exige calentar el gel hasta entre 75C y 90C, segn el tipo. Los
geles de agar de Gracillaria presentan los mismos fenmenos, pero menos acusado. Con
esta salvedad, los geles de agar son reversibles trmicamente.
El agar es un polisacrido relativamente caro, por lo que se utiliza en forma limitada, y en
muchas aplicaciones se ha sustituido por el carragenano. Como gelificante, se emplea en
productos crnicos y de pescado de gama alta, para mimetizar la gelatina, que tiene el
inconveniente de fundir a temperatura baja, as como en otros productos "gelatinosos".
Como estabilizante, puede utilizarse en productos lcteos y helados, cambiando con la
goma de algarroba.
Aceite de inmersin
A diferencia del aire, el aceite de inmersin tiene un ndice de refraccin similar al del
vidrio del cubre objetos. Al colocar aceite de inmersin entre el lente frontal del objetivo
(diseado para usarse con aceite de inmersin) y el cubre objetos, el rango angular de los
rayos difractados capturados por los lentes se incrementan y, en efecto, incrementa la A.
N. del objetivo. Los rayos de luz que pasan a travs del espcimen, cubre objetos y el
aceite no se refractan conforme entran al lente pero solamente conforme estos dejan la
parte de arriba de la superficie. Los objetivos que usan agua y/o glicerina como medio de
imagen tambin estn disponibles.
La mayor resolucin ganada a travs del uso de aceite de inmersin habilita a los
usuarios a enfocar objetos muy pequeos que no se resolvera usando objetivos secos.
Los objetivos de aceite inmersin son usados para la observacin objetivos muy
pequeos, como las bacterias individuales y aplicaciones de alta resolucin, como el TIRF
y las aplicaciones de fluorescencia con focal.

PARTE EXPERIMENTAL
Ejercicio N1: Preparacin de una muestra fija de bacterias para tincin.
Previo al desarrollo de una tcnica de tincin, el material a ser observado debe ser fijado
a una lmina de vidrio sobre la cual ha de realizarse la tincin. Si la muestra no es fijada,
tiende a perderse durante el proceso de tincin. El procedimiento de tincin mata al
organismo, coagula el protoplasma celular y provoca su adhesin a la lmina de vidrio.
Materiales:
Muestra conteniendo bacterias (Streptococcus, Escherichia coli, Bacillus).
Asa de klle.
Lmina porta objetos.
Mechero de alcohol.
Piseta de agua.
Procedimiento:
1. Colocar una gota de agua sobre una lmina porta objeto completamente limpia.
Con ayuda del asa de klle colocar sobre la gota una pequea porcin de la
muestra a fijar. Si la muestra que contiene al microorganismo es lquida, puede
aplicarse directamente sin la gota de agua.
2. Distribuir la gota cargada con la muestra en la lmina hasta formar un pelcula
delgada.
3. Secar la lmina o a una razonable distancia sobre la llama del mechero.
4. Cuando la pelcula est seca, pasar la lmina a travs de la llama del mechero
unas tres veces, cuidando que la pelcula est hacia arriba y que la lmina no se
recaliente. La sobreexposicin al calor puede alterar la forma y estructura del
microorganismo. En este proceso se est fijando la muestra.
5. Repetir el procedimiento para 2 muestras ms de distintos microorganismos.

Ejercicio N2: Tincin simple con colorantes bsicos
Constituye una tcnica sencilla y directa que a travs del uso de un colorante, permite
contrastar y diferenciar los microorganismos de su entorno.
Los colorantes bsicos, los cuales se utilizan ms comnmente para teir
microorganismos, difieren en el grado de reactividad con las clulas. De sta manera el
azul de metileno toma de 20 a 30 segundos para lograr una tincin apropiada. El cristal
violeta siendo un poco ms reactivo toma slo 10 segundos. Y la carbolfucsina requiere
tan slo 5 segundos encontrndose como el ms reactivo de stos tres colorantes, es tan
reactivo que puede llegar a dificultar una tincin apropiada.

Materiales:
Lminas fijadas de microorganismos.
Aceite de inmersin
Colorantes: Azul de metileno, Cristal Violeta y Carbolfucsina.
Papel secante.
Piseta de agua.
Soporte para tincin.
Procedimiento:
1. Colocar las lminas fijadas de microorganismos sobre el soporte para tincin.
2. Agregar 5 o 6 gotas de cada colorante dejando actuar por 30 segundos para el
azul de metileno, 10 segundos para el cristal violeta, y 5 segundos para la
carbolfucsina.
3. Una vez cumplido el tiempo para los colorantes, lavar cada lmina con la piseta de
agua.
4. Secar las lminas al aire o dentro del papel secante.
5. Colocar una gota de Aceite de cedro sobre la muestra a examinar.
6. Examinar las preparaciones teidas bajo el lente objetivo de inmersin (100x) de
un microscopio compuesto.

RESULTADOS
Muestra N1: Bacillus











Muestra N2: Streptococcus












Muestra N3: Escherichia coli












DISCUSIONES
Azul violeta, Azul de metilo y Carbolfucsina.
Se logr ver a la bacteria con mucha nitidez. Se observ una imagen saturada Se observ
una imagen saturada.
Antes de teir la bacteria Bacilus cereus se debe fijar la muestra adhirindola al
portaobjetos. Segn Tortora (2007) el proceso de fijacin produce la muerte simultnea de
los microorganismos. Tambin preserva diversas partes de los microbios en su estado
natural con una distorsin mnima. La fijacin se produce al pasar el portaobjetos varias
veces a travs de la llama de un mechero Bunsen.
Tanto el cristal violeta como los otros dos colorantes, son bsicos. Estos son llamados as
por tener como in central a un catin (Pelezar M., 1982). La pared celular del Bacillus
Cereus presenta carga negativa, es por ello que al usar un colorante bsico los iones de
ambos reaccionan entre s, y el colorante se adhiere a la pared celular de las bacterias.
Adems de lo anterior, los tres colorantes empleados contienen un componente llamado
anilina. Segn Gray G. (1961), las bacterias se tien muy intensamente con los colorantes
que poseen este compuesto aromtico ya que contrastan definidamente sobre el fondo
blanco brillante profusamente iluminado.
En el primer ensayo se utiliz el colorante cristal violeta, este pigmento permiti una
buena observacin de la bacteria, logrndose apreciar su forma. El azul de metileno es de
naturaleza similar al cristal violeta, por ello se esperaba un resultado parecido al anterior;
sin embargo, cuando se observ la muestra a travs del microscopio, la imagen que se
observ fue confusa, se logr visualizar al Bacillus, pero la imagen se vea saturada de
estas bacterias. La diferencia entre el resultado del primer y segundo ensayo se debe a
que en el primer caso se tom una cantidad razonable de muestra; en cambio, en el
segundo se cometi la imprudencia de tomar una cantidad grande (ms de lo necesario)
de agar. Respecto a la tincin con carbolfucsina, tambin se extrajo una muestra grande;
por ende, el resultado es parecido al segundo caso, pero este tercer ensayo fue menos
satisfactorio, ya que los dos primeros colorantes produjeron un contraste mayor con el
fondo claro.
CONCLUSINES
* Con los tres colorantes empleados en la prctica se logr observar la morfologa y
asociacin de la bacteria Bacillus. Siendo esta de forma bacilo (cilndrica) y agrupndose
entre s como eslabones de una cadena (Estreptobacilus).
* La cantidad de muestra deber ser representativa y homognea pero no demasiado,
porque se aglomera y su visualizacin en el microscopio es muy difusa.
* La intensidad del teido se debe a los radicales cromforos que presenta la muestra y a
su afinidad con los anillos bencnicos del colorante.
CUESTIONARIO
1. Cules son las asociaciones ms frecuentes en bacterias?
Algunos gneros bacterianos se agrupan de una manera caracterstica. Esta agrupacin
se debe a la tendencia de las clulas hijas a permanecer parcialmente adheridas despus
de la divisin celular.

Los cocos pueden disponerse:
De a pares y se los llama diplococos
Si se disponen en cadena se llaman estreptococos
Cuatro clulas esfricas conforman una ttrada
En forma de racimo o irregular se llaman estafilococos
En paquetes cbicos se denominan sarcinas

Los bacilos pueden disponerse:
Aislados
Adosados a lo largo, de forma paralela formando una agrupacin en empalizada
(Haemophilus)
Pueden quedar adheridos por sus extremos y tomar apariencias de letras chinas
(Corynebacterium)



De izq. a der.: cocos Gram positivos, bacilos Gram negativos, Vibrio, espiroqueta.

2. En qu rango de tamao se define las bacterias?

Las bacterias son los microorganismos de vida libre de menor tamao que existen en la
naturaleza, algunas son tan pequeas que se considera que tienen el mnimo tamao
posible para ser una forma de vida independiente. El tamao se mide en micrmetros,
m, para microorganismos ms pequeos se usa el nanmetro, nm. Las
bacterias esfricas se miden por el dimetro, y la gran mayora tienen un dimetro que
vara entre 0,2 y 2 m. Las bacterias alargadas se miden por el largo y el ancho y la
mayora de ellas tienen un ancho de 0,2 a 2 m por 1 a 15 m de largo.
Las bacterias espiraladas se miden por la longitud total, la amplitud de la espira y la
profundidad de la misma.
Existen bacterias cuyo tamao est en el extremo inferior de la escala, son las rickettsias,
clamidias y micoplasmas, su tamao es similar al de los virus ms grandes, los poxvirus.
En el otro extremo de la escala, hay algunas bacterias alargadas que tienen una longitud
semejante al dimetro de una clula eucariota, por ejemplo, los lactobacilos tienen un
largo que puede superar al dimetro de un eritrocito.

3. Cules son las formas bacterianas ms frecuentes?

a) Esfricascocos







b) Alargadasbacilos

c) Espiral.espirilos

d) Marcadamente espiraladasespiroquetas





e) Alargadas con curvatura..vibriones

f) Ovoidescocobacilo

4. Qu diferencia a una tincin directa de una tincin negativa?
La tincin directa se da mediante el uso de colorantes, generalmente orgnicos, que
tengan algn tipo de afinidad con los materiales celulares, es decir, este tipo de tincin se
da sobre la clula en s.
Mientras, La tincin negativa es el reverso del procedimiento de tincin usual: las clulas
se dejan sin teir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por
tanto, es el perfil de las clulas. La sustancia utilizada para la tincin negativa es un
material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente
rodea las clulas, tal como la tinta china (que es una suspensin de partculas de carbono
coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua).
5. Qu importancia le atribuye a las diferencias en reactividad de los
colorantes empleados?
A que el uso de diversos colorantes nos permite apreciar la forma y la agrupacin de las
diferentes clulas teidas con mayor nitidez, cada tipo con un determinado colorante.
6. Cul es la funcin del aceite de cedro?
La funcin del aceite de inmersin es restringir el movimiento de la muestra, adems de
evitar el rozamiento entre el cubre objetos y el objetivo, generalmente se lo utiliza cuando
vamos a observar con el objetivo 100x. Otra funcin del aceite de inmersin es evitar que
la luz se desve; al contrario lo que se pretende es que la luz llegue concentrada hacia la
muestra.
7. Cul es la funcin del lente objetivo de inmersin?
Consiste en la disminucin o eliminacin de la refraccin de los rayos luminosos entre el
aire y el objetivo, en consecuencia la luminosidad de la imagen est aumentada. El
empleo de la inmersin aumenta el ngulo de apertura del objetivo y permite mayor
resolucin gracias a la captura de una mayor cantidad de rayos luminosos refractados y
solo puede utilizarse con objetivos de mayor aumento.
BIBLIOGRAFA
* GRANADOS PREZ, R. 1997. Microbiologa. Editorial Paraninfo. Madrid (Espaa)
* PELEZAR; REID; CHAN. 1982. Microbiologa. Cuarta edicin. Editorial Mc Graw Hill.
Mxico.
* RODRIGUEZ; HERNANDEZ, F. Bacteriologa General: Principios y prcticas de
laboratorio. Editorial Universidad de Costa Rica.
* TORTORA; FUNKE; CASE. 2007. Introduccin a la Microbiologa. Novena Edicin.
Editorial Mdica Panamericana S.A. Argentina.