Electroforesis capilar
LUIS ENRIQUE MENDOZA
POSTGRADO EN INGENIERA BIOMDICA
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
MRIDA VENEZUELA
NOVIEMBRE 2006
Electroforesis capilar
AGENDA
RESUMEN
TIPOS DE ELECTROFORESIS
EQUIPO DE ELECTROFORESIS CAPILAR EN ZONA
SEPARACIN DE MUESTRAS
FENOMENOS DE DISPERSIN
ELECTROFEROGRAMA
VENTAJAS-DESVENTAJAS
Electroforesis capilar
RESUMEN
El termino electroforesis se emplea para describir la
migracin de partculas cargadas bajo la accin de un
campo elctrico. La electroforesis constituye una
tcnica
de
separacin
basada
en
diferentes
velocidades (movilidad) de un conjunto de solutos
(sustancia),
sometidos a la accin del campo
elctrico.
Electroforesis capilar
TIPOS DE ELECTROFORESIS
Cromatografa electrocintica micelar (MEKC).
Isotacoforesis.
Isoelectroenfoque.
Electroforesis capilar en gel (CGE).
Electroforesis capilar en zona (CZE).
Electroforesis capilar
COMPONENTES BSICOS EC.
http://mazinger.sisib.uchile.cl
Electroforesis capilar
CROMATOGRAFA ELECTROCINTICA MICELAR
(MEKC).
la separacin es basada en la afinidad de los analitos entre
micelas tensioactivo (anionicos,cationicos) - electrolito.
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Electroforesis capilar
ISOTACOFORESIS.
Electroforesis igual velocidad., la sustancia es ordenada segn su
movilidad. Separa solo una sustancia
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Electroforesis capilar
ISOELECTROENFOQUE.
La separacin es basada en el punto
Isoelectrico de cada analito.
Especies anfteras (glicina).
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Electroforesis capilar
ELECTROFORESIS CAPILAR EN GEL
La separacin es basada en el tamao de las molculas.
Polmeros (monmeros-molcula qumica sencilla).
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Electroforesis capilar
ELECTROFORESIS CAPILAR EN ZONA
Separacin en funcin carga/masa.
Separacin de iones + y -.
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Electroforesis capilar en zona
POR QUE UTILIZAR ?
Una tcnica de separacin de sustancias basado en las
caractersticas de sus velocidades (movilidad) de un conjunto de
solutos (sustancia), sometidos a la accin del campo elctrico.
Requiere una cantidad de muestra relativamente pequea.
Tambin por su gran versatilidad y simplicidad de operacin.
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COMPONENTES DEL DISPOSITIVO:
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CAPILAR
Capilar de slice.
Dimetro interno de 25-100 m.
Cobertura de polimida.
Permeabilidad a la luz ultravioleta y visible.
Qumicamente y elctricamente estable.
Longitud 50-100 cm.
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FUENTE DE PODER
La migracin empieza una vez se aplica el voltaje.
Corriente 10-200 A.
Tensin 20-40Kv constantes, con el fin de obtener
una alta reproducibilidad en los tiempos de
migracin.
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ELECTRODOS Y VIALES
Electrodos de platino, tefln o carbn.
Viales, llamados recipientes electrodicos.
Material cristal.
Electrodo platino.
lavallab.kcentric.net/images/platinum
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SISTEMA DE DETECCIN
Se utiliza el detector UV-vis.
Deteccin en columna.
Debe eliminarse polimida del capilar.
Longitud de la onda aprox 240nm.
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ELECTROLITOS
Citrato 3.06pKa (movilidad), Frmaco, analgsico.
Citrato 5.40pKa.
Fosfato 2.12pKa, PH 2.5.
Borato 4.75pKa, PH 9.3.
Acetato 4.75pKa. PH 5.5-6.5.
El PH del electrolito es clave en la separacin, ya
que determina el grado de movilidad de los diferentes
analitos.
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MUESTRA
Preparacin de 0.1-10nL.
Muestras: vino, sustancia qumica, tejido.
Los tintes deben tener un espectro de excitacin y
emisin en relacin con la longitud de onda del
infrarrojo.
Tintes fluorescentes: plata, cromo, bromuro de etidio.
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TIEMPO DE ANLISIS
Aplicacin de la muestra aprox 10-30 segundos.
Tiempo de total aprox 20-30 minutos.
Tiempo muerto depende de la sustancia.
Tiempo muerto: es el tiempo en el cual no se produce
respuesta alguna.
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INYECCIN DE LA MUESTRA
Inyeccin hidrodinmica: se basa en introducir la
muestra por diferencia de presin.
Efecto sifn
inyeccin de presin.
Vacio.
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INYECCIN DE LA MUESTRA
Inyeccin electrocintica: se basa en la diferencia
de potencial entre los extremos del capilar.
La cantidad de iones depende de la movilidad de
ellos.
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DETECCIN DE PICOS
Deteccin de picos debido a la absorbancia
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ELECTROFEROGRAMA
Representacin grafica de la concentracin de cada
una de las sustancias presentes en la muestra.
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PRINCIPIO DE SEPARACIN
La pared del capilar esta constituida por un
entramado grupo de silanol Si-OH, esto hace que el
capilar inicialmente este cargado
negativamente,
silanoato Si-O en sus paredes, los H y otras cargas
positivas libres se siten cerca de las cargas
negativas de la pared formado una doble capa.
Capilar con la pared cargada negativamente
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PRINCIPIO DE SEPARACIN
Flujo electrofortico: Es producido por la carga
elctrica de cada partcula existente en el interior del
capilar, y por lo tanto produce el efecto doble capa.
Capilar con pared cargada -
Efecto doble capa
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PRINCIPIO DE SEPARACIN
Flujo electroosmtico: flujo debido a la fuente de
tensin.
Flujo total: flujo electroosmtico flujo electrofortico.
la propia carga de un
soluto hace que ste
muestre una movilidad
por si mismo.
Flujo total
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SEPARACIN DE ANALITOS
Se basa en las diferentes movilidades electroforticas
de los solutos inicos que harn que los analitos
migren a travs del capilar y lleguen a detector a
diferentes tiempos.
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SEPARACIN DE ANALITOS
La movilidad electroosmotica es mayor que la
electrofortica
haciendo que sea posible separar
aniones y cationes en una sola inyeccin de la
muestra.
Las partculas neutras son separadas debido a que no
poseen movilidad electrofortica.
Flujo electroosmtico
Flujo electrofortico
flujo total = F. eletroforetico + F. eletroosmtico
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FENOMENO DE DISPERSIN
Las causas de dispersin son mltiples y afectan de
manera relevante a la separacin.
Debido a la inyeccin de la muestra.
Debido a la separacin.
Debido a la deteccin.
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FENOMENO DE DISPERSIN
Debido a la inyeccin de la muestra
La inyeccin debera hacerse en columna.
Ensanchamiento del pico
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FENOMENO DE DISPERSIN
Debido a la separacin de la muestra
Difusin entre el tampn-analito (ensanchamiento de
Ideal
pico).
real
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FENOMENO DE DISPERSIN
Debido a la separacin de la muestra
Absorcin de analitos, debida a la carga negativa del
capilar.
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FENOMENO DE DISPERSIN
Debido a la deteccin de la muestra
Asimetra de la diferentes movilidades (ensanchamiento
basa del pico).
Dispersin por deteccin
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FENOMENO DE DISPERSIN
Debido a la deteccin de la muestra
Tailing.
Frinting.
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FENOMENO DE DISPERSIN
Debido a la variacin de PH del tampn
El PH afecta de forma importante a la movilidad.
Variacin con PH aumentado
movilidad dependiente del PH
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FENOMENO DE DISPERSIN
Debido a la deteccin.
Depende del diseo del detector.
Tiene poco efecto en la dispersin.
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FENOMENO DE DISPERSIN
Solapamiento de picos
Debido a la movilidad de las partculas.
Calibracin del detector.
Capilares mal preparados.
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DISMINUCIN DEL TIEMPO
Debido a la temperatura
Disminucin
del
tiempo
de
anlisis
cuando se eleva la temperatura 25 -150 grados
centgrados.
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VENTAJAS
Mejor disipacin de calor.
Automatizacin sencilla, rpida.
Inyeccin de volmenes de
muestras pequeos.
Disminucin del tiempo de anlisis.
Desventaja: la vulnerabilidad a el cambio de sus componentes.
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VENTAJA O DESVENTAJA
Depende de la aplicacin y de la muestra.
Variacin de PH
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APLICACIONES
Farmacuticos.
Clnicos.
Bioqumicas.
Alimentarios.
Ambiental.
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ELECTROFEROGRAMAS
Electroferogramas datos originales
Electroforesis capilar en zona
BIBLIOGRAFIA
http://www.ce-resources.com/cecon.html
BRAITHWAITE, A. y SMITH, F.J., "Chromatographics
Methods",5th ed., Chapman & Hall, London, 1996.
VALCRCEL CASES, M. y GMEZ HENS, A., "Tcnicas
Analticas de Separacin", Revert, Barcelona, 1990
www.uclm.es
www.interscience.wiley.com
PREGUNTAS?
GRACIAS
