E.
COLI 0157 H7
Introduccin
Desde hace ms de dos dcadas, Escherichia coli productor de toxina Shiga
(STEC) es considerado un patgeno emergente transmitido por alimentos
asociado a casos espordicos y brotes de diarrea, colitis hemorrgica (CH) y
sndrome urmico hemoltico (SUH). Escherichia coli O157:H7 es el prototipo
de ms de 150 serotipos que comparten el mismo potencial patognico. Las
cepas STEC asociadas a enfermedades severas en el hombre pertenecen a
la categora de E. coli enterohemorrgico (EHEC) (Levine, 1987; WHO,
1997).
Si bien E. coli O157:H7 fue el primer serotipo reconocido en 1982 como
agente causal de brotes (Riley et al., 1983), otros serotipos no-O157 como
O18, O26, O111 y O128 fueron descriptos en nios con diarrea y aislados
por Konowalchuck en 1977. A partir de esos estudios y durante toda la
dcada del 80, otros serotipos fueron asociados a enfermedad humana
incluyendo: O4:H-, O45:H2, O111:H- y O145:H- en Estados Unidos (Tzipori et
al.,1988), O4:H5 y O111:H2 en Australia (Gunzgurg et al. 1988), O5:H-,
O26:H11, O55:H7, O103:H2, O104:H2, O153:H25 y O163:H19 en Inglaterra
(Scotland et al.,1988; Dorn et al., 1989).
Dentro del grupo STEC, E. coli O157:H7 es el serotipo aislado ms
frecuentemente y es al que se le atribuye la ocurrencia de la mayora de los
grandes brotes como el de la Costa Oeste de Estados Unidos en 1993
(Barret et al., 1994) y el de Japn en 1996 (Watanabe et al., 1996). Las
cepas STEC no-O157 no tienen una caracterstica bioqumica que los
distinga del resto de los E. coli, a diferencia de lo que ocurre con O157 que
no fermenta el sorbitol y no posee actividad de -glucuronidasa. Por lo
tanto, para su aislamiento se requiere la aplicacin de estrategias ms
complejas. Si bien la mayora de los estudios estn orientados a la deteccin
de E. coli O157, en la actualidad han aumentado los esfuerzos para la
deteccin de los diferentes serotipos de STEC.
Escherichia coli O157:H7
La Escherichia coli O157:H7 es una de las cientos de cepas de la Escherichia
coli. Aunque la mayora de las cepas son inocuas y viven en los intestinos de
los seres humanos y animales saludables, esta cepa produce una potente
toxina y puede ocasionar enfermedades graves como el sndrome urmico
hemoltico.
La Escherichia coli O157:H7 fue reconocida inicialmente como causa de
enfermedad en 1982 durante un brote de diarrea aguda con sangre en EE.
UU. Se determin que el brote se deba a hamburguesas contaminadas.
Desde entonces, la mayora de las infecciones han provenido de comer
carne de vacuno picada insuficientemente cocinada. El escritor Robin Cook
escribi una novela sobre el tema titulada Toxina.
En 1996, cerca de Seattle se produjo un brote a causa de esta bacteria, que
se encontr en botellas de zumo de manzana de la marca Odwalla. Muchas
personas, entre ellas bebs y nios, murieron despus de tomar este zumo.
La bacteria entr en las botellas porque las manzanas que se exprimieron
contenan excrementos de venados de la zona y no hubo ningn tipo de
pasteurizacin.
Se diferencia de las otras Escherichia coli en que no fermenta el sorbitol, no
crece a 44 C y no produce -glucoronidasa. La combinacin de letras y
nmeros en el nombre de la bacteria se refiere a los marcadores antignicos
especficos que se encuentran en su superficie y la distingue de otros tipos
de Escherichia coli:
El antgeno somtico O, proveniente del lipopolisacrido de la pared
celular;
El antgeno flagelar H, compuesto por 75 polisacridos.
El grupo de riesgo comprende prcticamente a todas las personas,
inmunocompetentes o no. Los nios menores de 5 aos de edad con
problemas de alimentacin, as como los ancianos son los ms susceptibles
de sufrir complicaciones graves.
Factores intrnsecos y extrnsecos
Las clulas de Escherichia coli O157:H7, son resistentes a temperaturas de
refrigeracin y congelacin, y se destruyen solamente cuando son
sometidas a temperaturas superiores a 71C.
La capacidad de supervivencia en pH cido ha sido estudiada por algunos
investigadores. Ensayos realizados con mayonesa industrializadas con pH
entre 3,6 y 3,9, mantenidas a temperaturas de 5 C y 20 C, concluyeron
que la E. coli O157:H7 tiene la capacidad de sobrevivir ms tiempo a 5 C
(34 a 55 d) que a 20 C (8 a 21 d) Tambin se observ que el
microorganismo se mantiene bien en mayonesa y en salsas base de
mayonesa a 7 C y a 25 C y por lo tanto esos. La Escherichia coli O157:H7
se mantiene viable en alimentos cidos por 35 das, si son conservados en
refrigeracin.
Factores de Virulencia
Toxinas (LPS (endotoxinas), Shiga, LT, ST).
Plsmido transmisibles
Adhesinas (fimbria tipo 1, fimbria P y adhesina X).
Hemolisina (exotoxinas)
Bacteriocinas
Intercambio gentico por transduccin y conjugacin.
AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION DE Escherichia
coli O157
a) Evacuacin espontnea: Recolectar 2 g de materia fecal con una
esptula y colocarla en un recipiente estril. La muestra debe
permanecer refrigerada a 4C hasta su procesamiento. Si la muestra
no es procesada dentro de las 2 horas de recolectada, deber ser
colocada utilizando un hisopo estril en un medio de transporte (CaryBlair, Stuart, Amies o solucin salina tamponada con glicerol). Si el
procesamiento se efecta dentro de los 2-3 das, el medio de
transporte deber ser conservado refrigerado a 4C. Si el espcimen
no es analizado en ese lapso de tiempo deber mantenerse
congelado a -70C.
b) Hisopado rectal: Tomar la muestra con hisopo, conservarlo en un
medio de transporte y mantenerlo refrigerado hasta su
procesamiento. Si el nio usa paal, tomar la muestra que queda en
el mismo con hisopo o con esptula.
Medios
Agar Mac Conkey sorbitol (SMAC)
Caldo tripticasa de soja (CTS)
CTS con cefixima 0,05 mg/l (medio) y telurito de potasio 2,5
mg/l (medio)
Materiales y equipamiento
Estufa de cultivo a 37C
Ansas de rulo
Procedimiento
1. Realizar la siembra de la materia fecal en SMAC, en forma directa y
luego del enriquecimiento en CTS (a 37C por 6h) y en CT-CTS (a 37C
por 6 h).
2. Incubar las placas de SMAC (a 37C por 18 h).
3. Observar morfologa y caractersticas fenotpicas de las colonias
aisladas en las placas de SMAC.
Realizar el diagnstico presuntivo de E. coli O157 de las colonias no
fermentadoras de
Sorbitol por aglutinacin en lmina con antisuero anti-O157 o reactivo
de ltex (Ver
Procedimiento de Serotipificacin).
4. Tomar una muestra de la zona de crecimiento confluente de las
placas SMAC y de las colonias presuntivas para extraccin de ADN y
posterior realizacin de la tcnica PCR multiplex stx1/stx2/rfbO157.
5. Realizar la confirmacin bioqumica de Las colonias presuntivas con
seal positiva para stx1 y/o stx2 y/o rfbO157 por PCR multiplex.
6. Determinar el fenotipo enterohemoltico de las colonias presuntivas
y/o de los aislamientos stx positivos.
7. Confirmar la fermentacin de sorbitol en tubo y determinar la
actividad de la enzima -glucuronidasa (-glu) de los aislamientos.
8. Realizar la biotipificacin de las cepas E. coli O157 por la
fermentacin de los azcares rafinosa, dulcitol y ramnosa.
9. Determinar la movilidad de la cepa aislada utilizando el medio de
Craigie. Si la cepa es mvil, se deber determinar el antgeno flagelar
H.
10.Determinar la sensibilidad de las cepas STEC a los antimicrobianos.
11. Detectar los marcadores de virulencia accesorios de cepas STEC, eae
y EHEChlyA por PCR.
12. Detectar la produccin de Stx por ensayos de citotoxicidad especfica
en clulas Vero.
Comentarios
El agregado de cefixima y telurito de potasio al medio de enriquecimiento
proporciona mayor sensibilidad y especificidad en la recuperacin de STEC
O157.
Se pueden aplicar mtodos inmunocromatogrficos para la deteccin
rpida de STEC O157 a partir del medio de enriquecimiento.
La mayora de las cepas STEC O157 no fermentan el sorbitol en 24 horas. En
la placa de SMAC desarrollan colonias pequeas, incoloras y translcidas. En
cambio, microorganismos fermentadores de sorbitol, desarrollan colonias
pequeas y rosadas.
Es importante comunicar inmediatamente al mdico (a las 24 horas de
realizado el coprocultivo) la presencia presuntiva de E. coli O157 asociado a
un caso de diarrea con o sin sangre, o colitis hemorrgica, para vigilar la
probable evolucin a SUH mediante parmetros bioqumico-clnicos, y el
control del grupo familiar.
Se debe tener en cuenta que el suero anti-O157 da reaccin cruzada con
cepas de Escherichia hermanii. Cuando se observan colonias no
fermentadoras de sorbitol con seroagrupamiento positivo con el antisuero
anti-O157 se debe realizar la diferenciacin bioqumica entre E. coli y E.
hermanii.
PCR multiplex se utiliza como tcnica de tamizaje para detectar los genes
stx1, stx2 y rfbO157.
Si se obtiene seal positiva por PCR multiplex de la zona confluente se
deber identificar la colonia positiva correspondiente. Para tal fin, realizar
PCR de colonias aisladas. Si no se observan colonias tpicas, realizar un
nuevo aislamiento de la zona de cultivo confluente de la cual se obtuvo
seal positiva.
Dado que existe relacin entre la produccin de Stx y de enterohemolisina
(EHEC-Hly), se considera que la deteccin de EHEC-Hly puede ser un
marcador til para seleccionar rpidamente probables cepas STEC.
La determinacin de la actividad de la enzima -glucuronidasa es utilizada
como marcador bioqumico para diferenciar las cepas de E. coli O157, que
no presentan actividad -glu, de otras cepas de E. coli.
La deteccin del antgeno H requiere de una estimulacin previa de la
movilidad de la cepa mediante varios pasajes en el medio de Craigie.
El antgeno H7 puede detectarse por aglutinacin en lmina y/o por PCR
utilizando oligonucletidos especficos que amplifican un fragmento del gen
fliCh7.
La tcnica de amplificacin no requiere de la estimulacin previa de la
movilidad.
DETECCIN DE ESCHERICHIA COLI O157:H7 EN CARNE PICADA
FRESCA Y HAMBURGUESAS CONGELADAS
Las muestras de carne picada fresca fueron trituradas:
Se realiz un enriquecimiento de 25 g del alimento en 225 ml de
caldo EC modificado (Biokar BK149) con el agregado de 20 g/ml de
novobiocina
Se incub a 42 C durante 6 h. Luego se utiliz el test de
concentracin por inmunocaptura de acuerdo a las especificaciones
del fabricante, que consisti en capturar las cepas de E. coli O157
presentes en una alcuota (4 ml) del caldo de enriquecimiento de la
muestra con un hisopo que posee anticuerpos anti-O157 purificados
en su superficie.
Se incub a 41-43 C durante 30 a 40 min, se efectu un lavado del
hisopo y se transfiri a un medio de cultivo provisto, en el cual E. coli
O157 capturados se multiplicaron hasta niveles detectables. Para ello
se incub a 41-43 C por 4 h.
El caldo se agit en vrtex por 20 segundos para liberar a E. coli
O157 y posteriormente se aisl en agar Mac Conkey sorbitol con el
agregado del suplemento selectivo cefixima- telurito en una
proporcin de 50 ng/ml y 25 mg/ml, respectivamente. Ambos medios
se incubaron a 37 C durante 18 h.
Las colonias presuntivas aisladas, en su mayora del medio
cromognico, fueron caracterizadas bioqumicamente previa
coloracin de Gram con las pruebas de agar- hierro-tres azcares
(TSI), citrato, utilizacin de triptofano, rojo de metilo, ortonitrofenil
-galactopiransido (ONPG) y glucuronidasa.
Fundamento y procedimientos para pruebas bioqumicas
a) Agar hierro tres azcares (TSI)
Fundamento:
Determina la capacidad de un microorganismo de fermentar los
hidratos de carbono presentes en el medio de crecimiento bsico con
produccin o no de gas. La fermentacin provoca acidificacin del
medio con viraje del indicador (rojo de fenol) al amarillo.
Permite detectar la produccin del sulfuro de hidrgeno por
ennegrecimiento del medio debido a la formacin de sulfuro ferroso.
Tcnica:
Inocular la superficie del pico de flauta con estra y el fondo por
puncin.
Incubar a 37C.
Efectuar la lectura luego de 18-24 h de incubacin.
Interpretacin:
Fermentacin de azcares:
Las reacciones que pueden observarse son:
Pico alcalino (rojo) / fondo alcalino (rojo). No hay fermentacin de
azcares.
Pico alcalino (rojo) / fondo cido (amarillo). Glucosa fermentada. Lactosa y
sacarosa no fermentadas.
Pico cido (amarillo) / fondo cido (amarillo). Glucosa fermentada. Lactosa
y/o sacarosa fermentadas.
Produccin de gas:
Se evidencia por la aparicin de burbujas o fragmentacin del medio.
Sulfuro de hidrgeno:
Se evidencia por el ennegrecimiento del medio.
b) Utilizacin de Citrato
Fundamento:
Determina si un organismo es capaz de utilizar citrato como nica fuente
de carbono para el metabolismo, produciendo alcalinidad. El medio Citrato
de Simmons contiene tambin sales de amonio inorgnicas. Un organismo
que es capaz de utilizar citrato como nica fuente de carbono, utiliza
tambin las sales de amonio como su nica fuente de nitrgeno. Las sales
de amonio se desdoblan en amonaco con la consiguiente alcalinidad. El
indicador de pH usado es el azul de bromotimol, el cual en medio alcalino
toma un color azul intenso, indicando una prueba positiva. El medio no
inoculado tiene color verde.
Tcnica:
Inocular la superficie del pico de flauta con estra y el fondo por
puncin.
Incubar a 37C durante 48 h (a veces se requiere incubacin ms
prolongada).
Interpretacin:
Prueba positiva: desarrollo de color azul
Prueba negativa: el medio conserva el color verde original y hay ausencia
de desarrollo bacteriano.
c) Sulfuro, indol, movilidad (SIM)
Fundamento:
Permite detectar la produccin del sulfuro de hidrgeno por
ennegrecimiento del medio debido a la formacin de sulfuro ferroso.
Permite detectar la produccin de indol, producto de la degradacin
metablica del aminocido triptofano. Las bacterias que poseen la enzima
triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con
produccin de indol, cido pirvico y amonaco. El indol desdoblado de la
molcula de triptofano puede ser detectado cuando reacciona con el grupo
aldehdo del para-dimetilamino benzaldehdo del reactivo revelador
(reactivo de Kovacs), formndose un complejo de color rojo.
Determina si el microorganismo es mvil por migracin a partir del lugar de
siembra y se disemina en el medio provocando turbidez.
Tcnica:
Sembrar por puncin nica en la regin central del tubo, utilizando
una aguja recta hasta una profundidad de 2/3 del medio.
Incubar a 37C durante 18-24 h.
Agregar 2 3 gotas del reactivo de Kovacs para deteccin del indol.
Interpretacin:
Sulfuro de hidrgeno:
Prueba positiva: Se observa ennegrecimiento del medio.
Indol:
Prueba positiva: color rojo fucsia en la interfase del reactivo y el medio.
Prueba negativa: no hay modificacin del color en la interfase del reactivo
y el medio.
Movilidad:
Prueba positiva: Se visualiza turbidez parcial o total del medio.
Prueba negativa: Hay crecimiento bacteriano solamente en la lnea de
siembra.
d) Fermentacin de hidratos de carbono (Medio Rojo Fenol)
Fundamento:
Se produce el viraje del color del indicador si el microorganismo tiene la
capacidad de fermentar el hidrato de carbono presente en el medio.
Tcnica:
Sembrar una ansada del aislamiento en 1ml de medio rojo fenol con
hidrato de carbono especfico al 1%.
Incubar a 37C durante 18-24 h.
Para todos los azcares se deben realizar lecturas diarias durante 7
das, con la excepcin del sorbitol que se debe efectuar a las 24 h.
Interpretacin:
Prueba positiva: Se observa viraje del indicador al amarillo.
e) Lisina, Hierro, Agar (LIA)
Fundamento:
Detecta la capacidad de un microorganismo de decarboxilar la lisina. Las
decarboxilasas son un grupo de enzimas capaces de actuar sobre los grupos
carboxilo de los aminocidos produciendo aminas, de reaccin alcalina.
Cada una de las decarboxilasas es especfica para un aminocido. La lisina
puede ser decarboxilada transformndose en cadaverina. Esto produce un
viraje del indicador prpura de bromocresol al violeta. Como la
decarboxilacin slo tiene lugar en medio cido (pH inferior a 6), es
necesario que se produzca previamente la acidificacin del medio de
cultivo, por fermentacin de la glucosa. Por este motivo este medio de
cultivo slo debe utilizarse para la diferenciacin de cultivos que fermentan
la glucosa. Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa pero
que son fermentadores de la glucosa, producen un viraje del medio al
amarillo. La incubacin de 24 h ocasiona una alcalinizacin en la superficie
del medio de cultivo y consecuentemente un viraje del pico al color violeta.
Las cepas Proteus y Providencia, con excepcin de algunas cepas de
Morganella morganii, desaminan la lisina y producen cido alfa-cetocarbnico.
Este ltimo, con la sal de hierro y por la influencia de oxgeno forma
combinaciones pardo-rojizas en la regin superficial del medio de cultivo.
Permite detectar la produccin del sulfuro de hidrgeno por
ennegrecimiento del medio debido a la formacin de sulfuro ferroso.
Tcnica:
Inocular la superficie del pico de flauta con estra y el fondo por
puncin.
Incubar a 37C durante 18-24 h.
Interpretacin:
Decarboxilacin de la lisina:
Prueba positiva: pico violeta / fondo violeta
Prueba negativa: pico violeta / fondo amarillo
Desanimacin de la lisina:
Prueba positiva: pico pardo rojizo / fondo amarillo
Sulfuro de hidrgeno:
Prueba positiva: Se observa ennegrecimiento del medio.
