UNIVERSIDAD ESTATAL PENNSULA DE SANTA ELENA
FACULTAD DE CIENCIAS DEL MAR
ESCUELA DE BIOLOGA MARINA
2017-I
Informe esterilizacin de materiales de vidrio para prcticas de laboratorio en
microbiologa.
Autor
JOSE GABREIEL FREIRE VELAZQUE
LUIS VICENTE MOSCOSO MONSERRATE
Carrera de Biologa Marina.
Facultad de Ciencias del Mar
Universidad Estatal Pennsula de Santa Elena (UPSE)
Campus La Libertad, va principal Santa Elena La Libertad
La Libertad-Ecuador
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FACULTAD DE CIENCIAS DEL MAR
ESCUELA DE BIOLOGA MARINA
2017-I
Tema:
Esterilizacin de materiales de vidrio para prcticas de laboratorio en microbiologa.
Objetivo:
Poner en prcticas los procedimientos de esterilizacin de los diversos recipientes de
vidrio a utilizarse en la prctica de microbiologa.
Introduccin:
La esterilizacin es un mecanismo por el que se consigue la muerte o eliminacin de todos
los microorganismos vivos de una muestra, medio, superficie o material de trabajo. Entre
los microorganismos vivos se incluyen bacterias, hongos, protistas, virus y sus formas de
resistencia. Un objeto esterilizado est, por lo tanto, totalmente libre de microorganismos
incluyendo sus formas de resistencia. No hay que confundir la esterilizacin con la
desinfeccin en la que no se eliminan todos los microorganismos, sino nicamente
aquellos que pueden causar enfermedad o efectos deletreos sobre los productos en los
que se encuentran. Un objeto desinfectado, por lo tanto, no est estril, (Leahy, 1999).
Calor hmedo
La esterilizacin en autoclave es un mtodo comn y efectivo que permite elaborar
cultivos absolutamente puros de rizobios, (Strijdom y Jansen van Rensburg, 1981;
Williams, 1984). Sin embargo, como cualquier metodologa puede presentar desventajas.
Por una parte, aumentara los costos de produccin debido a consumo de electricidad o
gas, y, por otro lado, un calentamiento excesivo del soporte podra provocar a la
formacin de compuestos txicos para los rizobios, (Roughley, 1970; Strijdom y Jansen
van Rensburg, 1981).
El calor hmedo por medio de utilizacin de vapor de agua es el agente esterilizante ms
frecuentemente utilizado. Este mecanismo destruye eficazmente los microorganismos por
desnaturalizacin de protenas y enzimas, y desestabilizacin de membranas. La
esterilizacin con calor hmedo, se utiliza principalmente con la autoclave. La autoclave,
desarrollado por CHAMBERLAND en 1884, es un aparato constituido por una caldera,
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que se puede cerrar hermticamente con una tapa metlica y que presenta una resistencia
elctrica en su interior (antiguamente por gas) que calienta el agua. Este aparato permite
que en el interior de la caldera se desplace el aire por una vlvula de purga, dejando que
se acumule posteriormente vapor saturado a presin, que alcanza temperaturas superiores
a los 100C sin que se produzca ebullicin, (Block, 2001).
El autoclave se puede utilizar para la esterilizacin de medios de cultivo ya sean slidos
(agares) o lquidos, soluciones, material de vidrio, gomas o ciertos tipos de plsticos
(policarbonato o polipropileno), acero inoxidable y tambin material de trabajo como
ropas, algodn, gasas, etc. Tambin es un mecanismo que se utiliza para esterilizacin
final de medios de cultivo.
La esterilizacin con calor hmedo puede causar corrosin de algunos materiales, por lo
tanto, no ser el mtodo a elegir cuando esto sea un problema. Tambin se debe tener en
cuenta que, en el proceso de esterilizacin de medios, puede bajar el pH entre 0,3 y 0,5
unidades, puede caramelizar azcares y algunos compuestos voltiles se pueden destruir
durante el proceso. Los procesos de esterilizacin largos pueden producir una
precipitacin de sales, (Chamberland, 1884).
Calor seco
La esterilizacin puede llevarse a cabo mediante calor seco y en este caso se realiza en
una estufa denominada horno Pasteur en cuyo interior se disponen los materiales que van
a ser esterilizados debidamente protegidos con papel satinado, o en contenedores
especiales para evitar la contaminacin ambiental una vez finalizado el proceso y hasta
su utilizacin. La destruccin microbiana se produce por oxidacin de los componentes
celulares y desnaturalizacin de protenas. Este es un proceso menos eficaz por la
ausencia de agua y por lo tanto deben incrementarse tanto las temperaturas como los
tiempos de exposicin, (Leahy; Kerry; Christopher, 1999).
El horno Pasteur se utiliza para esterilizar productos u objetos de porcelana o vidrio como
pipetas, probetas, embudos, y generalmente aquellos materiales metlicos que no se
pueden esterilizar en autoclave por problemas de corrosin y tambin fluidos oleaginosos.
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En general material o medios que resisten las temperaturas ms elevadas que se utilizan
en este aparato, (Lewis, 2002).
Filtracin
Las aplicaciones de la esterilizacin por filtracin son diversas en el campo de la
microbiologa, se puede aplicar para eliminar microorganismos de soluciones, fluidos o
gases o para la esterilizacin del ambiente de trabajo, en todos los casos los
microorganismos no son destruidos sino que son retenidos fsicamente o adsorbidos por
los filtros con un tamao de poro adecuado. El tamao de poro que se considera en la
actualidad esterilizante es el de 0,22 m, aunque ms recientemente se tiende a la
utilizacin de poros de 0.1 m (Meltzer Y Jornitz, 2006).
Los microorganismos son retenidos en el filtro y por lo tanto el fluido filtrado est estril.
La retencin se hace en funcin del tamao de poro existiendo filtros de diferente tamao,
los ms habituales en microbiologa han sido los de 0,45 y los de 0,22 m. Estos filtros
retienen la mayora de los microorganismos, pero no virus, ni algunas bacterias pequeas
(micoplasmas), por lo que ltimamente se estn utilizando de hasta 0,1 m para aumentar
el espectro de los microorganismos retenidos (Meltzer Y Jornitz, 2006; Gomez Y
Moldenhauer, 2009).
Radiaciones
Las radiaciones de distinto tipo se utilizan tambin en microbiologa con la finalidad de
la esterilizacin. La ms utilizada en el laboratorio de microbiologa es la radiacin
ultravioleta (UV) de una longitud de onda de unos 260 nm. Aunque suele ser poco eficaz
debido a su escaso poder de penetracin en los materiales, tales como vidrio, agua,
pelculas de suciedad, sin embargo, es muy til para esterilizar el aire y las superficies,
as, se suelen colocar en cabinas de flujo laminar, en habitaciones estriles, quirfanos,
etc. Otras radiaciones, como los rayos gamma, radiaciones electromagnticas ms
penetrantes, por su menor longitud de onda, (Lambert Y Hansen, 1998).
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Materiales y reactivos:
Equipos y materiales Reactivos
1. Detergente
1. Estufa.
2. Agua potable
2. Todos los materiales de
vidrio.
3. Papel Kraft
4. Piola de hilo
5. Estropajo de botellas
6. Papel secante
7. Escurridor plstico.
Antecedentes y justificacin de la prctica:
El principal mtodo de esterilizacin de materiales de vidrio en el proceso de secado por
medio de aire caliente y seco a temperatura de 170-180C durante 2 horas. Con estos
mueren tantos las formas vegetativas como las esporas de las bacterias que podran estar
contaminando los instrumentos.
La esterilizacin en dentro de un aparato especial denominado estufa. Este es un aparato
que se extingue por su forma y por la forma de calentamiento. Estn hechos de materiales
resistentes al calor alto donde se incluye metal, asbesto y/o fibra de vidrio. Dentro de las
estufas existen gradillas y a su parte externa se adapta a un sistema de medicin de
temperatura; por lo tanto, los sistemas deben poseer sistemas de termorregulacin que
permitan graduar los rangos trmicos con los cuales se desea trabajar.
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Metodologa:
Preparacin de los materiales de vidrios a esterilizar.
1. Los utensilios de vidrio antes de ser esterilizados deben lavarse muy bien con la
ayuda del detergente.
2. Acto seguido debe dejarse de escurrir o secarse con papel toalla o una toalla
especialmente dedicada a estos fines.
3. Habindose secados los instrumentos, se procede a empacarlos con papel kraft,
asegurando la envoltura con piola de hilo resistente al calor. Las pipetas se
pueden empacar en grupos, mientras que las cajas Petri y los tubos de ensayo,
dependiendo de su tamao se pueden empacar independientemente.
4. Colocar los materiales empacados dentro de una estufa, de tal manera que no
queden muy apretados de tal forma que haya suficiente circulacin de aire entre
los materiales.
5. Al cerrar la estufa de hacerse asegurndose de que ha cerrado muy bien; de tal
formar que se puede graduar el rango de temperatura que se va a utilizar.
6. Se debe graduar el termmetro a 170-180C.
7. Dejar los instrumentos a esterilizar durante dos horas.
Cuestionario:
En qu forma se expresa la eficiencia del proceso de esterilizacin en seco de los
instrumentos para el laboratorio?
Riesgo de no-esterilidad: el estado estril o no estril de un objeto no puede ser puesto en
evidencia por las tcnicas analticas convencionales. Esta condicin puede estimarse calculando
el nmero de microorganismos residuales existentes en un artculo sometido a un determinado
mtodo de esterilizacin.
El nmero residual depende de: Contaminacin inicial (Co) (concentracin, volumen o masa) de
los artculos a esterilizar.
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Volumen (V) o Superficie (S) de los artculos a esterilizar.
Eficacia (E) de la esterilizacin expresada en nmero de reducciones decimales.
Por ejemplo, si la esterilizacin ha permitido reducir la poblacin inicial de 10n microorganismos
a una poblacin de 10m, la eficacia es:
E=nm
Despus de la esterilizacin, el nmero medio (R) de microorganismos por objeto es igual a:
R = Co x V (o S) x 10 E
Donde R representa tambin la probabilidad para un artculo de ser no estril, es pues el riesgo
de no-esterilidad del artculo. (R) debe ser tambin lo ms pequeo posible. (R) nunca es nulo.
La farmacopea Europea y Americana han fijado en 10-6 el lmite mximo de riesgo R de la no-
esterilidad (Perkins,1983).
Qu procedimientos previos se deben aplicar a los utensilios de vidrio para ser
sometidos a los procesos de esterilizacin planteada en el protocolo?
Sumergir el material en una solucin con detergente enzimtico.
Enjuagarse repetidas veces bajo el chorro de agua corriente.
Luego del enjuague exhaustivo con agua, se recomienda enjuagar el material con alcohol puro
(96), en especial los equipos huecos, tubuladuras, corrugados, etc. El propsito de este
enjuague es aumentar la velocidad de secado.
Secarlo por fuera con un pao, y jams secar con paos de gnero en su interior, evitando as
los cuerpos extraos como pelusas u otros.
Hay que empaquetar los instrumentos segn de lo que estn hechos esto es para tener un
aislamiento de todo microorganismo y el proceso de esterilizacin sea mas eficaz de igual forma
proteger los instrumentos.
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Colocar los materiales empacados dentro de una estufa para esterilizarlos, hay que tener en
cuenta los espacios que deben existir entre material para que la correcta circulacin trmica se
distribuya por todo el compartimiento.
Se procede a sellar el equipo y calibrar la temperatura en el rango correcto la misma que esta
estipulada dentro de los 170-180 grados centgrados, posterior cuando se llegue a una
temperatura de 180 grados el protocolo indica que se dejara reposar por dos horas
(Perkins,1983).
Para qu se propone la esterilizacin a 170-180C de temperatura?
Segn la bibliografa consultada los parmetros estndar para aceptar esos rangos de
temperatura estn entre los 150-180 C, en este protocolo se ha decidido colocar un rango
ptimo para esterilizar nuestros materiales los mismo que se encuentran entre 170-180 C, se
procede a trabajar con ese rango ya que algunos microorganismos son muy resistentes y aveces
no son eliminados cuando trabajamos con una temperatura de 150 C y de igual manera se
trabaja con temperaturas mximas de 180 C esto se debe a que si se incrementa la temperatura
esta daa la vida til de los materiales a utilizar con el pasar del tiempo, cabe recalcar que la
utilizacin de los procesos con calor seco dependen mucho del tipo de equipo a utilizar y su
capacidad ya que en estufas mas grande varia el tiempo de esterilizacin.
Por qu los materiales deben ser colocados en forma holgada dentro de la estufa?
Los materiales que vallamos a esterilizar en la estufa deben estar bien alineados y con la
debida separacin correspondiente ya que una mala maniobra dentro de la estufa puede
daar el material adems que eso va a depender del tamao mismo del equipo ya que nos
permitir saber segn las dimensiones de los instrumentos, que proporcin se colocar en
el equipo.
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Observaciones y recomendaciones:
En base a lo realizado se puede concluir que los mtodos propuestos por nuestro docente
son los mas apropiados al momento de realizar esterilizaciones dentro de las instalaciones
de la UPSE con los parmetros establecidos segn su experiencia laboral en el campo de
cultivos a nivel microbiolgico.
Como recomendacin previa a la utilizacin de los diferentes quipos debemos de
programar la actividad de esterilizacin ya que si no se maneja de esta manera puede
haber contratiempos al momento de manipular los instrumentos.
Se recomienda colocar materiales correctamente empaquetados para su posterior
esterilizacin en la estufa y de una forma ordenada, teniendo en cuenta que no exageremos
la capacidad del soporte dentro de la estufa para evitar asi monitoreos molestosos que lo
nico que causaran es posibles fallos de contaminacin.
BIBLIOGRAFIA:
Roughley, R. J. 1970. The preparation and use of legume seed inoculants. Plant
Soil. 32: 675-70t. Diponible en:
http://revistasinvestigacion.unmsm.edu.pe/index.php/rpb/article/view/8313/7238
Strijdom, B. W Y H. Jansen van Rensburg. 1981. Effect of steam sterilization
and gamma irradiation of peat on quality of Rhizobium inoculants. Appl.
Environ. Microbiol. 41: 1344-1347. Disponible en:
http://revistasinvestigacion.unmsm.edu.pe/index.php/rpb/article/view/8313/7238
Williams, P. M. 1984, Current use of legume inoculant technology. pp. 173-
200. En: Biological Nitrogen Fixation: Ecology, Technology and Physicology.
Alexander M. (Ed.). Plenum Press Corporation. New York. Disponible en:
http://revistasinvestigacion.unmsm.edu.pe/index.php/rpb/article/view/8313/7238
Block, S.S. 2001. Disinfection, sterilization and preservation. 5 th Ed. Lippincott
Williams y Wilkins Eds. Philadephia. Disponible en:
http://www.revistareduca.es/index.php/biologia/article/view/818/833
Chamberland, C. 1884. Sur un filtre donnant de leau physiologiquement pure.
Compt. Rend. Acad. d. sc. Paris. XCIX: 247. Disponible en:
http://www.revistareduca.es/index.php/biologia/article/view/818/833
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Gomez, M. y Moldenhauer, J. 2009. Biological indicators for sterilization
processes. PDA Books. Davis Healthcare International Publishing, LLC.
Bethesda. Disponible en:
http://www.revistareduca.es/index.php/biologia/article/view/818/833
Lambert B.J. y Hansen J.M. 1998. ISO radiation sterilization standards. Radiation
Physics and Chemistry, 52 (1): 11-14. Disponible en:
http://www.revistareduca.es/index.php/biologia/article/view/818/833
Leahy, T.J.; Kerry, L.R. y Christopher, M.R. 1999. Microbiology of sterilization
processes. En: Validation of pharmaceutical processes: sterile product. Carleton,
F.J. y Agalloco, J.P. Ed. Pp: 353-380. Disponible en:
http://www.revistareduca.es/index.php/biologia/article/view/818/833
Lewis, R.E. 2002. Practical guide to autoclave validation. Pharmaceutical Engineering.
ISPE 2002. Disponible en:
http://www.revistareduca.es/index.php/biologia/article/view/818/833
Meltzer T.H. y Jornitz, M.W. 2006. Chapter 1. The sterilizing filter. En: Pharmaceutical
Filtration: The Management of Organism Removal. PDA Books. Pp. 4-21. Disponible en:
http://www.revistareduca.es/index.php/biologia/article/view/818/833
AAMI. Proposed Recommend Practices for Sterilization in the Practice Setting (1994).
Perkins J J Principles amd Methods of Sterilization in Health Sciences Charles C Thomas
1983, pag 56-74.
