Tropical and Subtropical Agroecosystems, 15 (2012): 693 - 698

MICROPROGAPACIN DE AGAVE (Agave tequilana Weber. var. Azul) A

TRAVS DE YEMAS AXILARES

[MICROPROPAGATION OF AGAVE (Agave tequilana Weber. var. Azul)

THROUGH AXILLARY BUDS]

A. Angeles-Espino1, A. J. Valencia-Botn2*, G. Virgen-Calleros1,

C. Ramrez-Serrano1, L. Paredes-Gutirrez3 and S. Hurtado-De la Pea1
1
Centro Universitario de Ciencias Biolgicas y Agropecuarias.
Universidad de Guadalajara, CUCBA. Km 15.5 carretera Guadalajara-Nogales, Las
Agujas, Zapopan, Jalisco.
2
Centro Universitario de la Cinega. Universidad de Guadalajara.
Av. Universidad 1115, Ocotln, Jalisco, Mxico. CP 47820.
3
Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares. Salazar, Estado de Mxico.
E-mail: [email protected]
* Corresponding author

SUMMARY RESUMEN

Agave (Agave tequilana Weber var. azul), is El agave (Agave tequilana Weber var. azul), se le
commonly called, Blue Agave or Agave Tequilero. conoce comnmente como Agave Azul o Agave
The agave plant is an important economic product of Tequilero. La planta de agave es un producto
Mexico due to its base ingredient is Tequila, which is econmicamente importante de Mxico debido a que
a popular distilled spirit. Agave in vitro propagation es el ingrediente base del Tequila, el cual es una
is a new technique to obtain rapid multiplication in a bebida popular destilada. La micropropagacin es una
short time. The plant response to hormones must be tcnica importante para la multiplicacin masiva en
evaluated for each species of Agave. The objective agave y la respuesta a los reguladores de crecimiento
for this research was to generate agave plantlets from debe considerarse en el desarrollo de cada protocolo.
axillary buds by in vitro culture. Six month aged El objetivo del trabajo fue obtener plntulas de agave
plants were brought from the production field. Buds a partir del cultivo de meristemos in vitro. Se
were disinfected with 70% alcohol and 3% sodium colectaron hijuelos de seis meses en plantaciones de 3
hypochlorite for 15 minutes and triple rinsed under aos de edad. Los meristemos se lavaron y
aseptic conditions. Explants were cultured in desinfestaron con alcohol al 70% y una solucin de
Murashige & Skoog (MS) medium, supplemented hipoclorito al 3% por 15 minutos y se dio triple
with 24.6 M of AIB and 46.46 M of Kinetin, enjuague en condiciones de asepsia en la cmara de
sucrose 30 g L-1 and agar 8 g L-1. Medium was added flujo laminar. Los explantes se sembraron en el medio
at 25 mL per flask and sterilized at 121C for 15 Murashige y Skoog (MS), suplementado con 24.6 M
minutes. One explant per flask was cultured and de AIB y 46.46 M de Cinetina, 30 g/L de sacarosa y
incubated at 27C and 16 hours light. The bud 8 g/L de agar para su solidificacin. El medio se
induction appears in four weeks after it was cultured verti en frascos de 100 mL de capacidad a razn de
and then they were subcultured in MS supplemented 25 mL y se esteriliz en autoclave por 15 min a
with 0.5 M of AIB and 46.46 M of Kinetin. The 121C. Se sembr un explante por frasco y se
plantlets development was reached at four weeks after colocaron en la cmara de crecimiento a 27C con 16
the buds induction. Agave micropropagation from horas luz. La induccin de los brotes se present a
auxiliary buds was completed within 10 weeks. The partir de la cuarta semana posterior a la siembra. Los
time required to get in vitro-plants were demonstrated brotes obtenidos se multiplicaron transfirindose a
using the in vitro technique propagation. It is an medio MS suplementado con 0.1 mg L-1 de AIB y
efficient process of mass multiplication to obtain 46.46 M de Cinetina. El desarrollo de las plntulas
healthy, pathogen free and vigorous plants. se obtuvo a la cuarta semana despus del inicio de la
induccin de los brotes. La micropropagacin de
Key words: Axillary buds; blue agave; plntulas de agave a partir de yemas axilares, se
micropropagation. complet en un lapso de 10 semanas a partir de la
siembra de los meristemos. Al considerar el tiempo
requerido para la obtencin de vitroplntulas de
agave, se confirm que la tcnica de

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micropropagacin es un proceso eficiente para la Palabras clave: Agave azul; yemas axilares;
obtencin masiva de plntulas sanas, vigorosas y micropropagacin.
libres de patgenos.

INTRODUCCIN La investigacin que se ha llevado a cabo en el

cultivo del agave azul tequilero se ha enfocado
El cultivo de agave azul tequilero (Agave tequilana principalmente en los aspectos de nutricin, manejo y
Weber var. Azul) tiene alta importancia econmica y establecimiento de las plantaciones, adems de
social dada la superficie plantada en la zona de algunos problemas fitosanitarios tales como insectos
denominacin de origen del tequila (DOT) y las plaga, hongos y bacterias; sin embargo en el aspecto
familias que dependen de la generacin de empleos de mejoramiento gentico, se puede considerar que no
tanto en campo como en el proceso de hay estudios suficientes al respecto (CRT, 2005).
industrializacin. En los programas de mejoramiento
gentico, la biotecnologa vegetal ofrece herramientas Cabe destacar que la biotecnologa vegetal adems es
valiosas como la micropropagacin in vitro, debido a una herramienta valiosa que permite el mejor
que es un proceso que permite incrementar de una aprovechamiento de estas plantas y aseguran al
manera significativa y en poco tiempo la produccin mismo tiempo su conservacin (Domnguez et al.,
de vitroplntulas que mantienen las caractersticas 2008a).
fenotpicas de la especie y variedad de la que se inicia
la multiplicacin (Gonzlez et al., 2004). Dada la importancia que tiene la biotecnologa, el
contar con una metodologa que provea de individuos
Se reportan 197 especies incluidas dentro de los dos en tiempos relativamente cortos, el objetivo del
subgneros reconocidos (Littaea y Agaveae), de las trabajo fue obtener plntulas de agave azul tequilero a
cules 136 se encuentran en Mxico, presentando partir del cultivo de yemas axilares in vitro.
factores que limitan la multiplicacin masivamente
por mtodos convencionales. Una alternativa es la MATERIALES Y MTODOS
aplicacin de las tcnicas de propagacin y
mejoramiento derivadas de la biotecnologa vegetal, Se utilizaron hijuelos de agave azul tequilero como
siendo la micropropagacin la que aporta mayores material biolgico, cuyo tamao oscil entre los 4 y 8
ventajas, ya que es clonal y mantiene las cm (tamao limn), vigorosos y sin dao por
caractersticas genotpicas del progenitor, adems; la fitopatgenos, procedentes de plantas de dos a tres
multiplicacin sucede en lapsos cortos y poco espacio aos de edad. La colecta de los hijuelos se llev a
en comparacin a la multiplicacin tradicional, y se cabo en predios comerciales de las zonas productoras
obtienen plantas sanas y libres de patgenos. de agave en los municipios de Tequila, Jalisco
Adicionalmente, la biotecnologa aporta otras tcnicas ubicado a 205252 latitud norte, 1034948
de propagacin que pueden resultar importantes para longitud oeste y a 1,189 msnm y el Municipio de
el mejoramiento y conservacin de los agaves Arandas en la zona de los Altos de Jalisco ubicado a
(Domnguez et al., 2008a). 204158 latitud norte, 1022157 longitud oeste a
Durante los ltimos aos el cultivo de tejidos ha 2,049 msnm.
emergido como una potente herramienta para la
propagacin de varias especies de agave, de manera El experimento se llev a cabo en el laboratorio de
directa o indirecta mediante organognesis (Santacruz Cultivo de Tejidos Vegetales del Departamento de
et al., 1999). Botnica y Zoologa del Centro Universitario de
Ciencias Biolgicas y Agropecuarias CUCBA de la
El agave requiere entre seis a ocho aos para que Universidad de Guadalajara. Los hijuelos se lavaron
alcance su madurez y pueda llevarse a cabo la con agua corriente, se quitaron las hojas exteriores
industrializacin y por consiguiente la obtencin del dejando solamente las que rodeaban a la yema. Los
tequila. Adems en esta etapa de madurez es cuando meristemos se colocaron en una solucin de alcohol
la planta emite el vstago floral, mismo que se etlico al 70% por un minuto y posteriormente en una
elimina para evitar la produccin de semilla, con la solucin de hipoclorito de sodio al 3% por 20 min. En
consecuente reduccin de la variabilidad gentica de la cmara de flujo laminar bajo condiciones aspticas
la especie; por lo cual dicho cultivo se lleva a cabo se realiz triple enjuague con agua bidestilada estril.
mediante propagacin vegetativa (Gonzlez et al., Los explantes se colocaron en cajas de Petri estriles
2004). y se retir el tejido daado por el tratamiento de
desinfeccin.

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Se utiliz el medio de cultivo MS (Murashige y desarrollo se llev a cabo conforme los explantes
Skoog, 1962) suplementado con 24.6 M de cido fueron cambiando de color, de amarillo crema a verde
Indol Butrico (AIB) y 46.46 M Cinetina y 8 g L-1 de claro, y luego a verde intenso, lo cual fue un
agar para su solidificacin. Previo a la esterilizacin indicador de la induccin y del desarrollo de los
se ajust el pH a 5.7 0.03 para transferir el medio meristemos a travs de la diferenciacin. Este
fundido en dosificaciones de aproximadamente 25 comportamiento posiblemente pueda estar
mL en contenedores de 100 mL y se esteriliz en influenciado por factores que determinan el desarrollo
autoclave por 15 min a una presin de 20 lb/pulg2 y a de los brotes como pueden ser el explante (gentica),
temperatura de 121C. el nmero de yemas presentes en cada explante, as
como el vigor y la respuesta al medio de cultivo y la
Se colocaron dos explantes por contenedor, se concentracin de auxina (AIB) y citocinina
sellaron, rotularon y se transfirieron a la cmara de (Cinetina), hasta alcanzar la organognesis completa.
incubacin a una temperatura de 27C 1C con un El tiempo de induccin concuerda con lo reportado
fotoperiodo de 16 h luz y 8 h de oscuridad. por Gonzlez et al. (2007), quienes trabajaron con
henequn (A. fourcroides) logrando la induccin de
Los explantes que desarrollaron brotes, se brotes entre 4 a 5 semanas despus de la siembra,
transfirieron a medio MS suplementado con 0.246 cuyas plantas expresaron una organognesis
M de AIB y 46.46 M de Cinetina para continuar completa.
con la multiplicacin. En esta etapa se subcultivaron
los brotes cada cuatro semanas, los cuales se De acuerdo a los resultados que se presentan en la
dividieron de acuerdo a su desarrollo. Previo a la tabla 1, la induccin de los brotes y el desarrollo de
siembra se tom una muestra de 30 pias y se midi las plntulas, fueron indicadores de la respuesta de los
la longitud de cada una y se correlacion con los meristemos a la concentracin de auxina (AIB) y
brotes obtenidos en cada explante. A la tercera citocinina (Cinetina) que se aplicaron para promover
semana posterior al desarrollo de brotes axilares se la organognesis de los meristemos de agave azul
tom una muestra de 30 plntulas, en las que se tequilero, desde la induccin de los brotes, hasta que
contabiliz el nmero de brotes, el nmero de hojas las plntulas completaron la organognesis. El
por brote y la longitud del brote. Se hizo un anlisis promedio de brotes fue de 3.67 1.24 con una
estadstico de datos apareados mediante una prueba varianza confiable de acuerdo al coeficiente de
de t para el nmero de brotes emitidos por explante variacin (6.18%); mientras que el nmero de hojas
y el nmero de hojas por explante. Adems, se hizo tuvo un comportamiento similar con 4.43 1.14 en el
una regresin lineal simple para determinar el mismo lapso. Sin embargo el desarrollo foliar fue
comportamiento entre estas dos variables. superior al de los brotes en 18%. Por otra parte, estos
resultados muestran que la induccin de brotes
RESULTADOS Y DISCUSIN adventicios se relaciona directamente con los
meristemos presentes en cada explante, mientras que
La induccin de los brotes se present con una el desarrollo foliar es una respuesta posterior a la
coloracin verde en el 80% de los explantes, mientras brotacin, lo que explica que el desarrollo foliar haya
que el 20% restante tuvieron una coloracin verde sido estadsticamente superior (P 0.05). Adems, las
amarillenta y retrasaron el desarrollo de las plntulas. diferencias significativas que se presentan en cuanto
Estos resultados concuerdan con los obtenidos por al nmero de brotes y de hojas con respecto a la
Salazar et al. (2009), quien trabajando con Agave longitud de estos, se explican por el comportamiento
cocui, reportaron que los explantes que presentaron de las variables, ya que el nmero de brotes y de
una coloracin verde a partir de la segunda semana foliolos que se desarrollaron, fue independiente a la
despus de la siembra, desarrollaron brotes en un longitud que alcanzaron (Figura 1).
80%, lo cual es consecuencia de las altas
concentraciones de citocininas. Estas hormonas se En trabajos similares mediante el cultivo de
han sealado que incrementan el contenido de meristemos in vitro, Aureoles-Rodrguez et al.
clorofila a travs de la diferenciacin de cloroplastos (2008), trabajaron con maguey bruto (A. inaequidens
y por consiguiente la capacidad fotosinttica; Koch), obtuvieron brotacin directa sin formacin de
mientras que aquellos que no desarrollan la callo al utilizar secciones de tallo y yemas axilares, lo
coloracin verde, presentan una coloracin caf y se que result en una respuesta positiva en ambos
necrosan a partir de la segunda semana, no se explantes, adems encontraron diferencia
recuperan y mueren. significativa en las variables altura de planta y
nmero de hojas con concentraciones de 1 y 3 mg/L
La aparicin de los brotes se present a partir de la de BA.
cuarta semana posterior a la siembra, mientras que el

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Tabla 1. Efecto del AIB y la Cinetina en la induccin y desarrollo de plntulas de agave regeneradas in vitro, y
valores estadsticos de t para datos agrupados.

Variable Media Desviacin estndar Coeficiente de variacin "tc" "t"0.05

Nmero de brotes 3.67 1.24 6.18% 9.761,* 2.05
Nmero de hojas/brote 4.43 1.14 4.67% 2.122,* 2.05
Longitud de brote (cm) 3.48 0.86 4.54% 13.113,* 2.05
*Diferencia significativa al 5% de probabilidad. 1Nmero de brotes vs. Nmero de hojas,
2
Nmero de brotes vs. Longitud de brote, 3Nmero de hojas vs. Longitud de brote.

Como se observa en la figura 1, para nmero de

brotes por explante, el valor mayor (30%) se obtuvo Por otra parte, existi una correlacin positiva y
entre 3 y 3.5 brotes promedio por explante, mientras altamente significativa al 1% de probabilidad (r =
que en nmero de hojas, el 50% estuvo en un rango 0.94) entre el nmero de brotes inducidos y el nmero
de 4 a 4.5 hojas en promedio por explante, lo que de hojas que se desarrollaron en estos. El
concuerda con los valores estadsticos obtenidos, ya comportamiento de estas variables no fue
que el nmero de hojas fue 18% superior al nmero independiente y se explica por la ecuacin: Y = 0.881
de brotes obtenidos por explante. En el desarrollo de + 1.026 (nmero de hojas/brote) (Figura 2). El
los brotes, el 23% tuvo una longitud menor al valor coeficiente de determinacin indic que el 88% de los
promedio 3.48 0.86, el 20% en el rango de la media cambios en el desarrollo de las hojas, se debieron a
y el 47% con un crecimiento superior (Figura 1). cambios que se presentaron en el comportamiento de
Estos resultados indican que el crecimiento depende los brotes.
del vigor y de la respuesta particular de cada brote al En el proceso de micropropagacin que se estableci,
medio de cultivo. en el cual se obtuvo la organognesis a partir de la
siembra de yemas axilares in vitro, intervinieron el
El clculo de la correlacin entre la longitud (cm) de medio de cultivo (Murashige y Skog, 1962) y las
las pias y el nmero de brotes inducidos en cada concentraciones de auxina y citocinina que se
explante, tuvo un valor de r = 0.33, mismo que no fue utilizaron (24.6 M de cido Indol Butrico (AIB) y
significativo al 5% de probabilidad, lo que indica que 46.46 M Cinetina), ya que propiciaron la induccin
el nmero de yemas presentes en cada explante fue de brotes y el desarrollo de las plntulas.
independiente al tamao de la pia del hijuelo
seleccionado para la micropropagacin.

Figura 1. Valores porcentuales de acuerdo a la frecuencia y el valor de clase para nmero y desarrollo de brotes en A.
tequilana Weber var. Azul

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Estos resultados concuerdan con lo reportado por explantes que desarrollaron brotes adventicios
Domnguez et al. (2008b), quien trabaj con cuatro presentaron la organognesis completa, el 90% de los
especies de agave, encontrando que la respuesta a los brotes regeneraron en plntulas completas. Las
reguladores de crecimiento difiere de una especie a plntulas se transfirieron al medio de cultivo MS
otra, por lo que es indispensable desarrollar el suplementado con 0.246 M de AIB y 46.46 M de
protocolo de propagacin particular para cada una de Cinetina obteniendo la multiplicacin continua
ellas. (Schenk y Hilderbrandt, 1972), mismas que
conservaron las caractersticas fenotpicas de la
En la figura 3 se muestra el desarrollo de brotes variedad.
adventicios y la obtencin de plntulas in vitro. Los

Figura 2. Regresin lineal para nmero de brotes y hojas por brote en A. tequilana Weber var. Azul.

A B

Figura 3. Propagacin in vitro de A. tequilana Weber var. Azul. A) Obtencin y desarrollo de brotes adventicios a la
sexta semana posterior a la siembra y B) Desarrollo de plntulas.

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CONCLUSIONES propagacin in vitro de agaves mexicanos.

Revista Fitotecnia Mexicana. 31: 317-322
La induccin directa de brotes adventicios de A.
tequilana Weber var. Azul se present en la cuarta Gonzlez, G., Alemn, S., Trujillo, R., Keb, M.,
semana despus de la siembra partir de yemas Abreul, E., Barredo, F., Robert, M. L.,
axilares. Las concentraciones de auxina (AIB) y Ortiz, R. y Cornides, M. T. 2004. El
Citocinina Cinetina) utilizadas fueron esenciales para cultivo in vitro como alternativa de la
el establecimiento del protocolo en la induccin de recuperacin henequenera (Agave
brotes adventicios y el desarrollo de la morfognesis, fourcroydes) Biotecnologa Aplicada. 21:
obteniendo plntulas completas de A. tequilana que 44-48.
conservaron las caractersticas fenotpicas de la
variedad. El protocolo desarrollado puede aplicarse Gonzlez, H. H., Del Real, J. I. y Sols, J. F. 2007.
para la micropropagacin masiva in vitro como una Manejo de plagas del Agave Tequilero.
herramienta significativa para los programas de Colegio de Postgraduados-Tequila Sauza,
mejoramiento gentico en A. tequilana. S.A. de C.V. Mxico. pp. 2-23.

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Submitted September 09, 2011 Accepted July 06, 2012

Revised received September 11, 2012

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