AISLAMIENTO Y CUANTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS POR DILUCIONES

SERIADAS

AURA CRISTINA CORREA

PAULA ANDREA PATIÑO

MICROBIOLOGIA
CENTRO TEXTIL Y DE GESTIÓN INDUSTRIAL
MEDELLIN
2019
 INTRODUCCIÓN

El crecimiento microbiano se puede estimar mediante el número de células o la

masa celular. Existen métodos directos, como el recuento de células, e indirectos,
como la cuantificación de la cantidad de proteína. El método más utilizado en
microbiología para cuantificar células viables (vivas), es el recuento en placa con
medios de cultivo específicos para la población de interés. Para llevar a cabo un
recuento en placa pueden emplearse dos técnicas: siembra en superficie o
siembra profunda. En ambos casos, a la muestra a cuantificar se le aplica el
método de diluciones seriadas y cada dilución se deposita en cajas de Petri
estériles. La técnica por siembra profunda en placa es la más utilizada y,
generalmente, se emplea para estimar poblaciones microbianas en aguas, suelos
y alimentos, entre otros. Este método directo se basa en la suposición de que
cada célula bacteriana presente en la superficie de un medio con agar (medio
sólido), se multiplicará y producirá una colonia visible denominada unidad
formadora de colonia (UFC). Después de la incubación se cuentan las colonias
desarrolladas y este número, multiplicado por el inverso de la dilución
correspondiente (factor de dilución), permite estimar el número de
microorganismos viables. El resultado de este método debe considerarse como
una estimación aproximada del número total de microorganismos en una muestra,
ya que depende del tipo de medio de cultivo utilizado. También pueden
presentarse problemas relacionados con falta de homogeneidad de las diluciones
y durante la inoculación de las muestras. En tales casos, el número de UFC puede
subestimarse si las células no se separan bien, o bien, puede sobreestimarse si la
toma de muestra se hace del fondo del tubo, donde se concentran los
microorganismos por gravedad.
 OBJETIVOS

 Aplicar técnicas de homogenización y dilución de muestras para ser

analizadas microbiológicamente
 Emplear técnicas de siembra de microorganismos en diferentes tipos de
medios de cultivo
 Realizar cuantificación de microorganismos mediante las técnicas de
recuento en placa en superficie o profundidad
 MATERIALES Y METODOS

Materiales
- Erlenmeyers de 250 mL
- Agitador magnético
- Cámara de flujo laminar o mecheros
- Tubos de ensayo
- Cajas Petri estériles
- Puntas para macro y micropipetas
- Asa de digralsky o triangulo
- Mecheros
- Pipeteadores
- Pipetas graduadas (en caso de que no haya disponibles macropipetas)
Equipos
- Micropipeta de 20 a 200 uL
- Micropipeta de 100 a 1000 ul
- Macropipeta de 1 a 10 ml
- Incubadora a 35 º C +/- 2 º C
- Balanza analítica.
- Planchas de calentamiento y agitación
- Baño María
- Vortex
- Cabina de flujo laminar
Reactivos
- Solución salina peptonada (8.5g de NaCl, 1g de peptona, 1000 mL de agua
destilada)
- Agar nutritivo o plate count
- Agar PDA o Sabouraud
- Agar Chromocult o VRB (petrifilms si los hay)
- Agua destilada

1. PROCEDIMIENTO.

Preparar los medios de cultivos y todo el material, de modo que al momento de

comenzar con las diluciones todo este estéril y listo para ser usado.
Selección de la muestra

Cada pareja deberá seleccionar una muestra solida o líquida desde la cual desee
evaluar la presencia, aislar y cuantificar microorganismos; se puede seleccionar un
alimento (líquido o sólido, preferiblemente alimentos que se comercialicen en la
calle), una muestra de suelo, muestras de agua, etc. Si la muestra es sólida como
mínimo deberá pesar 15 g, si la muestra es líquida como mínimo deben llevar 15
mL.

Preparación de homogenizados y diluciones

 Disminuir la muestr con ayuda de un mortero y superficie de corte

previamente desinfectados con etanol al 70%,
 Pesar 10 g de la muestra sólida (papas de limón)
 Diluir la muestra en 90 mL de solución salina peptonada, dejar en agitación
por 5 min
 Dejar reposar 10, 15 o 30 minutos para permitir la liberación de los
microorganismos a la solución diluyente. (Dilución 1:10 (10 -1))
 De la dilución 1:10 (10-1) tomar 1 ml (usar micropipeta y punta estéril) y
depositarlo en tubo que contenga 9 ml de diluyente para obtener la dilución
1:100 (10-2).
 De la dilución 1:100 (10-2) tomar 1 ml y depositarlo en tubo que contiene 9 ml
de diluyente para obtener la dilución 1:1000 (10-3).
 Continuar las diluciones sucesivamente si se requiere.
 Para el análisis microbiológico de alimentos se deben utilizar 3 diluciones
como mínimo.
 Luego de preparar las diluciones no deben pasar mas de 20 min antes de
estar sembradas

Siembra en profundidad (mesófilos)

 Rotular las cajas con el nombre del equipo de trabajo, medio de cultivo fecha
y dilución.
 Tomar con pipeta estéril alícuotas de 1 ml de cada una de las diluciones
(empezando de la más diluida a la más concentrada) y depositarlo en la base
de una de las cajas de petri estéril previamente marcadas.
 Inmediatamente verter en cada caja de 12 a 15 ml de agar nutritivo o plate
count fundido a 45ºC y mezclar el inóculo con el agar imprimiendo
movimientos de vaivén a la placa sobre el mesón: 5 veces en sentido
horizontal, 5 veces en sentido vertical, 5 veces en el sentido de las manecillas
del reloj, 5 veces en el sentido contrario a las manecillas del reloj y 5 veces
haciendo un ángulo recto.
 Lo ideal es que por cada dilución se siembren al menos dos cajas Petri, para
este ejercicio solo se inoculará una.
  Incubar a 30°C por 72 horas.
 Después de la incubación contar el número de colonias en las diluciones
donde hayan crecido entre 30 UFC y 300 UFC.

Siembra en superficie (mohos y levaduras)

 Rotular las cajas con el nombre del equipo de trabajo, medio de cultivo fecha
y dilución.
 Tomar con pipeta estéril alícuotas de 0.1 ml de cada una de las diluciones
(empezando de la más diluida a la más concentrada) y depositarlo en la
superficie de una de las cajas de petri con el medio de cultivo y previamente
marcadas.
 Inmediatamente extender el inóculo con asa de Dryglaski sobre toda la
superficie.
 Incubar a temperatura ambiente por 3, 4 y 5 días (cada día se debe evaluar
crecimiento).
 Después de la incubación contar el número de colonias en las diluciones
donde hayan crecido entre 15 UFC y 150 UFC.

Siembra en Petri Film (Coliformes).

 Coloque la placa de Petri film en una superficie plana y nivelada. Levante la

película superior
 Con ayuda de una micropipeta se depositó 1mL de una de las diluciones en
el centro de la película cuadriculada inferior.
 Presionamos suavemente el dispersor para distribuir la muestra.
 Levantamos el dispersor y esperamos que pasara al menos 1 min a que
solidificara el gel y procedimos a la incubación a 37°C por 24 horas.

CÁLCULO E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS.

Agar Pc

10-1= incontables

10-2= 7 colonias
7*FD -----------> 1/10-2 10 2
7*10 2 UFC/ mg
0.7*10 3 UFC/mg
10-3= 1 colonia
1*FD -----------> 1/10-3 10 3
1*10 3 UFC/ mg
0,1 * 10 4 UFC / mg

10-4= 2 colonias
2*FD -----------> 1/10-4 10 4
2*10 4 UFC /mg
0.2 *10 5 UFC/mg

10-5= 1 colonia
1*FD ---------> 1/10-5 10 5
1*10 5 UFC /mg
0.1 *10 6 UFC/mg

Agar S

10-1= 1 colonia
1*FD--------->1/10-1 10 1
1*10 1 UFC/mg
0.1 * 10 2 UFC/mg

10-2= incontables

10-3=1 colonia
1*FD ----------> 1/10-3 10 3
1*10 3 UFC /mg
0.1* 10 4 UFC /mg

10-4= no salió nada

10-5= no salió nada

.
CONCENTRACIÓN
GRUPO CELULAR OBSERVACIONES
MICROBIANO
(UFC/mL)
 Pc 10-5: Hubo crecimiento bacteriano.
(Estafilococo).
10-4: Hubo crecimiento bacteriano.
Mesófilos (Cocos)
10-3: Creció un hongo blanco.
10-2: Creció un hongo blanco.
10-1: Creció un hongo blanco.
10-5: No hubo ningún tipo de
crecimiento.
10-4: No hubo ningún tipo de
Agar s
crecimiento.
10-3: Creció un hongo blanco.
Mohos y
levaduras 10-2: Creció un hongo blanco.
10-1: Creció un hongo de color
blanco y amarillo.

Petri film No hubo crecimiento.

Coliformes

Observar y consignar en la tabla 2 las diferencias encontradas en el crecimiento

microbiano entre las diferentes técnicas de siembra utilizadas.

Tabla 2. Diferencias entre los diferentes métodos de siembra.

TÉCNICA DE SIEMBRA DIFERENCIAS OBSERVACIONES
En dos cajas de Petri se 1 de estas bacterias se
desarrollaron 2 bacterias expandió en forma de
y en las otras 3 crecieron estafilococo y la otra en
Profundidad hongos. forma de coco.
Los hongos crecieron
con característica de
mohos
En 3 cajas de Petri Los dos hongos que
crecieron hongos y en crecieron presentaron
Superficie las otras 2 no se características de mohos
presentó ningún tipo de y en uno de ellos se
crecimiento. observó como hubo
acompañamiento de
color amarillo con blanco.

No se observa
crecimiento de coliformes

Petri film

ANALISIS

AGAR S

AAKKAFGAGG
AGAR PC
Los hongos son organismos eucariotas que se engloban en el reino Fungi (Hongos).
Son heterótrofos y requieren materiales orgánicos que utilizan como fuente de
energía y como esqueletos carbonatados para la síntesis celular. Están
ampliamente distribuidos por la naturaleza, encontrándose en hábitats muy diversos
de ahí su frecuente aparición como alterantes en alimentos.

 Diferencias entre lo encontrado con los diferentes métodos de siembra,

medios de cultivo utilizados y entre disoluciones.

 En el agar Pc en el cual se sembró en profundidad hubo un crecimiento de

mohos en 3 cajas de Petri y en las otras 2 se puede observar como crecieron
2 bacterias, al parecer en este medio de cultivo es más propenso a que haya
un crecimiento más consecutivo de hongos puesto que las bacterias fueron
mínimas en desarrollo. Y en la disolución se puede ver como en las de menos
concentración fue donde creció la bacteria, y en las de más concentración se
incrementaron los hongos.

 En el agar S Se sembró en superficie y esta arrojó un crecimiento total de

hongos en 3 cajas, en la de mayor concentración se puede ver como éste es
esponjoso de color blanco y amarillo; en las otras 2 cajas de menor
concentración no hubo ningún tipo de crecimiento, esto pudo haberse dado
debido a que en este medio de cultivo sólo se reproducen donde haya mayor
cantidad de producto de aglomeración mediante el cual puedan resistir y
tengan la capacidad para reproducirse.
 CONCLUSIONES

 Los hongos crecieron en el medio de cultivo donde hubo mayor

concentración.
 Se puede observar diferentes expansiones de los hongos, pero con las
mismas características, excepto en 1 que denotó color blanco y amarillo.
 Las bacterias crecieron en el medio de cultivo donde hubo menor
concentración.
 BIBIOGRAFÍA

- 3M (2006). 3MTM Placas PetrifilmTM para el Recuento de Aerobios. Recuperado de:

https://multimedia.3m.com/mws/media/444944O/petrifilm-aerobic-count-plate-
interpretation-guide-spanish.pdf