UNIVERSIDAD NACIONAL JOSE FAUSTINO SANCHEZ CARRION
FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGIA CON MENCION EN
BIOTECNOLOGIA
TEMA:
CROMATOGRAFIA POR ELUCION Y PRECIPITACION
DOCENTE:
Mo. Ocrospoma Dueñas Robert William
CURSO:
Operaciones Unitarias
ALUMNO:
Castilla Balcazar Oslyn Daniel
CICLO: VI
HUACHO, PERU
Contenido
Introducción .......................................................................................................................................... 1
CROMATOGRAFIA POR ELUSION ............................................................................................... 2
Fundamentos de la cromatografía por elusión. .............................................................................. 2
Tipos de Cromatografía liquida por principio de separación ....................................................... 2
Cromatografía liquido-liquido ..................................................................................................... 3
Cromatografía por filtración en gel ............................................................................................ 3
Cromatografía por adsorción ...................................................................................................... 3
Matrices ............................................................................................................................................. 4
Tipo de cromatografía y tipo de matriz ............................................................................................... 5
Cromatografía líquido-líquido ........................................................................................................ 5
Cromatografía de filtración en gel .................................................................................................. 5
Cromatografía por adsorción .......................................................................................................... 6
Cinética de Absorción. .................................................................................................................... 7
Diseño de Columnas Cromatografías ................................................................................................. 8
Teoría de Cromatografía Lineal .......................................................................................................... 8
Modelos Lineales. ............................................................................................................................... 8
Teoría de platos ............................................................................................................................... 9
Aplicación del modelo de platos ................................................................................................... 10
Teoría cinética ............................................................................................................................... 10
PRECIPITACION................................................................................................................................. 12
Fundamentos ................................................................................................................................... 12
Precipitación por diminución de la Solubilidad ........................................................................... 13
Precipitación por sales. ................................................................................................................... 14
Precipitación isoeléctrica .................................................................................................................. 15
Precipitación con solventes ............................................................................................................... 15
Precipitación con polímeros no iónicos ............................................................................................ 16
Diseño de pecipitadores .................................................................................................................... 16
Cinética de Precipitación .............................................................................................................. 17
Métodos de Diseño ........................................................................................................................... 18
Precipitador por lotes .................................................................................................................... 18
Precipitadores continuos ............................................................................................................... 18
Introducción
La mayoría de los bioprocesos involucran al menos una operación cromatográfica que
frecuentemente es la clave para la factibilidad técnica del proceso de separación.
En la cromatografía, los solutos se separan en base a la distinta velocidad de desplazamiento
cuando son arrastrados por una fase móvil a través de un lecho cromatografico que contiene la
fase estacionaria (solida o liquida).
La muestra se disuelve en la fase móvil y se hace pasar a través de la fase estacionaria que se
mantiene fija en una columna o sobre una superficie plana. Las dos fases se eligen de tal modo
que los componentes de la muestra se destruyen de modo distinto entre las dos fases. Aquellos
que son fuertemente retenidos en la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo de fase
móvil.
La Precipitación es el proceso en el que un soluto soluble se separa en forma de sólido insoluble
de una solución mediante la acción de un agente precipitante.
Algunos productos biotecnológicos presentan solubilidades que varían con la temperatura, el
pH, la fuerza iónica y con la constante dieléctrica del medio.
Esta propiedad puede ser utilizada para concentrar y purificar estos productos mediante la
operación de precipitación. A nivel industrial puede ser utilizada para la obtención de productos
proteicos y nucleicos
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CROMATOGRAFIA POR ELUSION
La cromatografía por elución es un método para separar en sus componentes (resolver) una
mezcla de solutos y es empleada con el propósito de purificar productos de interés (Asenjo y
Andrews, 2009). Ésta se efectúa en columnas empacadas con adsorbentes que pueden ser
sólidos, sólidos porosos o geles. El adsorbente constituye la fase estacionaria de la columna.
(Tejeda A, Montesinos R, Guzmán R, 2011 p.363).
En la cromatografía por elución la columna no se satura completamente con soluto, sino que
sólo se carga en forma controlada una porción de ésta.
En la cromatografía por elución el soluto se purifica a expensas de cierto grado de dilución,
mientras que en la adsorción frontal el soluto se retiene en la columna y posteriormente se eluye
concentrado.
Fundamentos de la cromatografía por elusión.
Existen varias técnicas cromatográficas basadas en la interacción de una fase móvil líquida y
una fase estacionaria. Cinco aspectos fundamentales permiten distinguir las semejanzas y
diferencias entre ellas: (Tejeda A, Montesinos R, Guzmán R, 2011 p.365).
El principio de separación que emplea cada una de ellas.
Las características de las matrices que utilizan.
La presión a la que se operan.
La relación de equilibrio del sistema cromatográfico.
La cinética de la adsorción.
Tipos de Cromatografía liquida por principio de separación
Para la separación se pueden distinguir tres tipos básicos de cromatografía por elución: la
cromatografía líquido-líquido, la cromatografía de filtración en gel o cromatografía por
exclusión por tamaño (SEC) y la cromatografía por adsorción
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Cromatografía liquido-liquido
Se utiliza un adsorbente sólido impregnado con un líquido que funciona como fase
estacionaria. La separación de los solutos es resultado de las diferencias en los coeficientes
de partición de cada uno de los solutos de la mezcla entre las fases líquidas (estacionaria y
móvil).
Cromatografía por filtración en gel
La cromatografía por filtración en gel utiliza partículas fabricadas de geles porosas que
actúan como mallas moleculares que permiten separar moléculas en función a su tamaño.
Cromatografía por adsorción
La cromatografía por adsorción emplea adsorbentes en los que los solutos a separar
presentan diferentes grados de retención. Existen varias modalidades caracterizadas
básicamente por el tipo de adsorbente que emplean.
A su vez esta se divide en cromatografía de adsorción: física, de intercambio iónico, de
interacción hidrofóbica, de fase reversa y de afinidad.
Cromatografía de adsorción simple
Se caracteriza por la unión del soluto al adsorbente por fuerzas débiles del tipo de
van Der Waals.
Cromatografía por intercambio iónico
Se basa en la interacción electrostática entre los grupos cargados del soluto y los
grupos de carga contraria de los adsorbentes.
Cromatografía de interacción hidrofóbica y cromatografía de fase reversa
Tanto la cromatografía de interacción hidrofóbica como la de fase reversa,
se basan en la interacción entre las regiones hidrofóbicas de las biomoléculas
3
y los grupos hidrofóbicos de los adsorbentes empleados.
Cromatografía por afinidad
Está basada en interacciones altamente específicas entre el soluto de interés y el
adsorbente.
Matrices
Existen diversos tipos de materiales para la fabricación de columnas que se usan en el proceso
cromatografico.
Alrededor del 90 % de las matrices que se emplean actualmente están hechas de materiales que
forman geles de alto poder hidratante, los cuales se comercializan en forma de pequeñas esferas
cuyo diámetro varía entre 10 y 100 µm. (Tejeda A, Montesinos R, Guzmán R, 2011 p.366).
Los materiales con las que se fabrican las matrices pueden ser de 4 tipos:
Materiales inorgánicos: sílica porosa, vidrio de poro controlado.
Polímeros orgánicos sintéticos: poliacrilamida, polimetacrilato y poliestireno
Polisacáridos: celulosa, dextrano y agarosa.
Compuestos polímeros orgánicos con polisacáridos: poli-N, N-bisacrilamida
con dextrano, agarosa con dextrano y agarosa con poliacrilamida.
Por otro lado, se puede distinguir dos tipos de geles desde un punto de vista funcional tales son
los microsporosos y macroporosos.}
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Los geles microporosos se obtienen por entrecruzamiento puntual de polímeros lineales como
celulosa, dextrano y la poliacrilamida. Este tipo de geles son utilizados en cromatografía de
filtración en gel y tienen baja resistencia mecánica.
Los geles macroporosos se obtienen por entrecruzamiento y agregación de polímeros, como la
agarosa y la poliacrilamida macroreticular. Este tipo de geles son empleados en cromatografía de
intercambio iónico y de afinidad . (Tejeda A, Montesinos R, Guzmán R, 2011 p.367).
Figura 1.Matrices microsporosas y macroporosas a) Celulosa, b) Polímeros entrecruzados con poliacrilamida,
c) Agarosa.Fuente: Janson 1989.
Tipo de cromatografía y tipo de matriz
Existe una relación directa entre el tipo de cromatografía y el tipo de matriz empleada, a continuación se presentan
algunos ejemplos particulares.
Cromatografía líquido-líquido
En la cromatografía líquido-líquido se empleanpartículas de tierras diatomeas impregnadas con
propilenglicol. Esta técnica es poco selectiva por lo que no es muy utilizada en el laboratorio, pero debido a
su bajo costo es utilizada a escala industrial.
Cromatografía de filtración en gel
En la cromatografía de filtración en gel se emplean básicamente geles de microporos de
dextrano o poliacrilamida.
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Cromatografía por adsorción
Los procesos cromatográficos basados en la adsorción simple de solutos en un adsorbente
sólido poroso, utilizan adsorbentes como alúmina y sílica-gel.
La separación se basa en el hecho de que algunas biomoléculas como las proteínas presentan
residuos externos no polares, de tal manera que en soluciones no acuosas estos tienden a
interaccionar con los ligandos no polares de los soportes.
La cromatografía que utiliza colorantes como ligandos, se basa en el hecho que cierto tipo de estos
colorantes interactúan fuertemente con los grupos aniónicos de las proteínas.
Cromatografía por presión de Operación
De acuerdo al tamaño de partícula y a la presión de operación que emplea, la cromatografía líquida
se puede clasificar en cromatografía de presión baja presión moderada y presión alta.
Figura 2. Tipo de cromatografía según su presión
Relaciones de Equilibrio
Las relaciones de equilibrio se expresan por medio de isotermas de adsorción o curvas que
relacionan la concentración en el equilibrio del soluto en la fase estacionaria y del soluto en la fase
móvil.
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Figura 3. Isotermas de Absorción muestran las características
del estado de equilibrio
Cinética de Absorción.
Algunos modelos utilizados para describir una operación cromatográfica toman en cuenta las
resistencias a la transferencia de masa involucradas en el proceso, las cuales pueden ser descritas
mediante un mecanismo de cinco pasos:
1. Difusión del soluto del seno del líquido a través de una película de líquido que rodea al
adsorbente.
2. Difusión del soluto dentro del poro del adsorbente.
3. Reacción reversible del soluto con el adsorbente (la reacción puede involucrar adsorción,
reacción y desorción de superficie).
4. Contradifusión del soluto en el poro hacia la superficie del adsorbente.
5. Contradifusión del soluto de la superficie del adsorbente hacia el seno dellíquido, a través de la
película de líquido.
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Diseño de Columnas Cromatografías
Una de las técnicas que ha recibido más atención en este sentido es la cromatografía,
particularmente en el arreglo tipo columna de lecho fijo. Tres conceptos se combinan para lograr
un diseño apropiado de estas columnas cromatográficas:
El modelo de la columna.
Los criterios para la evaluación técnica del comportamiento de la columna:
Resolución, Pureza y Rendimiento.
Los procedimientos de escalamiento y optimización de la columna.
Teoría de Cromatografía Lineal
Los enfoques utilizados para describir los procesos cromatográficos están basados principalmente
en dos aspectos: a) tipo de isoterma: lineal o no lineal y b) presencia o ausencia de efectos cinéticos
(dispersión, resistencia a la transferencia de masa o cinética finita). Estos efectos cinéticos son
responsables de la eficiencia finita de las columnas reales.
La suposición de una isoterma lineal se puede justificar en función de que un gran número de
sistemas cromatográficos se trabajan con muestras pequeñas, de tal manera que el rango de
concentraciones en la columna es bajo, y puede ser situado en el rango lineal de cualquier tipo de
isoterma (en la región de baja concentración).
Modelos Lineales.
Existen tres enfoques básicos para la obtención de estos modelos cromatográficos de columnas:
Teoría de los platos
Teoría cinética
o Modelo cinético líneal
o Modelo cinético de tres resistencias
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Teoría de platos-cinética
o Modelo lineal.
o Modelo de van Deemter.
Teoría de platos
Los modelos de platos teóricos son de los más utilizados en el análisis de la cromatografía por
elución. Sin embargo, estos modelos tienen sus limitaciones en lo que se refiere al diseño y
escalamiento de columnas, por lo que su uso es cada vez más limitado. Esto es debido a que estos
modelos son esencialmente empíricos y no pueden relacionarse con principios fundamentales
Según la Teoría de los Platos, una columna cromatográfica está constituída por una serie de platos
que contiene una fase estacionaria. Supone que el volúmen de fase estacionaria en cada plato es
constante; que el volúmen de fase móvil es constante de plato a plato; que en cada plato las dos
fases están en equilibrio, y que el valor del Coeficiente de Distribución es constante e
independiente de la concentración del soluto.
La principal desventaja de la Teoría de los Platos Teóricos es la falta de conexión entre la eficiencia
de la columna cromatográfica, el tamaño de la partícula, la difusión, la velocidad de flujo y la
temperatura. La otra desventaja es que utiliza un modelo basado en muchas suposiciones.
El balance de masa del soluto para la etapa n puede ser escrito como:
Acumulación en el líquido = Entrada- Salida –Adsorción
También puede ser expresado en la siguiente formula:
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donde:
VE: Volumen de la etapa (líquido más adsorbente).
e : Volumen del líquido por volumen de etapa.
F : Flujo de alimentación.
cn: Concentración de soluto en la solución en la etapa n.
qn: Concentración de soluto en el adsorbente en la etapa n.
Aplicación del modelo de platos
Pueden ser utilizadas para estimar el número de etapas de una columna a partir de datos
experimentales de concentración contra tiempo. Una vez calculada N y contando con la longitud
de la columna L, se puede obtener la altura equivalente de un plato teórico (HETP de sus siglas en
inglés) de la columna, la cual es una medida de la eficiencia de ésta, mediante la siguiente ecuación:
Teoría cinética
La Teoría Cinética considera el proceso cromatográfico en función de los factores cinéticos que
intevienen en él.
Los modelos basados en la teoría cinética describen el comportamiento de una cromatografía
mediante los perfiles de concentración de los solutos obtenidos mediante balances de masa,
relaciones de equilibrio y expresiones cinéticas. Este enfoque resulta más complejo que el de la
teoría de platos pero permite mejorarla descripción y comprensión de estos sistemas.
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Siendo estos factores:
Las múltiples trayectorias (diferentes rutas) que toma un soluto durante su movimiento
(migración) a través del empaque de la columna, provocando variaciones en la velocidad
del flujo.
La Difusión Axial o Longitudinal del soluto en la fase móvil.
La cinética de la resistencia a la transferencia de masa entre las fases móvil y estacionaria.
Modelo cinético lineal
Este modelo supone que sólo una resistencias controla la transferencia de masa. En el
caso que la resistencia en la película sea la controlante, la velocidad de transferencia de
masa del líquido al adsorbente puede ser expresada como:
Modelo de van Deemter
El modelo de van Deemter (van Deemter et al., 1956) es uno de los más conocidos para
cromatografía por elución. Estos autores combinaron los resultados de la teoría de platos
con los del modelo cinético de Lapidus y Amundson (Lapidus y Amundson, 1952).
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PRECIPITACION
Teóricamente la precipitación debe producir un soluto concentrado y relativamente puro, por lo
que es una operación que se usa con frecuencia al inicio de un proceso de bioseparación. Los
agentes precipitantes seleccionados no deben producir desnaturalización del soluto y deben
proveer una mayor estabilidad del soluto en el precipitado que en la solución.
Las ventajas de usar la precipitación para la concentración y purificación desolutos son, entre
otras, las siguientes:
1. Es relativamente barata.
2. Es una operación que se adapta fácilmente a gran escala.
3. Puede realizarse en forma continua.
4. El equipo que se utiliza es sencillo.
5. Se dispone de diversos agentes precipitantes y en muchos casos éstos son baratos.
Fundamentos
Principio de precipitación.
La precipitación por disminución de la solubilidad de la proteína de interésse efectúa por medio
de un agente precipitante. Este puede ser una sal neutra como el sulfato de amonio; un agente que
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altere el pH de la solución; un solvente orgánico como etanol, acetona o éter; o algún polímero
como el polietilenglicol.
En la desnaturalización selectiva se producen cambios en la conformación de las proteínas
contaminantes con el propósito de aislar en la solución la proteína de interés, utilizando como
agentes precipitantes temperatura, pH y algunos solventes orgánicos.
Tabla 1.Principio de precipitación de proteínas
Precipitación por diminución de la Solubilidad
Debido a su naturaleza anfotérica cuando una proteína se encuentra en solución acuosa produce
complejas interacciones con la solución que la rodea. Particularmente, cuando se agrega un agente
precipitante a la solución, las proteínas que presentan mayor hidrofobocidad (por contar con mayor
cantidad de aminoácidos hidrofóbicos en su superficie) precipitan más fácilmente que las de menor
hidrofobicidad. En el primer caso las proteínas tienen una baja solubilidad y en el segundo caso
una alta solubilidad. De lo anterior se desprende que la estructura de la proteína determina su
solubilidad.
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Los métodos utilizados para la precipitación de proteínas que se revisan en esta sección y que están
basados en la disminución de la solubilidad por alteración del solvente son: a) precipitación con
sales, b) precipitación isoeléctrica, c) precipitación con solventes y d) precipitación con polímeros
no iónicos.
Precipitación por sales.
Una de las técnicas más ampliamente utilizadas para la purificación de enzimas es la llamada
precipitación por insolubilización por salado o “salting out” (Cheng et al., 2006), que se realiza
agregando altas concentraciones de sal a la solución en la que se encuentra la proteína para producir
su precipitación.
La descripción simplificada del mecanismo de insolubilización por salado está basada en el hecho
de que la adición de las sales elimina el agua de la proteína hidratada, dejando las regiones
hidrofóbicas en libertad de combinarse intermolecularmente (Glatz, 1990). Aquellas proteínas que
presentan mayor número de regiones hidrofóbicas sobre su superficie, forman agregados y
precipitan más rápidamente que aquellas que presenten pocas regiones hidrofóbicas.
Debido a esta propiedad hay proteínas que pueden permanecer en solución a altas concentraciones
de sal.
La ecuación de la precipitacion con sales será:
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La fuerza ionica esta dada por:
donde:
Ci: Concentración del ión.
Zi: Carga del ión.
Precipitación isoeléctrica
Otra técnica muy utilizada para precipitar proteínas se basa en la disminución de su solubilidad en
el punto isoeléctrico.
Las proteínas por su naturaleza anfotérica presentan una carganeta negativa a pH altos y una carga
neta positiva a pH bajos. Existe un pH llamado pH isoeléctrico al cual la carga neta de la proteína
es cero. A este pH la molécula es incapaz de desplazarse en un campo eléctrico.
Precipitación con solventes
La precipitación de las proteínas de una solución también puede realizarse mediante la adición de
un solvente orgánico ligeramente polar.
El agua se caracteriza por su alta constante dieléctrica , esto significa que los iones en solución
acuosa presentan interacciones más débiles que en otros medios.
Cuando se agrega un solvente orgánico como etanol o acetona, a una solución acuosa de proteínas
(a un pH y temperatura dados), se producen agregados de moléculas proteicas que tienden a
precipitar.
Selección del solvente
La mayor desventaja de la precipitación con solventes es la desnaturalización que puede sufrir la
proteína por acción del solvente, de tal manera que es importante seleccionar adecuadamente éste.
En el caso del uso de monoalcoholes como solventes, la desnaturalización se incrementa conforme
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la cadena alquilo se incrementa.
Precipitación con polímeros no iónicos
La precipitación de proteínas también puede realizarse utilizando polímeros neutros como el
polietilenglicol (PEG) en lugar de sales o solventes. Dichos polímeros de elevado peso molecular
son solubles en agua y sus soluciones presentan viscosidades moderadas (Guo et al., 1996).
El mecanismo por el cual ocurre la precipitación cuando se utilizanestos polímeros no está
claramente establecido, sin embargo existen dosmodelos que permiten una buena comprensión de
este fenómeno. Los modelos desarrollados por Ogston y Laurent (Clark, 1989) conducen a una
ecuación de solubilidad y sugieren que los polímeros excluyen a las proteínas de parte de la
solución y reducen la cantidad efectiva de agua disponible para su solvatación.
El modelo propuesto por Laurent se basa en un mecanismo de exclusión geométrica de regiones
hidratadas de la proteína por el polímero.
La precipitación de proteínas también puede realizarse utilizando polímeros neutros como el
polietilenglicol (PEG) en lugar de sales o solventes. Dichos polímeros de elevado peso molecular
son solubles en agua y sus soluciones presentan viscosidades moderadas (Guo et al., 1996).
Diseño de pecipitadores
En el diseño de un proceso de precipitación debe tomarse como base el comportamiento cinético
de las partículas en solución. El conocimiento de este comportamiento permite hacer la selección
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adecuada de la geometría en que se realizará el proceso. Con base a lo anterior, esta sección se
enfoca a dos aspectos:
Cinética de la Precipitación.
Diseño del Precipitador.
Cinética de Precipitación
La precipitación de proteínas puede efectuarse ya sea desnaturalizando o sin desnaturalizar éstas.
En este apartado se revisan los aspectos cinéticos relacionados con la precipitación sin que ocurra
desnaturalización de la proteína.
En una solución proteica las moléculas presentan por efecto de su energía cinética un movimiento
al azar que produce choques entre sí. Para que las moléculas de proteína queden asociadas al chocar
se requiere eliminar tanto las barreras producidas por las moléculas de agua que las rodean, como
las que originan sus cargas eléctricas
Para facilitar su estudio la cinética de la precipitación se divide en las seis
fases siguientes:
1. Mezclado inicial: la solución proteica se mezcla con el agente precipitante para eliminar las
barreras.
2. Nucleación: al disminuir la solubilidad de la proteína se inicia la precipitación al formarse en el
seno de la solución pequeñas partículas (núcleos).
3. Crecimiento limitado por difusión (crecimiento percinético): en esta fase los núcleos van
creciendo conforme la proteína difunde del seno de la solución hasta los núcleos. La frecuencia de
las colisiones está limitada por la velocidad de difusión de las moléculas y no por el mezclado. Se
forman las partículas primarias de tamaño entre 0.1 y 10 µm.
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4. Crecimiento inducido por el esfuerzo de corte (crecimiento ortocinético): el mezclado favorece
el crecimiento del agregado formándose partículas en el rango de 1 a 100 µm.
5. Floculación: los agregados se juntan formando los grandes flóculos.
6. Separación: los flóculos se remueven de las solución mediante un método de separación sólido-
líquido como la centrifugación.
Métodos de Diseño
El proceso de crecimiento de las partículas en la precipitación puede estar limitado por varios
mecanismos.
Precipitador por lotes
En un precipitador por lotes la proteína está expuesta a un rango de condiciones creadas
por el agente precipitante durante el tiempo en que éste se agrega a la solución, entonces
las condiciones iniciales de precipitación del material son diferentes a las condiciones
finales. Para disminuir este efecto el agente precipitante debe agregarse lentamente y bien
dispersado.
En un precipitador por lotes todas las partículas son sometidas a fuerzas de corte similares,
y cuando éstas son controladas, se producen partículas primarias más grandes que las
obtenidas en los precipitadores tubulares
Precipitadores continuos
En un reactor tubular cuando se tiene un buen mezclado en el punto donde se agrega el
agente precipitante, la proteína se ubica rápidamente a las condiciones finales en que
ocurre la precipitación. Las fuerzas de corte a las que están sujetas las partículas pueden
ser las que produce el flujo laminar, aun cuando la velocidad media de corte puede exceder
a la de un tanque agitado.
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En un reactor continuo tipo tanque agitado la proteína es puesta en contacto
instantáneamente con el agente precipitante, alcanzándose al mismo tiempo las condiciones
finales de precipitación. Las condiciones de corte son muy parecidas a las de un
precipitador por lotes, y las partículas estarán sujetas a las fuerzas de corte durante el
tiempo de residencia en el reactor (Glatz, 1990).
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Referencias Bibliográfica.
Tejeda A, Montesinos R, Guzmán R . (2011). Bioseparaciones .
Dario R (s.f). Cromatografia de gases. Link de la pagina.
http://www.relaq.mx/RLQ/tutoriales/cromatografia/Gas.htm
Plaza L. (s.f). Separación y procesos biotecnológicos. Recuperado de
https://slideplayer.es/slide/13238657/
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