5.
FUNDAMENTOS DEL MÉTODO
La ureasa descompone específicamente la urea produciendo dióxido de
carbono y amoníaco. Este reacciona en medio alcalino con salicilato e
hipoclorito para dar indofenol color verde.
5.1 REACTIVOS PROVISTOS
A. Reactivo A: solución concentrada conteniendo buffer fosfatos
200 mmol/l, ácido salicílico 750 mmol/l, nitroprusiato de sodio 20
mmol/l y EDTA 10 mmol/l.
B. Reactivo B: solución concentrada de hipoclorito de sodio 10
mmol/l en hidróxido de sodio 0,1 mol/l.
C. Reactivo C: ureasa ≥ 75 U/ml en solución glicerinada.
S. Standard: solución de urea 0,60 g/l (28,04 mg/dl de BUN).
5.2 REACTIVOS NO PROVISTOS
Agua destilada.
5.3 INSTRUCCIONES PARA SU USO
Reactivo A; preparación: diluir 1 parte del Reactivo A
concentrado + 4 partes de agua destilada.
Reactivo B; preparción: diluir 1 parte del Reactivo B concentrado
+ 4 partes de agua destilada.
Reactivo A+C: se prepara agregando 4 ml de Reactivo C cada
100 ml de Reactivo A. Pueden prepararse otras cantidades
mientras se respete la proporción indicada.
5.4 PRECAUCIONES
Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro".
Utilizar los reactivos guardando las precauciones habituales de
trabajo en el laboratorio de análisis clínicos.
Todos los reactivos y las muestras deben descartarse de acuerdo
a la normativa local vigente.
Reactivo B: irritante. R36/38: Irrita los ojos y la piel. S26: En caso
de contacto con los ojos, lávense inmediata y abundantemente
con agua y acúdase a un médico. S37/39: Úsense guantes
adecuados y protección para los ojos/la cara.
5.5 ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO
Reactivos Provistos: estables en refrigerador (2-10oC) hasta la
fecha de vencimiento indicada en la caja.
Reactivos A y B: estables durante 1 año a partir del momento de
su preparación conservados en refrigerador (2-10oC).
La mezcla de Reactivo A+C es estable durante 20 días en
refrigerador (2-10oC) a partir del momento de su preparación.
5.6 INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS
REACTIVOS
Valores de Blanco superiores a 0,150 D.O. son indicio de
deterioro de los reactivos. En tal caso desechar.
5.7 MUESTRA
Suero, plasma u orina
a) Recolección: obtener de la manera usual.
b) Aditivos: en caso de que la muestra a usar sea plasma se
recomienda el uso de Anticoagulante W de Wiener lab.
c) Sustancias interferentes conocidas:
- Los anticoagulantes que contienen fluoruros inhiben la
acción de la ureasa.
- No se observan interferencias por hemólisis ligeras o
moderadas y bilirrubina hasta 400 mg/l.
Referirse a la bibliografía de Young para los efectos de las
drogas en el presente método.
d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la urea en
suero es estable varios días en refrigerador (2-10oC) o 6
meses en congelador, sin agregado de conservadores.
5.8 MATERIAL REQUERIDO (no provisto)
- Espectrofotómetro o fotocolorímetro.
- Micropipetas y pipetas para medir los volúmenes indicados.
- Baño de agua a 37oC (opcional).
- Reloj o timer.
5.9 CONDICIONES DE REACCIÓN
- Temperatura de reacción: 37oC o temperatura ambiente.
- Tiempo de reacción: 10 minutos a 37oC o 20 minutos a
temperatura ambiente.
- Volumen de reacción: 2 ml
- Volumen de muestra: 10 ul
6. PROCEDIMIENTO
I) TÉCNICA PARA SUERO O PLASMA
En tres tubos marcados B (Blanco), D (Desconocido) y S (Standard)
colocar:
Mezclar. Incubar 5 minutos a 37oC o 10 minutos a temperatura
ambiente.
Leer en espectrofotómetro a 570 nm o en fotocolorímetro con filtro
naranja (560-580 nm).
II) TÉCNICA PARA ORINA
Se sigue la misma técnica que para suero o plasma utilizando orina
diluida con agua o solución fisiológica. Como el contenido de urea
está generalmente relacionado con la densidad, es conveniente diluir
según el siguiente esquema:
Densidad hasta 1,015.....................................diluir 1/10
Densidad de 1,016 a 1,025.............................diluir 1/20
Densidad mayor de 1,025...............................diluir 1/40
Como la orina contiene cantidades variables de amoníaco debe
efectuarse un Blanco de orina (BD). Dicho Blanco se ejecuta igual que
el Blanco de reactivos (B), con la diferencia que, después de
agregado el Reactivo B, se agregan 10 ul de la dilución de orina.
Llevar el aparato a cero con el Blanco de Reactivos (B) y leer el
Standard (S), el Blanco de orina (BD) y desconocido (D).
6.1 ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCIÓN FINAL
El color de la reacción es estable durante 2 horas por lo que la
absorbancia debe ser leída dentro de ese lapso.
6.2 CALCULO DE LOS RESULTADOS
Suero o plasma:
0,60 g/l
Urea g/l = D x factor factor =
S
Orina:
(D - BD) x 0,60 g/l
Urea g/l = x dilución
S
6.3 MÉTODO DE CONTROL DE CALIDAD
Si la muestra a ensayar es suero, procesar 2 niveles de un
material de control de calidad (Standatrol S-E 2 niveles) con
concentraciones conocidas de urea, con cada determinación. En
el caso de muestras de orina, utilizar un control con base de orina.
6.4 CONVERSIÓN DE UNIDADES AL SISTEMA SI
Urea (g/l) x 16,67 = Urea (mmol/l)
BUN (mg/dl) x 0,357 = Urea (mmol/l)
6.5 VALORES DE REFERENCIA
Suero o plasma: 0,10 - 0,50 g/l
Este rango se obtuvo de 120 muestras de individuos en ayunas,
pertenecientes a ambos sexos, con edades comprendidas entre
20 y 45 años, provenientes de la ciudad de Rosario (Argentina),
sin síntomas de disfunción renal u otra enfermedad aparente.
Orina: normalmente, la eliminación de urea está sujeta a grandes
variaciones dependientes de la dieta. Por término medio, y con
una dieta mixta corriente, se excreta unos 30 g en 24 horas, con
oscilaciones comprendidas entre 20 g y 40 g.
