PROGRAMA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS

DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA
UNIVERSIDAD DE CALDAS

GUÍAS DE
LABORATORIO
MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS
María Marcela Martínez Miranda
Bacterióloga y laboratorista clínico
M.Sc. Microbiología

2016-2

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[CARRERA 35 # 60–160 SEDE SANCANCIO BLOQUE B PISO 4TEL.:8781587 ]
 Índice

INTRODUCCIÓN

Práctica 1. Preparación de muestras y recuento de aerobios de mesófilos por la técnica de

recuento en placa.

Práctica 2. Efecto de los factores físicos sobre el crecimiento microbiano.

Práctica 3. Enumeración de coliformes y E. coli por la técnica de Número Más Probable (NMP).

Práctica 4. Recuento de mohos y levaduras.

Práctica 5. Análisis de microbiológico de ambientes y superficies en la industria alimentaria.

Práctica 6. Detección de Salmonella spp.

Práctica 7. Detección de Listeria monocytogenes.

Práctica 8. Determinación de esporas de Clostridium sulfito reductor (ECSR).

Práctica 9. Recuento e identificación de Staphylococcus coagulasa positivo.

Práctica 10. Recuento e identificación de Bacillus cereus.

Práctica 11. Análisis microbiológico de agua potable mediante filtración por membrana (FPM).

Práctica 12. Evaluación de esterilidad comercial de conservas.

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 Introducción

Los alimentos, al igual que el agua, no son productos estériles cuya carga microbiana varía de
acuerdo del tipo de alimento, su origen, procesamiento, conservación y manejo.

La calidad microbiológica de los productos alimentarios hace referencia a dos aspectos

fundamentales: la calidad higiénico-sanitaria y la calidad comercial. La primera tiene una gran
importancia debido a que su ausencia conlleva un considerable riesgo para la salud del
consumidor, ya que los alimentos pueden ser vehículos de microorganismos patógenos.
Respecto a la segunda, cabe señalar que hay microorganismos que aunque carezcan de
significado sanitario, pueden ser causa de deterioro del alimento, modificando su color,
aroma, sabor, consistencia o aspecto de forma tal que sea rechazado por el consumidor.

El análisis microbiológico de alimentos está destinado a la búsqueda de agentes patógenos o

de microorganismos indicadores de una contaminación no admisible, de modo que se asegure
la calidad higiénico-sanitaria y comercial de los mismos. Aunque los microorganismos más
importantes en cuanto a la salud pública son aquellos que desarrollan enfermedades
transmitidas por alimentos (ETA), tales como Salmonella, Staphylococcus aureus, Clostridium
perfringens, etc., existe un grupo de microorganismos de especial utilidad en la industria
alimentaria, que son los llamados "indicadores". Estos microorganismos no son
necesariamente patógenos y su presencia se relaciona con la existencia de contaminación,
avisando de la posible existencia de patógenos y otros microorganismos que pueden alterar el
producto. Estos microorganismos "indicadores" se analizan de forma rutinaria, y de hecho, en
la legislación se considera su análisis como un parámetro de calidad microbiológica.

El propósito de la presente guía de laboratorio es dar a conocer a los estudiantes de Ingeniería

de Alimentos de la Universidad de Caldas los diferentes procedimientos para el análisis
microbiológico de alimentos, de la aplicación de Buenas Prácticas de Laboratorio, toma de
muestras, diluciones, hasta la fase analítica de los mismos, recuento, lectura, interpretación y
presentación de los resultados.

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 Práctica 1. Preparación de muestras y recuento de aerobios
mesófilos por la técnica de recuento en placa

I. INTRODUCCIÓN

La operación de preparación de muestras para el análisis microbiológico exige unas reglas de

manipulación aséptica muy estrictas, así como la utilización de material y diluyentes estériles,
para evitar la contaminación exterior del alimento.

La mayoría de los alimentos no son estériles sino que contienen una carga microbiana, que
varía ampliamente en número, dependiendo del alimento. Es por eso que al preparar el
alimento en el laboratorio se le realizan una serie de diluciones para su cuantificación, ya que
si se siembran los alimentos sin diluir, presentarán un recuento tan alto que sería imposible
hacer el conteo.
Los recuentos de microorganismos viables se basan en el número de colonias que se
desarrollan en placas previamente inoculadas con una cantidad conocida de alimento e
incubadas en unas condiciones ambientales determinadas. El recuento en placa puede
referirse a distintos grupos de bacterias, según sea la temperatura y la atmósfera de
incubación:

 Microorganismos mesófilos: crecen a temperaturas óptimas entre 25-40°C.

 Microorganismos psicrotrofos: Aunque su temperatura óptima de crecimiento se estima
entre 15 y 20°C, se pueden multiplicar lentamente a temperaturas de refrigeración (0 y
6°C).
 Microorganismos termodúricos: Son capaces de sobrevivir el calentamiento de un
alimento a temperaturas de pasteurización (63° por 30 minutos), pero no crecen a altas
temperaturas.

El propósito de la presente práctica es capacitar al estudiante en la preparación de las

muestras de alimentos y sus diluciones y dar a conocer el método para el recuento en placa de
aerobios mesófilos.

II. INSUMOS, MATERIALES Y EQUIPOS

Insumos
– Muestras líquidas: Leche, bebida hidratante energética, jugos, etc.
– Muestras sólidas: Queso, hamburguesa, lechuga, frutas, arepas, etc.
Reactivos y medios de cultivo
– Agua peptonada 0,1%
– Agar Plate Count (PCA) fundido
– Alcohol etílico (70%).
Materiales (estériles)
– Instrumentos para la preparación de las muestras: tijeras, pinzas, cuchillos, cucharas,
espátulas, etc.
– Placas de Petri vacías.
– Vasos para licuadora.

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 – Gasa estéril.
– Frascos con 90 ml de diluyente (agua peptonada 0,1%).
– Pipetas de 1 y 10 ml.
– Tubos con 9 ml de diluyente (agua peptonada 0,1%).
– Mecheros de Bunsen.
– Propiteadores.
Equipos
– Balanza.
– Licuadora.
– Incubadora regulada a 35°C
– Cuenta colonias
III. PROCEDIMIENTO
A. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
1. Muestras sólidas o semisólidas
– Pesar asépticamente 10 gr de la muestra a analizar en un recipiente homogenizador.
– Adicionar 90 ml del diluyente (agua peptonada 0,1%).
– Homogenizar la muestra con el diluyente en el recipiente homogenizador durante 1-2
minutos a 2000-3000 r.p.m hasta obtener una suspensión completa y homogénea.
– Filtrar la suspensión usando una gaza poco tupida para retener los restos
macroscópicos de la muestra.
2. Muestras líquidas no viscosas
– Agitar la muestra manualmente con 25 movimientos de arriba abajo, efectuados en un
tiempo de 7 segundos.
– En condiciones asépticas, tomar 10 ml de la muestra y diluir con 90 ml del diluyente
(agua peptonada 0,1%) en un recipiente de tamaño adecuado.
– Homogenizar la suspensión manualmente durante 1-2 minutos.
3. Muestras sólidas y semisólidas congeladas
– Descongelar en refrigeración de 4 a 8ºC durante 18 h. y no más de 24 h antes de diluir y
analizar.
– Proseguir como se indica en el numeral 1 para muestras sólidas y semisólidas no
congeladas.
B. PREPARACIÓN DE LAS DILUCIONES
La preparación de diluciones decimales a partir de una muestra tiene por objeto efectuar
diluciones progresivas de dicha muestra, para poder realizar recuentos microbianos
posteriores.
1. La mezcla homogenizada en el apartado anterior se constituye en la suspensión madre y
primera dilución de la serie (1:10).

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2. A un tubo que contenga 9 ml del diluyente se transfiere 1 ml de la suspensión madre.
Mezclar durante 30 segundos en agitador excéntrico. Así se obtiene la segunda dilución
(1:100). Desechar la pipeta usada.
3. De la mezcla anterior, y con una nueva pipeta estéril, se incorpora 1 ml a otro tubo que
contenga 9 ml del diluyente. Mezclar durante 30 segundos en agitador excéntrico. Así se
obtiene la tercera dilución (1:1000). Desechar la pipeta usada.
4. Repetir la operación en varios tubos hasta lograr las diluciones deseadas. De esta manera
se obtiene la “serie de diluciones decimales” (10-1, 10-2, 10-3, 10-4, etc.).
5. Los tubos de la serie se mantendrán en refrigeración hasta el comienzo del análisis, que no
debe exceder las dos horas.

C. SIEMBRA EN PLACA
1. Escoger dos diluciones consecutivas para la siembra de acuerdo al tipo de alimento
analizado.
2. A partir de las diluciones escogidas y por duplicado, depositar con pipeta estéril 1 ml de
cada dilución en las cajas de Petri, previamente marcadas así: # de grupo, fecha, hora, el
tipo de ensayo microbiológico, medio de cultivo y tipo de muestra.

3. Añadir a cada caja de Petri unos 15 ml de agar PC fundido y atemperado a 45°C.

4. Mezclar perfectamente medio e inóculo sobre la mesa de trabajo, haciendo movimientos
circulares con la placa, a favor y en contra de las agujas del reloj y en forma de cruz,
evitando al mismo tiempo que el medio impregne la tapa.
5. Dejar solidificar al agar de las placas sobre una superficie totalmente plana durante 10
minutos.
6. Cuando se haya solidificado completamente el agar, se invierten las placas y se incuban a
35°C durante 24 - 48 h.

D. REGISTRO DE RESULTADOS
1. Transcurrido el tiempo de incubación, se cuentan las colonias en aquellas placas que
muestren entre 10 y 300 colonias aisladas.
2. Marcar las colonias contadas con marcador Sharpie para evitar contarlas de nuevo.
3. Registrar los resultados en la siguiente tabla.

Nº colonias
Dilución sembrada Volumen sembrado UFC/g
Caja 1 Caja 2

IV. CUESTIONARIO
1. Elabore una tabla con la composición química de las sustancias usadas como diluyentes en
el laboratorio de microbiología de alimentos.
2. En una tabla, mencione y describa cada uno de los homogeneizadores de muestras de
alimentos. ¿Cuál es el más usado en el laboratorio de microbiología de alimentos?
3. Haga una tabla en la que enumere 10 alimentos a los que se les hace recuento de aerobios
mesófilos, los límites microbiológicos permitidos y la norma que lo establece en Colombia.

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4. Busque en la página del Manual de Bacteriología Analítica de la FDA la guía para calcular y
reportar las UFC de aerobios mesófilos (Items C y D) y extraiga los ejemplos que se
encuentran allí.
http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm063346.htm

5. Haga una tabla comparativa entre tres métodos normalizados diferentes para el recuento
de aerobios mesófilos, incluyendo diluyentes, medios de cultivo, condiciones de
incubación, etc. (ISO, BAM-FDA, ICMSF, etc.).

V. BIBLIOGRAFÍA
ARÁMBULA, AL y MURCIA, GM. (1987). Fundamentos y técnicas microbiológicas de alimentos.
Santander: Universidad Industrial de Santander.
BOTERO A., Patricia y C., TIBADUIZA (2003). Instructivo para toma de muestras y análisis de
productos alimenticios y bebidas en puertos. INVIMA. Bogotá, D.F.
DPTO. HIGIENE Y TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS. Prácticas de Microbiología y Análisis
Microbiológico de los Alimentos. Área de Conocimiento de Nutrición y Bromatología. Facultad
de Veterinaria. Universidad de León. Disponible en:
http://www3.unileon.es/personal/wwdhtmpm/guiones.pdf Fecha de consulta: 23 de febrero
de 2010.
JEFE DE LABORATORIO (1998). Instructivo de análisis: Recuento Aerobios Mesófilos. Obtenido
el 01 de febrero de 2008 en http://www.geocities.com/seguridad_alimentaria/meofilos.rtf

LISANDRO SIGNORINI, M, SEQUEIRA, GJ, BONAZZA, JC, et al. (2008). Utilización de

microorganismos marcadores para la evaluación de las condiciones higiénico-sanitarias en la
producción primaria de leche.. Rev. Cient. (Maracaibo), vol.18, no.2, p.207-217. ISSN 0798-
2259.

MARZOCCHI ediciones. (2005). Extracción, Toma de muestras para análisis de productos

alimenticios (Toxinas). Disponible en: http://riie.com.ar/?a=22355 Fecha de consulta: 23 de
febrero de 2010.
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA. (2009). NTC 4092. REQUISITOS GENERALES Y DIRECTRICES
PARA ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS.
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA. (2009). NTC 4519. METODO HORIZONTAL PARA EL
RECUENTO DE MICROORGANISMOS. TÉCNICA DE RECUENTO DE COLONIAS A 30°C.

ORTIZ, LM. (2003). Material didáctico de Microbiología de Alimentos: Recuento de

microorganismos aerobios mesófilos. Obtenido el 01 de febrero de 2008 en
http://www2.uah.es/farmacia/programas/microbiologia/material_didactico_de
_microlimentos.htm

PASCUAL, MR y CALDERÓN, V. (1999). Microbiología alimentaria. Metodología analítica para

alimentos y bebidas. 2° Ed. Ediciones Días de Santos.
THATCHER, FS. (1995). Análisis microbiológico de los alimentos. Zaragoza. Acribia, 271 p.

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 Práctica 2. Efecto de los factores físicos sobre el
crecimiento microbiano

I. INTRODUCCIÓN

La capacidad de los microorganismos para crecer en un alimento está determinada por el

ambiente interno del alimento y por el ambiente en el cual el alimento se encuentra
almacenado, designados como factores intrínsecos y extrínsecos, respectivamente. Los
factores intrínsecos del alimento que influyen en el crecimiento microbiano son los nutrientes,
la actividad de agua (Aw), el pH, el potencial de óxido reducción (Redox), las sustancias
antimicrobianas y la estructura biológica. Por otra parte, los factores extrínsecos son la
temperatura, la humedad relativa, el ambiente gaseoso y la presencia y actividad de otros
microorganismos.

El conocimiento de la influencia de estos factores permite explicar el crecimiento y distribución

de los microorganismos en los alimentos y la forma en que dichos factores se pueden usar
para el control de microorganismos alterantes que dan lugar a pérdidas económicas en la
industria alimentaria y microorganismos patógenos causantes de enfermedades transmitidas
por alimentos.

El objetivo de esta práctica es determinar cómo influyen algunos factores físicos sobre el
crecimiento microbiano de algunos microorganismos in vitro.

II. INSUMOS, MATERIALES Y EQUIPOS

Insumos

Cultivos bacterianos y de levadura en caldo BHI pre-incubados durante 24-48 horas:

– Pseudomonas aeruginosa
– Bacillus cereus
– Escherichia coli
– Salmonella
– Staphylococcus aureus
– Saccharomyces cerevisiae
Materiales
– Tubos de agar Tripticasa Soya (TSA) inclinado (15 tubos) x triplicado.
– Dos series de tubos con caldo BHI + NaCl a cinco concentraciones diferentes: 0.85%,
3.5%, 7%, 10% y 15% (10 tubos en total) x triplicado.
– Dos series de tubos con caldo BHI + Sacarosa a cuatro concentraciones diferentes: 3%,
7.5%, 15% y 30% (8 tubos en total) x triplicado.
– Dos series de tubos con caldo BHI a cuatro pH diferentes: 3.0, 5.0, 7.0 y 9.0 (8 tubos en
total) x triplicado.
– Placas de agar TSA (2 placas) x triplicado.
– Asas bacteriológicas.
– Pipetas de 1 ml.

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 – Gradillas.
– Marcador Sharpie.
– Cronómetro.
Equipos
– Nevera.
– Incubadora a 37C.
– Incubadora a 28C.
– Baño María a 60C.

III. PROCEDIMIENTO (dividir por grupos)

1. Determinación de la temperatura óptima de crecimiento (Grupo 1)

– Tomar una asada de cada uno de los cultivos bacterianos pre- incubados en caldo BHI:
E. coli, P. aeruginosa, B. cereus, Salmonella y S. aureus.
– Sembrar tres lotes de tubos de agar TSA inclinado con cada uno de los cultivos
bacterianos pre-incubados en caldo BHI.
– Incubar el primer lote a temperatura de refrigeración durante 24 horas.
– Incubar el segundo lote de las mismas bacterias a temperatura ambiente durante 24
horas.
– Incubar el tercer lote de bacterias en una incubadora a 35C durante 24 horas.
– Registrar los resultados del crecimiento bacteriano en cruces. (+): crecimiento mínimo,
(++): crecimiento regular y (+++): crecimiento máximo.
– Determinar la temperatura de crecimiento óptima para cada bacteria, que será donde
se observe el mejor crecimiento.

2. Efecto letal de la temperatura sobre las bacterias (Grupo 2)

En este experimento se determinará a) el punto de muerte térmica (PMT) y b) el tiempo de
destrucción térmica (TDT):
– Con un marcador divida el reverso de una placa de agar TSA en cinco partes.
– A partir de un cultivo de E. coli en caldo BHI de 24 horas de incubación, sembrar por
estría una división de la placa de agar TSA. Marcar el reverso con una clave.
– Colocar el tubo del cultivo bacteriano en un baño María a 60C.
– Tomar una asada a intervalos de 10 minutos y sembrar cada vez en una de los sectores
de la placa de agar TSA hasta completar los 40 minutos.
– Incubar a 37C durante 24 horas.
– Determinar el punto térmico mortal de E. coli.
Hacer lo explicado anteriormente con la bacteria esporulada B. cereus para determinar su
tiempo térmico mortal.

3. Influencia de la presión osmótica (Grupos 3 y 4)

– Disponer de dos series de cinco tubos de caldo BHI adicionado con NaCl en diferentes
concentraciones, al 0.85%, 3.5%, 7%, 10% y 15% y un control sin NaCl.

9
 – Inocular una serie de tubos con 0.1 ml por tubo de E. coli y otra serie con S. aureus.
Homogenice cada tubo.
– Disponer de dos series de cuatro tubos de caldo BHI adicionado con sacarosa en
diferentes concentraciones, al 3%, 7.5%, 15% y 30% y un control sin sacarosa.
– Inocular una serie de tubos con 0.1 ml por tubo de E. coli y otra serie con S. aureus.
Homogenice cada tubo.
– Incubar a 35C por 24 horas.
– Registrar el grado de turbidez de los tubos inoculados en cruces (+).

4. Influencia del pH (Grupo 5)

– Preparar dos series de tubos con caldo BHI y con diferentes pH (3.0, 5.0, 7.0 y 9.0).
– Inocule una serie con 0.1 ml de E. coli y otra serie con la levadura S. cerevisiae.
– Incubar la bacteria a 35C y la levadura 28C.
– Registrar el grado de turbidez de los tubos inoculados en cruces (+).
Anexo 1. Formato para registrar los resultados de la práctica.

IV. CUESTIONARIO

1. Defina: punto de muerte térmica, tiempo de destrucción térmica y tiempo de reducción

decimal.

2. ¿Qué efecto tiene el pH sobre los microorganismos que podrían crecer en los
alimentos?

3. ¿Cómo afecta la actividad de agua sobre los microorganismos que podrían crecer en los
alimentos?

4. ¿Qué mecanismos usan los microorganismos para regular el efecto de ambos factores
algunos microorganismos?
5. Explique cuáles son las diferencias que existen entre el crecimiento en condiciones
óptimas de laboratorio y el crecimiento en los alimentos de las poblaciones
microbianas.

V. BIBLIOGRAFÍA
ALARCÓN, LR.; OLIVAS, E. Manual de prácticas de Microbiología básica y Microbiología de
alimentos. Universidad Autónoma de Ciudad de Juárez (UACJ). 2001
JAY, J. Microbiología Moderna de los Alimentos. 3° edición. Zaragoza: Editorial Acribia, 1994.
PRADO, A.; RODRIGUEZ, S.; FIGUEROA, I.; SHIRAI, K. Manual de prácticas de laboratorio.
Microbiología de Alimentos. Universidad Autónoma Metropolitana. 2013
RAY, B. Fundametal Food Microbiology. 3° edition. CRC Press Editorial. 2004.

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Anexo 1. Formato para registrar los resultados de la
practica 2

Tabla1. Determinación de la temperatura óptima de crecimiento

Crecimiento bacteriano
Cepa
T. Refrigeración T. ambiente T. incubación 37°C
E. coli
P. aeruginosa
B. cereus
Salmonella
S. aureus

Tabla 2. Efecto letal de la temperatura sobre las bacterias

Tiempo a 60°C (minutos)
Cepa
0´ 10´ 20´ 30´ 40´
E. coli
B. cereus

Tabla 3. Influencia de la presión osmótica

Cepa Concentración de NaCl
C 0.85% 3.5% 7% 10% 15%
E. coli
S. aureus
Cepa Concentración de sacarosa
C 3% 7.5% 15% 30
E. coli
S. aureus

Tabla 4. Influencia del pH

pH
Cepa
3.0 5.0 7.0 9.0
E. coli
S. cerevisiae

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 Práctica 3. Enumeración de coliformes, coliformes fecales y
E. coli por la técnica de Número Más Probable (NMP)

I. INTRODUCCIÓN

Los coliformes son un grupo de bacterias de la familia Enterobacteriaceae que se

caracterizan por su capacidad para fermentar la lactosa con producción de ácido y gas, en
un periodo de 48 horas y a una temperatura de incubación entre 30 y 35°C. Del grupo
coliformes forman parte los géneros bacterianos Escherichia, Enterobacter, Klebsiella y
Citrobacter. Estos microorganismos son ubicuos, se encuentran ampliamente distribuidos
en la naturaleza, el suelo, agua y también son carga normal del intestino del hombre y
animales de sangre caliente.

Dentro del grupo de los coliformes existe un subgrupo que es el de los coliformes fecales o
termotolerantes, que fermentan la lactosa con producción de ácido y gas a una
temperatura de 44,5°C en presencia de sales biliares. Los coliformes fecales comprenden
principalmente la especie bacteriana Escherichia coli y algunas cepas de Klebsiella. El
verdadero índice de contaminación fecal es E. coli ya que su origen fecal es seguro.

Actualmente, los 3 grupos se utilizan como indicadores pero para diferentes aplicaciones.
La detección de coliformes se utiliza como un indicador de la calidad sanitaria de agua o
como un indicador general de condiciones sanitarias en el entorno de procesamiento de
alimentos. Los coliformes fecales siguen siendo el indicador de elección para la cría de
moluscos y mariscos en aguas de recolección y E. coli se utiliza para indicar la
contaminación fecal reciente o procesamiento antihigiénico (BAM-FDA, 2002).

El propósito de la presente práctica de laboratorio es proveer las herramientas necesarias

para que los estudiantes se capaciten en la técnica de siembra por NMP para la
enumeración de coliformes, coliformes fecales y E. coli.

II. INSUMOS, MATERIALES Y EQUIPOS

Insumos y reactivos

 Muestras de alimentos sólidos (queso, harina, leche en polvo, cárnicos, etc.) o

alimentos líquidos (leche pasteurizada, jugos, gaseosas, etc.).
 Agua peptonada tamponada (APT) 0,1%.
 Caldo Lauril Sulfato Triptosa (LST).
 Caldo lactosa bilis verde brillante (LBVB).
 Caldo E.C.
 Agar EMB (eosina azul de metileno).
 Agua de triptona (Tryptone Water: TW).
 Reactivo de Kovacs.

Materiales
 Tubos de ensayo con 9 ml de APT 0,1%.
 Tubos de ensayo con los diferentes caldos de cultivo.
 Frascos con 90 ml de APT 0,1%.
 Gradillas.
 Pipetas estériles de 10 y 1ml.
 Cajas de Petri con agar EMB.

12
  Asas bacteriológicas.
 Pipetas Pasteur.
 Vasos para licuadora.
 Propipeteadores.
 Utensilios para preparación de muestras.

Equipos
 Estufa de cultivo regulada a 35°C.
 Baño María regulado a 44,5°C.
 Licuadora.
 Balanza.

III. PROCEDIMIENTO
Preparación de muestra y diluciones
1. Pesar o medir asépticamente 10 g/10 ml de la muestra y homogenizar con 90 ml de APT
0,1%.
2. Realizar 2 diluciones decimales seriadas de 10-2 y 10-3 a partir de la dilución inicial
transfiriendo 1 ml a tubos con 9 ml de APT 0,1%.

Prueba Presuntiva
1. Preparar en una gradilla tres series de tres tubos cada una con 10 ml de caldo LST y
campana Durham.
2. Sembrar 1ml de cada una de las diluciones preparadas a cada uno de los tres tubos de
cada serie:
 A tres tubos de la primera serie se adiciona 1ml de dilución 1:10.
 A tres tubos de la segunda serie se adiciona 1ml de dilución 1:100.
 A tres tubos de la tercera serie se adiciona 1ml de dilución 1:1000.
3. Incubar a 35C haciendo lecturas a las 24 y 48 horas.

Lectura e interpretación de la prueba presuntiva:

Observación de la generación de gas depositado en la campana Durham (al menos en 1/10
parte de su volumen) y de la aparición de turbidez y coloración amarilla en el medio de cultivo
como consecuencia de la fermentación de la lactosa. Seleccionar los tubos positivos (turbidez +
gas) y desechar los demás.

Prueba confirmativa
1. Sembrar con asa bacteriológica una muestra de los tubos positivos en LST (turbidez y gas)
en tubos con caldo LBVB y caldo EC y campana Durham.
2. Incubar los tubos con LBVB a 35C durante 18-24 horas para confirmación de coliformes
totales.
3. Incubar los tubos con caldo EC a 44,5C durante 18-24 h para coliformes fecales.

Lectura e interpretación de la prueba confirmativa

- Coliformes totales: La reacción es positiva cuando se produce crecimiento (turbidez en el
tubo) y desprendimiento de gas en la campana Durham en los tubos con caldo LBVB.
- Coliformes fecales: La reacción es positiva cuando se produce crecimiento (turbidez en el
tubo) y desprendimiento de gas en la campana Durham en los tubos con caldo E.C.
- Determinar NMP de coliformes fecales.
- Todos los tubos de caldo E.C. confirmados como positivos (turbidez + gas) de organismos
coliformes fecales en cada dilución se utilizan para el aislamiento de E. coli en agar EMB y
comprobación bioquímica de la producción de indol.

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Confirmación de E. coli
Para la investigación y recuento de E. coli se parte de los tubos confirmados como positivos
(crecimiento y formación de gas a 44,5 C) para coliformes fecales en el medio E.C., de acuerdo
con los siguientes pasos.
1. Sembrar por estría con asa bacteriológica los tubos positivos en agar EMB.
2. Incubar a 35C durante 24-48 horas.
3. La aparición de colonias con brillo verde metálico o negras confirma la presencia de
coliformes.
4. Anotar el número de tubos confirmados en cada serie y recurrir a la tabla del NMP donde
se obtiene el recuento por gramo o mililitro de alimento.

Resultados Dilución 10-1 Dilución 10-2 Dilución 10-3

Nº tubos positivos
(coliformes)
Nº tubos confirmados
(coliformes)
Nº tubos positivos
(coliformes fecales)

NMP coliformes/g:
NMP coliformes fecales/g:
5. Para investigar la producción de indol se siembran 1-2 colonias de cada placa en tubos con
agua de triptona (TW).
6. Incubar en baño María a 44,5 ºC durante 24 horas.
7. Pasado este tiempo se incorporan 0,2 ml del reactivo de Kovacs a cada tubo. La reacción
positiva se manifiesta por la formación de un anillo rojo en la superficie del medio; la
reacción negativa muestra anillo amarillento. E. coli al desaminar e hidrolizar el triptófano
del medio, produce indol que se pone de manifiesto al añadir el reactivo de Kovacs.
8. Cuando coincide crecimiento positivo (gas) en caldo BGBL a 44,5°C, crecimiento
característico sobre agar y EMB producción de indol, se hace la lectura en la tabla del NMP
para obtener el número de E. coli por gramo o mililitro de muestra.

VI. CUESTRIONARIO
1. Consulte la composición, empleo e interpretación de cada uno de los medios de cultivo
usados en esta práctica (Elabore una tabla).
2. Haga un diagrama de flujo para describir el procedimiento de recuento el placa de
coliformes y Escerichia coli, especificando medio de cultivo, tiempo y temperatura de
incubación, cálculo y expresión de resultados.
3. Elabore una tabla donde especifique mínimo 20 alimentos a los cuales se le deba
determinar coliformes y E. coli, sus límites microbiológicos y la normativa que lo establece
en Colombia. Aclare en cada alimento, si la determinación se hace por NMP o por recuento
en placa.
4. Haga un cuadro comparativo entre la determinación de Enterobacteriaciae lactosa-
positivas, Enterobacteriaciae totales y E. coli O175:H7 en cuanto a definición, métodos de
recuento o detección, e interpretación.
5. Consulte e imprima las tablas de NMP cuando se siembras tres o cinco tubos para cada
dilución.

14
VII. BIBLIOGRAFÍA
ARAMBULA, AL y MURCIA, GM. (1987). Fundamentos y técnicas microbiológicas de alimentos.
Santander: Universidad Industrial de Santander.

BACTERIOLOGICAL ANALYTICAL MANUAL (2002). Enumeration of Escherichia coli and the

Coliform Bacteria. Disponible en:
http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm064948.htm#conve
ntional

NORMA TÉCNICA COLOMBIANA (2009). NTC 4516. MÉTODO HORIZONTAL PARA LA

DETECCIÓN Y ENUMERACIÓN DE COLIFORMES TÉCNICA DEL NÚMERO MÁS PROBABLE.

NORMA TÉCNICA COLOMBIANA (2001). NTC 4899. MÉTODO PARA LA DETECCIÓN DE

Escherichia coli O157.

PASCUAL, M.R y CALDERÓN, V. (1999). Microbiología alimentaria. Metodología analítica para

alimentos y bebidas. 2° Ed. Ediciones Días de Santos.

THATCHER, FS. (1995). Análisis microbiológico de los alimentos. Zaragoza. Acribia, 271 p.

15
 Práctica 4. Recuento de mohos y levaduras

I. INTRODUCCIÓN

Los mohos y las levaduras se encuentran ampliamente distribuidos en el ambiente, pueden

encontrarse como flora normal de un alimento, o como contaminantes en equipos mal
sanitizados. Ciertas especies de hongos y levaduras son útiles en la elaboración de algunos
alimentos, sin embargo también pueden ser causantes de la descomposición de otros. Debido
a su crecimiento lento y a su baja competitividad, los hongos y levaduras se manifiestan en los
alimentos donde el crecimiento bacteriano es menos favorable. Estas condiciones pueden ser
bajos niveles de pH, baja actividad de agua, alto contenido en sales o carbohidratos, baja
temperatura de almacenamiento y la presencia de antibióticos; por lo cual generan
importantes pérdidas económicas en la industria de frutas frescas, jugos, vegetales, quesos,
cereales, alimentos salazonados y encurtidos, así como en alimentos congelados y
deshidratados, cuyo almacenamiento se realiza en condiciones inadecuadas. Además, existe el
peligro potencial de producción de micotoxinas por parte de algunos géneros de mohos.

Para conocer la calidad microbiológica de este tipo de productos, se debe evaluar su tasa de
contaminación por mohos y levaduras usando los mismos métodos de recuento usados para
las bacterias (recuento en placa), pero por siembra en superficie. Los mohos y levaduras se
desarrollan en condiciones de aerobiosis, en medios de cultivo que favorezcan su desarrollo, a
temperaturas que varían entre 20 y 25°C. Para el recuento de mohos y levaduras se utilizan
medios ácidos (pH 5,6), con concentraciones relativamente elevadas de azúcar y que además
contienen antibióticos de amplio espectro para inhibir el crecimiento bacteriano.

El propósito de esta práctica de laboratorio es brindar a los estudiantes las bases

metodológicas para que sean capaces de hacer el recuento de mohos y levaduras en alimentos
por el método de recuento en placa con siembra en superficie y la interpretación de los
resultados obtenidos en dicho recuento.

II. MATERIALES

Reactivos e insumos
- Muestras de alimentos sólidos (queso, carne, arepa, huevo, frutas, cereales, etc.) o
alimentos líquidos (jugo, yogur, leche, salpicón de frutas, etc.).
- Agar YGC (Yeast Extract Glucose Chloramphenicol Agar).
- Diluyente: Agua peptonada tamponada 0,1% (APT).
- Alcohol al 70%.

Materiales
- Pipetas de 1 y 10 ml.
- Tubos de ensayo con 9 ml de APT.
- Erlenmeyer con 90 ml de APT.
- Cajas de Petri con agar YGC.
- Jarra para licuadora.
- Utensilios para preparación de la muestra.
- Asa de Drigalsky.

Equipos
- Licuadora.
- Incubadora regulada a 25°C.

16
- Balanza.

III. PROCEDIMIENTO

A. Preparación de la serie de diluciones

1. Suspender 10 g de la muestra en 90 ml de APT para preparar la dilución inicial (1:10).

2. Partiendo de esta dilución, se realizan las diluciones decimales seriadas (1:100, 1:1000,
1:10.000, etc.), en tubos con 9 ml de APT.

B. Siembra en superficie

3. Partiendo de la “serie de diluciones decimales”, seleccionar dos diluciones consecutivas y,

por duplicado, transferir 0,1 ml de cada una de las diluciones a placas con agar YGC,
previamente marcadas.

4. Diseminar el inoculo por toda la superficie del agar, sin romperlo, con ayuda del asa de
Drigalsky.

5. Dejar que el inoculo sea absorbido y colocar todas las placas sin invertir en estufa regulada
a 25°C, por un periodo de incubación de 5 días.

6. Trascurrida la incubación, hacer el recuento de colonias de mohos y levaduras y calcular el

número de UFC por gr/ml del producto analizado.

IV. CUESTIONARIO

1. ¿Cuál es la importancia de la determinación de mohos y levaduras y qué información

brinda un alto recuento de este indicador en productos alimenticios?

2. Haga una tabla con la composición y el fundamento de los medios de cultivo que se
pueden usar para el recuento de mohos y levaduras incluyendo el YGC que será utilizado
en esta práctica de laboratorio.

3. Consulte por lo menos tres normas para el método de recuento de mohos y levaduras y
haga un cuadro comparativo para establecer las diferencias en el procedimiento.

4. Enumere por lo menos 10 alimentos en los que se exige el recuento de mohos y levaduras
como indicador de calidad microbiológica. Especifique los límites permisibles de este
indicador para cada uno de los alimentos mencionados y cite la normativa.

5. Investigue qué son las micotoxinas, qué tipos de micotoxinas se han encontrado, qué
géneros de hongos las producen y en qué de alimentos se producen. (Haga una tabla
resumen).

6. Indique cuáles son las metodologías usadas para determinar que un alimento tiene
micotoxinas.

17
 V. BIBLIOGRAFÍA

LISANDRO SIGNORINI, M., SEQUEIRA, GJ., BONAZZA, JC. et al. (2008). Utilización de
microorganismos marcadores para la evaluación de las condiciones higiénico-sanitarias en la
producción primaria de leche. Rev. Cient. (Maracaibo), Vol.18, No.2, p.207-217. ISSN 0798-
2259.

PASCUAL, M.R y CALDERÓN, V. (1999). Microbiología alimentaria. Metodología analítica para

alimentos y bebidas. 2° Ed. Ediciones Días de Santos.

THATCHER, FS. y CLARK, DS., (1993) Análisis Microbiológico de los Alimentos. Edit. Acribia.
Zaragoza.

18
 Práctica 5. Análisis microbiológico de ambientes y
superficies en la industria alimentaria

I. INTRODUCCION
Los microorganismos se encuentran presentes en todos los ambientes: aire, agua, superficie
de los objetos e incluso sobre nuestra piel. A pesar de que todavía no existe un documento
legal en Colombia que exija el control microbiológico de ambientes, superficies y
manipuladores del sector alimentario, cada vez éste es más consciente de la importancia que
tiene verificar el plan de limpieza y desinfección ejecutado. El control microbiológico de
ambientes, superficies y manipuladores es necesario para la evaluación de las condiciones
higiénicas de las áreas de trabajo en la industria alimentaria, ya que de esto dependerá el
número y tipo de microorganismos presentes en los alimentos.

Por otra parte, en una planta procesadora de alimentos, el manipulador de alimentos juega un
papel importante en la fabricación de sus productos, ya que se puede convertir en una fuente
de contaminación. Muchos sitios del cuerpo humano albergan una carga microbiana normal,
los sitios de importancia donde residen los microorganismos saprófitos y que se constituyen en
una fuente de contaminación son la piel y el tracto respiratorio (fosas nasales y faringe).

Por último, los equipos, utensilios y superficies utilizados en el procesamiento, fabricación,

conservación o preparación de alimentos, deben estar diseñados, construidos, instalados y
mantenidos de tal forma que se evite la contaminación de los alimentos y se facilite el proceso
de limpieza y desinfección de los mismos. Igualmente es importante el estudio microbiológico
del aire (ambiente), ya que éste se pone en contacto con los alimentos, por eso se debe estar
seguro de trabajar en un ambiente adecuado, debidamente desinfectado o esterilizado.

El propósito de esta práctica de laboratorio es brindar a los estudiantes la capacitación en los

procedimientos para toma de muestras y análisis microbiológicos de ambientes y superficies,
que podrían ser fuente de contaminación de alimentos en la industria.

II. MATERIALES, EQUIPOS, REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO

- Placas con agar Baird Parker (BP).

- Placas con agar Plate Count (PC).
- Placas con agar Yeast Extract Glucose Chloramphenicol (YGC).
- Placas con agar Eosina Azul de Metileno (EMB).
- Tubos de tapa a rosca que contengan 2–3 ml de agua peptonada tamponada (APT) al 0,1%.
- Hisopos de algodón.
- Baja lenguas.
- Esponja.
- Bolsa de plástico.
- Rejilla delimitadora de área.
- Incubadora a 35°C.
- Incubadora a 25°C.
- Cuenta colonias.

III. PROCEDIMIENTO

En el siguiente cuadro se especifica los microorganismos indicadores de contaminación que se

realizarán en ambientes, superficies y manipuladores:

19
 Ambiente Superficies Manipuladores
Aerobios mesófilos Aerobios mesófilos Staphylococcus aureus
Mohos y levaduras Enterobacterias Enterobacterias

ANÁLISIS DE AMBIENTES

Técnica de sedimentación

1. Escoger una de las plantas de alimentos de la UTA para evaluar la carga microbiana de su
ambiente por medio de recuento de aerobios mesófilos (PCA) y mohos y levaduras (Agar
YGC).
2. Llevar las placas que se van a utilizar completamente cerradas, con cuidado de que no se
abran durante el transporte a la planta escogida.
3. Destapar las cajas de Petri y dejarlas abiertas durante 15 minutos.
4. Cerrar las cajas de Petri y llevar al laboratorio para su incubación durante:
- 48 horas a 37°C las placas de PC
- 4 a 5 días a 25°C las placas de YGC
5. Realizar el recuento de aerobios mesófilos y mohos y levaduras e informar los resultados
obtenidos.

ANÁLISIS DE SUPERFICIES

Cada grupo debe seleccionar la superficie a analizar de un equipo, utensilio o mesón presente
en una de las plantas de alimentos de la UTA.

Método del hisopo

1. Delimitar la superficie que se va a analizar usando una plantilla con una abertura de área
conocida (p. ej. 100 cm2)
2. Humedecer un hisopo estéril con APT 0,1% y restregar varias veces sobre la superficie
delimitada por la plantilla.
3. Introducir el escobillón en el tubo con APT 0,1% y dejar durante 15-30 min de manera que
los microorganismos se liberen del algodón al diluyente.
4. Sembrar 0,1 ml de la suspensión placas con agar PC y EMB por duplicado para recuento de
Aerobios Mesófilos y Enterobacterias, respectivamente.
5. Rastrillar el inóculo con el asa de Drigalsky haciendo una siembra masiva por toda la
superficie del medio de cultivo.
6. Incubar las placas de cultivo a 35°C durante 24- 48 horas.
7. Contar las colonias que hayan crecido posterior al tiempo de incubación y dividir por el
área muestreada.
8. Expresar los resultados.

ANÁLISIS DE MANIPULADORES

Toma de muestra de manipuladores por el método del hisopo

Manos

1. Humedecer el hisopo en el APT 0,1% y frotar la superficie de la palma de la mano haciendo

rotar el hisopo.
2. Lavar el hisopo en el diluyente, drenar el exceso de líquido en la pared del tubo.
3. Frotar la zona entre los dedos, repetir la limpieza del hisopo y pasar el hisopo por las uñas.

20
4. Finalizando el frotis, sumergir el hisopo en el tubo con el diluyente.
5. Repetir la misma operación para la otra mano.
6. Ambos hisopos se colocan en el mismo tubo con APT 0,1% y se dejan durante 15-30
minutos. Se considera como una sola muestra.

Método de siembra de muestras tomadas a manipuladores

1. Sembrar directamente el hisopo (siembra masiva) en la superficie de cada una de las dos
placas con agar BP y EMB.
2. Incubar las placas en posición invertida a 35°C durante 24 y 48 horas.
3. Observar el crecimiento de colonias características en cada uno de los medios de cultivo.
En agar Baird Parker las colonias de Staphylococcus aureus crecen negras rodeadas por
halos claros que contrastan con la opacidad del medio de cultivo. En agar EMB muchas
cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp. presentan un característico brillo metálico. Las
cepas que utilizan la lactosa poseen centro oscuro con periferia azulada o rosada, mientras
que las que no lo hacen son incoloras.

IV. CUESTIONARIO

1. ¿Qué métodos NO convencionales de toma de muestras en ambientes y superficies

existen? ¿Qué ventajas presentan frente a los métodos convencionales empleados en
esta práctica?
2. Haga una tabla donde se muestre cómo se expresan los resultados de los análisis
realizados microbiológicos en ambientes, superficies (regulares e irregulares) y
manipuladores.
3. Consulte las normas disponibles a nivel internacional y nacional sobre técnicas de
muestreo en superficies en la industria de alimentos en general y en la industria cárnica.
4. Consulte y haga una tabla con los diferentes límites microbiológicos disponibles a nivel
internacional para indicadores de limpieza y desinfección en ambientes y superficies de
la industria alimentaria.
5. Investigue qué es un biofilm en la industria alimentaria, cuáles son los patógenos
bacterianos que más lo forman y cuáles son los factores que favorecen su formación.

V. BIBLIOGRAFIA

GAMAZO, C., López-Guñi, I. y Díaz, R. (1995). 2005. Manual práctico de microbiología. (3ª ed.).
España: Editorial Masson S.A. 2005.

GÓMEZ, FJ. y Salgado, MT. 2006. Manual de procedimientos e instructivos. Laboratorio de

Microbiología de Alimentos de la Unidad Tecnológica de Alimentos (UTA) de la Universidad de
Caldas.

Guia de práctica de microbiologia. 2005. Departamento de Microbiología II. Facultad de

Farmacia. Universidad Complutense. Disponible en:
http://www.ucm.es/info/mfar/pdfs/CYTA/Guia_CYTA_1.pdf

FUSTER, N. 2007. Importancia del control higiénico de las superficies alimentarias mediante
técnicas rápidas y tradicionales para evitar y/o minimizar las contaminaciones cruzadas.
Disponible en: http://www.tesisenxarxa.net/TDX-1005107-165210/index_cs.html

MICHANIE, S. 2012. Apuntes de laboratorio. Volumen II Monitoreo de la higiene de superficies.

Disponible en: http://www.britanialab.com/files/tcientificos/17.pdf

21
 Práctica 6. Detección de Salmonella spp.

I. INTRODUCCIÓN

Salmonella spp. es un género bacteriano perteneciente a la familia Enterobacteriacea y

es siempre considerado como potencialmente patógeno ya que es la causa más común
de enfermedades trasmitidas por alimentos. Se caracteriza por ser un bacilo Gram
negativo, móvil, anaerobio facultativo, fermentador de la glucosa, no fermentador de
la lactosa, catalasa positiva y oxidasa negativa.

Las salmonelosis comprenden un conjunto de cuadros clínicos cuya principal

manifestación es la gastroenteritis aguda, una de las intoxicaciones alimentarias más
comunes causadas por la ingestión de agua y alimentos contaminados. Los síntomas
consisten en escalofríos, cefalea, nauseas, anorexia, tos, diarrea o estreñimiento
(Colaboradores de Wikipedia, 2014).

Salmonella spp. puede ser aislada de productos alimenticios o heces fecales de

humanos y animales y la única forma de transmisión es la oral, por lo que es de suma
importancia el análisis de los alimentos para detectar su presencia en ellos. Los
alimentos más contaminados son los de origen animal, incluyendo huevos y
ovoproductos, leche cruda y productos lácteos, carnes y derivados y aves de corral
(Escobar, 1994).

El propósito de esta práctica es capacitar a los estudiantes del programa de Ingeniería

de Alimentos de la Universidad de Caldas en la realización de un método cualitativo
para el aislamiento e identificación de Salmonella spp. a partir de alimentos de origen
animal o vegetal.

II. INSUMOS, MATERIALES Y EQUIPOS

Insumos
- Muestra: productos cárnicos, mayonesa, queso fresco, bizcocho, sopa o crema
instantánea.
- Agua peptonada tamponada (APT) 0,1%.
- Medio Rappaport-Vassiliadis (RV).
- Agar Xilosa Linisa Desoxicolato (XLD).
- Agar Salmonella Shigella (SS).
- Agar Triple Hierro Azúcar (TSI).
- Caldo Urea.
- Agar Lisina Hierro (LIA).
- Medio de movilidad semisólido.
- Reactivo de Kovacs.
- Agar Citrato de Simmons.

Materiales
- Pipetas de 1 ml.
- Tubos de ensayo con 10 ml de caldo RV.
- Tubos con los deferentes medios para pruebas bioquímicas.

22
- Gradillas.
- Frasco con 225 ml de APT 0,1%.
- Caja de Petri con agar S-S.
- Frasco o jarra para licuar las muestras.
- Utensilios: chuchillos, tenedores, cucharas, espátulas, etc.
- Asa bacteriológica.
- Asa de punta.

Equipos
- Incubadora regulada a 37°C
- Baño María regulado a 41,5°C
- Balanza
- Licuadora

III. PROCEDIMIENTO

1. Pesar 25 g o medir 25 ml de la muestra de alimento y agregar en un frasco estéril

de 500 ml.

2. Agregar 225 ml de APT 0,1% (pre-enriquecimiento no selectivo).

3. Incubar en estufa regulada a 35 ± 2°C por 18 ± 2 h.

4. Pasado este tiempo, inocular 0,1 ml de la muestra pre-enriquecida en un tubo con

10 ml de Caldo RV e incubar en Baño María regulado a 41,5°C por 24 ± 3 h.

5. Pasado el tiempo de incubación, inocular una asada del cultivo en caldo RV por el
método de agotamiento o estriado en placas con agar XLD y S-S. Incubar las cajas a
35 ± 2°C por 24 ± 3 h.

6. Observar las colonias típicas lactosa negativa y sulfuro + típicas de Salmonella spp.
en agar SS y XLD.

7. A partir del cultivo en agar selectivo escoger las colonias típicas que estén más
aisladas para realizar las pruebas bioquímicas que se especifican a continuación:

– TSI
– Urea
– Citrato de Simmons
– LIA
– Movilidad en SIM medio
– Indol

8. Incubar a 35 ± 2°C por 24 ± 3 h.

9. Luego de la incubación, agregar 3-5 gotas de reactivo de Kovac´s al tubo con SIM
medio para determinar producción de Indol y realizar la lectura e interpretación de
todas las pruebas bioquímicas.

23
IV. CUESTIONARIO

1. Enumere las fases del ensayo de detección de Salmonella spp. y describa para qué
se realiza cada una.

2. Haga una tabla para enumerar los medios de enriquecimiento selectivo y los
agares de aislamiento selectivo que se utilizan en el ensayo de detección de
Salmonella spp. Describir su composición y fundamento.

3. Enumere y describa brevemente los métodos rápidos usados para la detección de

Salmonella spp. en la industria alimentaria.

4. Investigue datos epidemiológicos sobre brotes de salmonelosis en Colombia y a

nivel mundial y por lo menos un caso de reporte de retiro de alimentos del
mercado por contaminación con Salmonella spp.

5. Haga una tabla para enumerar por lo menos 10 alimentos en los cuales es requisito
detectar la presencia de Salmonella spp. y cuál es la norma que lo establece en
Colombia.

V. BIBLIOGRAFÍA

ESCOBAR DUQUE, María Beatriz. (1994) Manual de técnicas y procedimientos.

Programa Latinoamericano de microbiología e higiene de los alimentos. Universidad de
Antioquia, Facultad de Salud Pública Héctor Abad Gómez. Medellín.

ICONTEC. (2007). Norma Técnica Colombiana NTC 4574. Método horizontal para la
detección de Salmonella spp.

LYNN, E Ann Mc Landsborough (2004). Food microbiology laboratory. Volumen 17 de

CRC series in contemporary food science. CRC Press, ISBN 0849312671,
9780849312670. 179 págs.

RIBEIRO, Vinicius B., ANDRIGHETO, Cristiano, BERSOT, Luciano S. et al. (2007).

Serological and genetic diversity amongst Salmonella strains isolated in a salami
processing line. Braz. J. Microbiol. [online], vol. 38, no. 1 [cited 2007-11-10], pp. 178-
182. Available from: [3]. ISSN 1517-8382.

WIKIPEDIA (2014). Salmonelosis. Disponible en:

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Salmonelosis&oldid=74337903 Fecha de
consulta: 27 de mayo del 2014.

24
 Práctica 7. Detección de Listeria monocytogenes

I. INTRODUCCIÓN

Listeria monocytogenes, es un cocobacilo Gram positivo, anaerobio facultativo, no esporulado,

catalasa positiva, móvil a una temperatura menor a 30°C y capaz de crecer en un amplio rango
de temperaturas (1°C a 45°C) y a una elevada concentración de sal (Wikipedia, 2014).

Listeria spp. ha sido aislada del suelo, agua, efluentes y heces. Los alimentos que han sido
implicados en casos de listeriosis son carnes de fiambre listas para consumir y perros calientes,
patés refrigerados o pastas untables a base de carne, leche y productos lácteos no
pasteurizados (crudos), queso blando hecho de leche no pasteurizada, como el queso fresco,
Feta, Brie y Camembert, marisco ahumado refrigerado, etc. (FoodSafety.gov, 2014).

Esta bacteria causa una enfermedad llamada listeriosis que puede suponer graves riesgos para
la salud de ciertos grupos poblacionales. En general, las mujeres embarazadas, las personas de
la tercera edad y las personas con sistema inmune debilitado corren mayor riesgo
(FoodSafety.gov, 2014). Es una enfermedad poco frecuente en humanos, pero
extremadamente grave. Tiene poca morbilidad, pero muy alta mortalidad (30%), que en el
caso de grupos sensibles se eleva aún más (hasta un 70%). Tiene un período de incubación
muy largo (unas 5 semanas), siendo muy difícil rastrear el alimento que la provocó. Los
síntomas son primero una forma intestinal asintomática parecida a la gripe y después puede
causar en embarazadas aborto; en niños, ancianos e inmunodeprimidos septicemia,
meningitis, endocarditis y neumonía; y en adultos sanos meningitis, meningoencefalitis y
trastornos respiratorios (Wikipedia, 2014).

En la presente guía de laboratorio se pretende instruir a los estudiantes de Ingeniería de

Alimentos de la Universidad de Caldas en un método cualitativo para determinar la presencia
de Listeria monocytogenes a partir de un producto alimenticio.

II. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS

Materiales (estériles)
- Utensilios.
- Frasco de vidrio boca ancha.
- Tubos de 16 x 160 mm con tapa rosca.
- Asa bacteriológica.
- Asa de punta.
- Vaso para licuadora.
- Portaobjeto.
- Cajas de Petri
Medios de cultivo, reactivos e insumos
- Muestra de alimento.
- Caldo Fraser ½ concentración.
- Oxoid Listeria agar cromogénico (OCLA).
- SIM medio.
- Agar base sangre.
- Sangre de cordero desfibrinada.
- Peróxido de hidrógeno al 3%.
Equipos:
- Incubadora regulada a 35°C.

25
- Incubadora regulada a 30°C
- Licuadora.
- Balanza.

III. PROCEDIMIENTO

Enriquecimiento selectivo
a. Tomar 25 gramos de la muestra de distintas porciones del producto a analizar.
b. Colocar esta cantidad de muestra en un frasco de licuadora y adicionar 225 ml de caldo
Fraser ½ concentración.
c. Homogenizar durante 30 segundos, transferir a un frasco estéril e incubar a 30°C durante
24 ± 2 horas.

Aislamiento selectivo
a. Agitar suevamente el frasco de enriquecimiento selectivo y con un asa estéril tomar 10 μl
de la muestra y sembrar por agotamiento en un agar selectivo para Listeria (OCLA).
b. Incubar por 24 h a 35°C.

Confirmación de Listeria monocytogenes

a. Observar la formación de colonias verde fluorescentes (verde-amarillo) con un halo opaco
alrededor de la colonia, características de L. monocytogenes.
b. Seleccionar como mínimo cinco colonias aisladas típicas y realizar las siguientes pruebas
bioquímicas:
– Reacción de la catalasa: se toma una colonia aislada y se suspende en una gota de
peróxido de hidrógeno al 3% en una lámina portaobjetos. La formación inmediata de
burbujas de gas indica una reacción positiva.
– Hemólisis en agar sangre: Estriar una colonia aislada en agar sangre de cordero al 5% e
incubar a 35°C por 48 h. Observar las placas con luz brillante y evidenciar la presencia
de hemólisis estrecha.
– Prueba de movilidad: Se inocula con asa recta por punción central en tubos con medio
SIM y se incuba a 25°C ± 2ºC por 2 a 5 días. Se observa el crecimiento típico en forma
de sombrilla alrededor de la punción.
IV. CUESTIONARIO

1. Consulte sobre la composición, empleo e interpretación de los medios que se usan para la
determinación de Listeria monocytogenes.

2. Elabore un cuadro donde describa el perfil bioquímico de las diferentes especies del
género Listeria.

3. Haga una tabla con 10 alimentos en los que es necesario determinar la presencia de L.
monocytogenes a nivel nacional y/o internacional y mencione la normativa que lo
establece.

4. Haga un diagrama de flujo del proceso de laboratorio para hacer Investigación de L.

monocytogenes según la NTC 4666. (Disponible en la biblioteca o en la UTA).

5. Investigue las pruebas rápidas disponibles para la detección de L. monocytogenes en

alimentos y su fundamento.

V. BIBLIOGRAFÍA

26
AFNOR UNI 03/04-04/05 (2003) Validation certificate for alternative analytical method
according to standard ISO 16140:

Foodsafety.gov Listeria. Disponible en:

http://espanol.foodsafety.gov/intoxicaci%C3%B3n/causas/bacteriasvirus/listeria/xtz/

ICONTEC. NTC 4666 (1999). Método horizontal para la detección de Listeria monocytogenes.
Parte 1. Método de detección.

MCLANDSBOROUGH, L. A. (2004). Food microbiology laboratory. Vol. 17 de CRC series in

contemporary food science. CRC Press, ISBN 0849312671, 9780849312670. 179 páginas

MARZOCCA, M. A. y otros (2004) Detección de Listeria monocytogenes en distintos productos

alimenticios y en muestras ambientales de una amplia cadena de supermercados de la ciudad
de Bahía Blanca. Obtenido el 15 de octubre de 2009 en
http://www.scielo.org.ar/pdf/ram/v36n4/v36n4a06.pdf

SANCHEZ, F, et al. (2006). Incidencia de especies de Listeria en una planta productora de

alimentos congelados. Ciencia UANL enero-marzo, año/vol. IX, número 001 pp. 51.56

WIKIPEDIA (2014). Listeria monocytogenes. Disponible en:

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Listeria_monocytogenes&oldid=77447860

27
 Práctica 8. Determinación de esporas de Clostridium sulfito
reductor (ECSR)

I. INTRODUCCIÓN

El grupo bacteriano sulfito reductor está integrado por gérmenes pertenecientes al género
Clostridium, que tienen la propiedad de reducir el ion sulfito a sulfuro en presencia del citrato
férrico u otra sal de metales pesados, formando colonias negras características. Se caracterizan
por tener una morfología bacilar, ser Gram positivos, anaerobios estrictos o facultativos y
formar esporas (Acosta y González, 1995, p 298). Las bacterias del género Clostridium son
ubicuas en el medio ambiente, y sus esporas se encuentran habitualmente en el suelo, polvo,
sedimentos, medio acuático, vegetación en descomposición y en el tracto digestivo de los
animales, incluido el hombre. En consecuencia, pueden transmitirse a una amplia gama de
alimentos, tanto crudos, como parcialmente tratados tales como las carnes curadas
(principalmente embutidos), conservas, fermentados, ahumados, productos envasados al
vacío, semiconservas vegetales y las especias.

Dentro de este grupo existen dos especies importantes para la industria alimentaria por su
capacidad de producir toxi-infecciones: Cl. perfringens y Cl. botulinum. La enfermedad
alimentaria causada por Cl. perfringens puede ocurrir cuando los alimentos como la carne se
cocinan sin el mantenimiento del calentamiento o la refrigeración adecuados antes de servir.
Los síntomas, que incluyen calambres abdominales intensos y diarrea, se han atribuido a una
enterotoxina producida durante la esporulación del organismo en el intestino (Rhodehamel &
Harmon, 2001).

La intoxicación causada por Cl. botulinum o botulismo alimentario se presenta tras un período
de incubación de 24 horas a 4 días después de la absorción de la toxina, varía desde formas
leves que no requieren atención médica hasta un cuadro grave que puede provocar la muerte
en 24 horas por una insuficiencia respiratoria. Los síntomas comienzan con afectación de los
nervios craneales, agravándose progresivamente la debilidad motora. Puede haber náuseas,
vómitos y dolor abdominal antes o después del comienzo de la parálisis, además de mareos,
visión borrosa y boca seca (Pérez-Pérez, 2003).

El recuento de Clostridium sulfito reductor se suele usar para evaluar la calidad higiénica del
agua y productos de origen animal y se basa en el recuento de colonias de células vegetativas
o sus esporas con capacidad sulfito-reductora, desarrolladas en un medio de cultivo específico
e incubadas en condiciones anaeróbicas durante un tiempo y temperatura determinadas.

El propósito de esta práctica de laboratorio es brindar a los estudiantes las herramientas

necesarias para determinar el número de esporas de Clostridium sulfito reductor (ECSR) a
partir de una muestra de alimento por métodos de siembra profunda en tubo.

II. INSUMOS, MATERIALES Y EQUIPOS

Insumos

- Muestra de alimento: cárnicos, bebidas azucaradas, alimentos para lactantes,

condimentos, jugos de frutas y verduras, etc.
- Agar sulfito polimixina-sulfadiazina (SPS).
- Agua peptonada tamponada (APT) 0,1%.
- Parafina estéril o agar-agar.

28
 Material

- Pipetas de 10 ml.
- Pipetas de 1 ml.
- Gradillas para tubos.
- Frascos con 90 ml de agua peptonada tamponada 1%.
- Tubos de ensayo con 3 ml de parafina o agar-agar esteril.
- Tubos de ensayo vacíos estériles.
- Tubos de ensayo con 10 ml de agar SPS fundido.
- Tubos de ensayo con 9 ml de agua peptonada tamponada 1%.

Equipos

- Baño de agua con temperatura constante a 80°C.

- Baño de agua con temperatura constante a 45°C.
- Incubadora regulada a 37°C.

III. PROCEDIMIENTO
1. A partir de la muestra seleccionada para la práctica, pesar 10 g o medir 10 mL y
depositarlos en un frasco con 90 mL de agua peptonada tamponada 0.1%.

2. Preparas las diluciones decimales sucesivas necesarias.

3. Escoger dos diluciones consecutivas y llevar los tubos a un baño de agua a 80°C durante 10
minutos, seguido de un enfriamiento rápido.

4. Tomar 4 tubos con agar SPS fundido y proceder a la inoculación profunda de las dos
diluciones consecutivas seleccionadas por duplicado, de la siguiente manera:

 Sembrar 1 ml de la cada dilución en un tubo con 10 ml de agar SPS fundido a 45°C.

 Con mucho cuidado se va depositando la muestra, de abajo hacían arriba en forma de

zigzag, procurando que el total de ésta quede en el agar y no se airee.

 Rápidamente pasar el tubo de agar SPS a la llave del agua para enfriarlo y dejar que se
solidifique.

 Una vez sólido, añadir una capa de parafina o agar-agar estéril de unos 3 cm de espesor
para conseguir condiciones de anaerobiosis.

 Este procedimiento se repite con los 3 tubos restantes.

5. Una vez inoculados todos los tubos, incubar a 37°C durante 24 a 48 h.

6. Transcurrido el período de incubación, contar en los tubos que contengan menos de 100
colonias negras rodeadas de una zona negra debido a la formación de sulfuro ferroso.

IV. CUESTIONARIO

1. ¿Cuál es la composición y el fundamento de la formación de colonias de color negro en el

agar SPS? Mencione otros medios de cultivo que se puedan usar para el aislamiento de
Clostridium.

29
 2. El cultivo de los anaerobios sulfito reductores exige una atmosfera exenta de oxígeno,
explique cuáles son las formas de conseguirla.

3. Haga un diagrama de flujo del procedimiento (9) y expresión de resultados (10) para hacer
la identificación de Clostridium perfringens según la NTC 4834.

4. Haga una tabla para enumerar por lo menos 10 alimentos a los que se le debe realizar
recuento de esporas de Clostridium sulfito reductor, sus límites microbiológicos, y cuál es
la norma que lo establece en Colombia.

V. BIBLIOGRAFÍA

ACOSTA, E y GONZALEZ ORTIZ, L (1995). Fundamentos para el análisis microbiológico de los

alimentos. Barranquilla.

AYCACHI, R. Práctica No. 14. Aislamiento e Identificación de Clostridium perfringens. Escuela

Profesional de Biología. Universidad de Nacional Pedro Ruiz Gallo.

INTERNATIONAL ORGANIZATION OF STANDARIZATION (2003). Método horizontal para el

recuento de bacterias sulfito reductoras que crecen en anaerobiosis. ISO 15213

INTERNATIONAL ORGANIZATION OF STANDARIZATION (2004). Método horizontal para la

enumeración de Clostridium perfringens. Técnica de recuento de colonias. ISO 7937.

MARTINEZ, K. Guía Práctica No. 6. Recuento de Clostridium sulfito reductor-Esterilidad

Comercial. Universidad de Santander.

PASCUAL, M.R y CALDERÓN, V. (1999) Microbiología alimentaria. Metodología analítica para

alimentos y bebidas. 2° Ed. Ediciones Días de Santos.

PEREZ-PEREZ, H, Rubio C, Pozuelo MR, Revert C y Hardisson A. (2003). Botulismo y toxina

botulínica. Rev. Toxicol. 20: 8-12

RHODEHAMEL, EJ & Harmon, SM (2001). BAM: Clostridium perfringens. Disponible en:

http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070878.htm
Consultado 12 de mayo de 2014

WIKIPEDIA. La enciclopedia libre (2014). Clostridium. Disponible en:

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Clostridium&oldid=73821102 Fecha de consulta: 21
de mayo del 2014.

30
 Práctica 9. Recuento e identificación de Staphylococcus
coagulasa positiva

I. INTRODUCCIÓN

Staphylococcus aureus (coagulasa positiva) es un coco Gram positivo, anaerobio facultativo,

productor de coagulasa y catalasa, que se encuentra ampliamente distribuido en la naturaleza.
Su hábitat natural es la piel, fosas nasales y garganta de animales y seres humanos y se estima
que una de cada tres personas es portadora de esta bacteria.

Además de producir enfermedades localizadas (piel y mucosas) y sistémicas, S. aureus se ha

identificado como el agente causal de una intoxicación alimentaria que afecta el aparato
gastrointestinal y produce la “intoxicación estafilocócica por alimentos”. Los síntomas de esta
intoxicación son: náuseas, vómitos, calambres abdominales, ocasionalmente diarrea, malestar
general y dolor de cabeza. Dichos síntomas pueden aparecer entre los 30 minutos y las 8 horas
después de haber consumido el alimento contaminado con las toxinas estafilocócicas. Esta
intoxicación no es considerada como una enfermedad grave; sin embargo, se han presentado
muertes, principalmente en ancianos y niños. Su grado de severidad depende de la cantidad
de enterotoxina ingerida, el estado inmunológico del individuo y su edad. No se tiene un dato
exacto de la cantidad de enterotoxina necesaria para que se produzca la intoxicación, pero se
ha estimado que va desde 100 ng hasta 1 mg por gramo de alimento (Mota & Fernández,
2012).

En esta práctica de laboratorio se dará la orientación necesaria a los estudiantes de Ingeniería

de Alimentos sobre la metodología para el recuento e identificación de estafilococos coagulasa
positiva en productos destinados al consumo humano.

II. INSUMOS, MATERIALES Y EQUIPOS

Insumos
- Muestra de alimentos: producto cárnico, producto lácteo, sopa instantánea, etc.
- Agua peptonada 0,1% + 2% de citrato de sodio.
- Agar Baird Parker (BP).
- Caldo Infusión Cerebro Corazón (BHI).
- Plasma de conejo liofilizado.

Materiales
- Pipetas de 1 ml.
- Tubos de ensayo con 9 ml de diluyente.
- Frascos con 90 ml de diluyente.
- Caja de Petri con agar BP.
- Jarra para homogenizar muestras.
- Utensilios (cuchillos, tenedores, cucharas, etc.).
- Asa de Drigalsky.

Equipos
- Incubadora regulada a 35°C
- Balanza.
- Licuadora.

III. PROCEDIMIENTO

31
Método de recuento en placa

1. Pesar 10 g de la muestra.

2. Agregar la muestra al frasco con 90 ml del diluyente (dilución 10-1).

3. Homogenizar la muestra, agitándola en licuadora hasta que se desmenuce.

4. Preparar las demás diluciones (10-2, 10-3…).

5. Inocular 0,1 ml de dos diluciones consecutivas por duplicado en cajas de Petri con Agar BP.

6. Esparcir el inóculo en forma masiva con espátula de Drigalsky.

7. Incubar a 35°C por 24 – 48 horas.

8. Pasado el tiempo de incubación, elegir las placas que contengan entre 10 y 200 colonias
aisladas y contar todas las colonias que muestren las dos reacciones características
diagnósticas de lipólisis y proteólisis: se desarrolla una colonia negra que produce halos y
anillos característicos de margen estrecho y blanco y que aparecen rodeadas por zonas
claras que contrastan con la opacidad del medio.

9. Con la ayuda del cuadro 1, determinar el número de colonias a evaluar, tomando en

cuenta el número de colonias típicas de S. aureus en el agar BP y llevar a cabo la prueba de
la coagulasa.

Cuadro 1. Número de colonias a evaluar de S. aureus

Número total de colonias sospechosas en una Número de colonias sospechosas a
caja de BP caracterizar bioquímicamente
Menos de 50 UFC 3
51-100 UFC 5
101-200 UFC 7

Prueba para determinar producción de la enzima coagulasa

1. Pasar las colonias elegidas a tubos de Caldo Infusión Cerebro Corazón (BHI) e incubar
durante 20-24 horas a 35°C.

2. Trascurrido este tiempo, verter 0,1 ml del cultivo obtenido en caldo BHI en un tubo de
vidrio estéril y añadir 0,3 ml de plasma de conejo EDTA reconstituido.

3. Incubar a 35°C durante 6 horas.

4. Examinar los tubos 6 horas después con el fin de detectar la presencia de coágulos. La
aparición de un coágulo bien diferenciado es indicativo de la actividad coagulasa.

En la siguiente figura se presentan los distintos tipos de coágulos que pueden observarse. Hay
que hacer notar que la reacción 1+ no se considera evidencia positiva de la producción de
coagulasa. La reacción 2+ se caracteriza porque el coagulo se eleva por encima del nivel del
líquido cuando el tubo se inclina casi horizontalmente. Hay que tener cuidado a la hora de
diferenciar entre un coágulo verdadero y una formación similar a un saco (pseudocoágulo). La
diferenciación puede basarse en que los pseudocoágulos se deshacen al agitar el tubo
suavemente.

32
INTERPRETACIÓN

NEGATIVA
No se observa evidencia de la formación de fibrina.
1+ Aparecen coágulos muy pequeños desorganizados.

POSITIVA
2+ Aparece un coágulo pequeño organizado.
3+ Aparece un gran coágulo organizado.
4+ Aparece coagulado todo el contenido del tubo.
4+ El coágulo se mantiene aun cuando se invierte el tubo.

IV. CUESTIONARIO
1. Investigue sobre el agar Baird Parker (BP) su composición, el agente selectivo, el agente
diferencial y las características de las colonias de S. aureus. Mencione otros medios que
se puedan usar para el aislamiento de este microorganismo.

2. ¿Qué otras pruebas bioquímicas, además de la coagulasa, se pueden usar para identificar
cepas enterotoxígenicas de S. aureus? Describa el procedimiento de cada una de ellas.

3. Investigue en la NTC 4779 el ejemplo de cómo se hace el cálculo y la expresión de

resultados para el recuento de Estafilococos coagulasa positiva.

4. Haga una tabla en la que mencione mínimo 10 ejemplos de alimentos en los que se debe
hacer recuento de S. aureus, los índices máximos (m y M) permisibles y las normas que
los establecen a nivel nacional.

5. Investigue por lo menos 6 casos reportados de brotes de intoxicación estafilocóccica a

nivel nacional e internacional.

33
 V. BIBLIOGRAFIA

BENNETT RW. and Lancette GA. (2001). BAM: Staphylococcus aureus. Disponible en:
http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm071429.htm
Consultado: 6 de mayo de 2014.

CHANS, R.G. (2002). Estafilococos. Disponible en:

http://www.higiene.edu.uy/cefa/Libro2002/Cap%2017.pdf Consultado: 22 de febrero de 2008

DINGES, M, Orwin P, Schlievert P. (2000). Exotoxins of Staphylococcus aureus. Clin Microbiol

Rev. Vol. 13:16-34.

INPPAZOPS/OMS. Instituto Panamericano de Protección de Alimentos y Zoonosis-

Organización Panamericana de la Salud. (2000). Sistema de Información Regional para la
Vigilancia de Enfermedades Transmitidas por Alimentos: Brotes de intoxicación estafilocócica
de 1993 hasta 2000.

LABORATORIO DE TECNOLOGÍA EDUCATIVA. Departamento de Microbiología y Genética.

Universidad de Salamanca. (2005). Investigación y Recuento de Staphylococcus aureus.
Obtenido el 01 de octubre de 2009 en:
http://virus.usal.es/web/demo_microali/Saureus/SaureusPlaca.html

MERCADO, C. (2007). Los ámbitos normativos, la gestión de la calidad y la inocuidad

alimentaria: una visión integral. Agroalim. Vol. 12(24): 119-31.

MOTA L. y Fernández E. (2012). Intoxicación estafilocócica por alimentos. Disponible en:

http://www.alimentacion.enfasis.com/articulos/65372-intoxicacion-estafilococica-alimentos.
Consultado: 6 de mayo de 2014.

THATCHER, F.S. y CLARK, D.S. (1993) Análisis Microbiológico de los Alimentos. Edit. Acribia.
Zaragoza.

34
 Práctica 10. Recuento e identificación de Bacillus cereus

I. INTRODUCCIÓN

Bacillus cereus es un bacilo Gram positivo, aerobio o anaerobio facultativo, formador de

esporas y móvil. Hidroliza la lecitina de la yema del huevo y no fermenta el manitol. Es un
microorganismo ubicuo y abundante en la naturaleza. Se encuentra frecuentemente en el
suelo, polvo, vegetales, cereales, harinas, especias, plantas medicinales y algunos
alimentos crudos o procesados.

B. cereus puede producir dos enterotoxinas, la toxina diarreica y la toxina emética,

relacionadas con dos formas de presentación de esta toxiinfección: la primera, se
caracteriza por el dolor abdominal y la diarrea sin sangre que tiene un período de
incubación de 4-16 h después de la ingestión con síntomas que duran 12-24 h; la segunda,
se caracteriza por un ataque agudo de náuseas y vómitos y se produce dentro de 1-5 h
después del consumo de alimentos contaminados (Acosta et al., 1995) (Martino et. al
2010).

Las cepas de B. cereus son muy variables en cuanto a su crecimiento y características de

supervivencia. Algunas son psicrotrofas, siendo capaces de crecer a 4-5°C pero no a 30-
35°C, mientras que otras cepas son mesófilas y pueden crecer entre los 15°C y los 50-55 °C.
En general, no obstante, la temperatura óptima de crecimiento varía de 30 a 40°C. Las
formas esporuladas, al igual que en el género Clostridium, son muy termoresistentes y sólo
se eliminan mediante la esterilización (Tallent et. al., 2012).

La resistencia térmica de esporas de B. cereus en un medio con elevado contenido de agua

vuelve a este microorganismo un potencial peligro para el desarrollo de una intoxicación si
las medidas higiénico sanitarias y de elaboración de alimentos no son las adecuadas.

En la siguiente práctica de laboratorio, los estudiantes aprenderán la metodología para el

recuento e identificación de B. cereus en alimentos por medio del recuento en placa y su
importancia como indicador en la industria alimentaria.

II. INSUMOS, MATERIALES Y EQUIPOS

Insumos
 Alimentos a analizar: Arepas, alimentos deshidratados para niños, condimentos, harina
de maíz o arroz, leche en polvo, queso fundido, mayonesa, etc.
 Agua peptonada tamponada (APT) 0.1%.
 Agar Manitol Yema de Huevo con Polimixona (MYPA) de Mossel.
 Agar sangre de cordero.

Materiales
 Cuchillos-cucharas
 Pipetas 1 y 10ml
 Asa bacteriológica
 Gradilla
 Tubos de ensayo
 Algodón y alcohol al 70%
 Asa de Drigalsky

35
 Equipos
 Licuadora
 Balanza
 Incubadora regulada a 30°C

III. PROCEDIMIENTO (ISO 7932:2004)

Recuento en placa

1. Preparar y homogenizar la muestra, realizando las respectivas diluciones.

2. Marcar cuatro cajas de Petri que contienen agar Cereus según Mossel con fecha, muestra,
dilución y No. del grupo.
3. Adicionar 0,1 ml de dos diluciones consecutivas en las cajas marcadas.
4. Extender la muestra con el asa de Drigalsky sobre toda la superficie del medio, y esperar
que se absorba el inóculo.
5. Incubar por 18-24 horas a 30°C.
6. Seleccionar las cajas que contengan menos de 150 colonias y contar las colonias
características (colonias rosadas con bordes regulares e irregulares, con un halo denso a su
alrededor debido a la lecitinasa).
7. Tomar al menos tres colonias características y hacer una siembra por agotamiento en una
caja de agar sangre de cordero con el asa bacteriológica.
8. Incubar a 30°C durante 24 horas y observar la α-hemólisis positiva de B. cereus.

IV. CUESTIONARIO

1. Explique cuál es la composición y el fundamento del CHROMagar B. cereus. Especifique

cuáles son las características de las colonias.

2. Haga un diagrama de flujo del método de recuento de B. cereus según la NTC 4679:2006
(disponible en el LMA-UTA).

3. Haga una tabla en la que mencione las diferentes pruebas bioquímicas que se pueden usar
para la confirmación de B. cereus y su perfil bioquímico.

4. Enumere 10 alimentos, sus respectivos límites y la norma que los establece, a los cuales se
les exige la enumeración de B. cereus a nivel nacional e internacional.

5. Describa por lo menos tres brotes causados por B. cereus a nivel nacional o internacional.

V. BIBLIOGRAFÍA

ACOSTA, E y GONZALEZ ORTIZ, L (1995.) Fundamentos para el análisis microbiológico de

los alimentos. Barranquilla.

ESCOBAR DUQUE, MB. (1994).Manual de técnicas y procedimientos. Programa

Latinoamericano de microbiología e higiene de los alimentos. Universidad de Antioquia,
Facultad de Salud Pública Héctor Abad Gómez. Medellín.

36
ICMSF. (1984). Microorganismos de los alimentos. Técnicas de análisis Microbiológico. Vol.
1, 2da edición, Editorial Acribia. Zaragoza, España.

MARTINO, Tamara K et al. Bacillus cereus y su implicación en la inocuidad de los

alimentos.: Parte II. Rev Cubana Salud Pública [online]. 2010, vol.36, n.1, pp. 139-148 .

MINISTERIO DE SALUD. Instituto Nacional de Salud. (1998). Análisis Microbiológico de

Alimentos. Serie de Publicaciones científicas No. 10. Santa fe de Bogotá.

TALLENT, S.M., Rhodehamel, E.J., Harmon, S.M., and Bennett, R.W. (2012). BAM: Bacillus
cereus Bacteriological Analytical Manual Chapter 14. Disponible en:
http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070875.htm
Consultado 20 de mayo de 2014.

37
 Práctica 11. Análisis microbiológico de agua potable
mediante filtración por membrana (FPM)

I. INTRODUCCIÓN
La calidad microbiológica del agua en muy importante en la producción de alimentos debido a
que siempre es usada para los procesos de limpieza y desinfección o puede estar presente
como materia prima en la elaboración de algunos alimentos.

En la industria alimentaria el agua puede dividirse en tres categorías: agua de proceso, agua de
enfriamiento y agua de alimentación de calderas. La calidad de cualquier tipo dependerá del
contenido microbiano del agua utilizada como materia prima, de los métodos de tratamiento a
los que es sometida y de los sistemas empleados para su almacenamiento y distribución.

Para garantizar la calidad microbiológica del agua, es necesario realizar el control de la misma,
utilizando diferentes métodos que nos permitan realizar la enumeración o el recuento
microorganismos indicadores o la investigación de microorganismos patógenos.

Al finalizar esta práctica de laboratorio el estudiante estará en capacidad de realizar el control

microbiológico del agua de proceso en la industria alimentaria mediante la técnica FPM.

II. MATERIALES, EQUIPOS, REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO

- Muestra de agua de proceso (potable).

- Agua peptonada al 0,1 %.
- Placas de Petri con agar Cetrimide.
- Placas de Petri con agar ENDO.
- Placas de Petri con Plate Count (PCA).
- Equipo de filtración (Millipore).
- Membranas filtrantes estériles de 0,45 µm.
- Bomba de vacío.
- Pinzas estériles.
- Incubadoras reguladas a una temperatura de 35°C.

III. PROCEDIMIENTO

1. Colocar una membrana filtrante estéril, bajo condiciones asépticas, sobre el centro del
portafiltro, usando pinzas estériles, con la superficie cuadriculada hacia arriba.
2. Ensamblar el equipo, colocando el dispositivo de filtración y asegurando con una pinza.
3. Verter 100 ml de la muestra de agua en el portafiltro y proceder a filtrar.
4. Lavar el embudo con aproximadamente 100 ml de agua peptonada al 0,1%.
5. Remover la parte superior del portafiltro y, con una pinza estéril, transferir la membrana a
la placa de Petri que contiene el medio de cultivo correspondiente al microorganismo que
se va a determinar:

Indicador Medio de cultivo Incubación

Coliformes y E. coli Agar ENDO
Pseudomonas aeruginosa Agar Cetrimide Incubación 35C por 24-48 h
Aerobios mesófilos Plate Count

38
6. Al colocar la membrana, evitar la formación de burbujas entre ésta y el medio de cultivo.
7. Incubar las placas en forma invertida a la temperatura y tiempo requeridos para el
crecimiento del microorganismo investigado.
8. Contar las colonias en las membranas.
9. Expresar los resultados como unidades formadoras de colonias (UFC) en 100 ml de agua,
considerando el volumen filtrado.

IV. CUESTIONARIO

1. Describa la metodología de toma de muestra de agua de grifo y tanque de

almacenamiento, la forma de preservar la muestra y transportarla.
2. Haga un diagrama del equipo de filtración por membrana y describa cada una de sus
partes.
3. Consulte la normativa nacional para el análisis microbiológico de agua de consumo
humano y sus límites microbiológicos.
4. Investigue el procedimiento de otras técnicas (sustrato definido, enzima sustrato, tubos
múltiples de fermentación) usadas para análisis bacteriológico del agua potable. Haga un
diagrama de flujo de cada procedimiento.
5. Aparte de bacterias determinadas en esta práctica, ¿Qué otros microorganismos pueden
investigarse en una muestra de agua potable y cuál es su importancia como indicador?

V. BIBLIOGRAFIA

Brock T.D. Madigan M.T. Martenko J.J. y Parker J. (Eds) Biología de los microorganismos. 8ª
Edición. Prentice Hall International. (1999).

Prescott, L.M. y col. Microbiology. W.C. Brown Publishers. 4ª Edición. (1998).

Suliman Al Tomi, Abdyrazazq. Manual of Bacteriological Examination of Drinking Water. (2007)

The Official Compendia os Standards USP 24 NF. The United States Pharmacopeia. The
National Formulary. Pharmacopeial Convention Inc. Rockville MD (1999).

39
 Practica 12. Evaluación de esterilidad comercial de
conservas

I. INTRODUCCIÓN

El enlatado o conserva se define como un proceso de conservación de alimentos en

recipientes cerrados y generalmente supone someterlos a un tratamiento térmico que
garantiza la destrucción de todas las formas bacterianas vegetativas y esporuladas, o de
cualquier enzima. El proceso térmico puede ser aplicado a cualquier producto alimenticio
siempre y cuando se envase en un recipiente adecuado. La principal exigencia es que el
envase, una vez cerrado herméticamente, no se deteriore durante la manipulación o el
almacenamiento. Los recipientes utilizados pueden ser metálicos, plásticos, de vidrio y de
hojalata.

Los enlatados, generalmente esterilizados, pueden permanecen sin contaminarse a

temperatura ambiente durante largos periodos de tiempo y tienen una vida útil que puede
variar entre seis meses y varios años.

Las características principales exigibles en una conserva o enlatado son la inocuidad para el
consumidor y el mantenimiento inalterable de sus características organolépticas durante
largos periodos de tiempo.

Se suelen tener en cuenta dos conceptos importantes respecto a la esterilidad de las

conservas:

1. Esterilidad biológica: existe una ausencia total de microorganismos y sus toxinas, así
como la inactivación de enzimas celulares y microbianas.
2. Esterilidad comercial: NO deben existir formas vegetativas, esporas o toxinas de
microorganismos capaces de alterar el producto o causar enfermedad al consumidor.
Las enzimas celulares y microbianas deberán ser inactivadas. En la esterilidad
comercial se toleran esporas pertenecientes a la familia Bacillaceae no patógeno, no
toxigénicos e inertes, es decir, incapaces de germinar.

Las alteraciones biológicas de los enlatados pueden ser causadas por la supervivencia de
microorganismos debido a deficiencias en el tratamiento térmico empleado o por fallas
en cierre del enlatado, las cuales facilitan la invasión del producto por microorganismos a
través de grietas o la reproducción de los mismos en la conserva. La mayor parte de las
alteraciones biológicas sufridas son producidas por gérmenes termófilos (esporulados),
como son, algunas especies de los géneros bacterianos Bacillus y Clostridium.

En la siguiente práctica se pretende dar a conocer la metodología para evaluar la

esterilidad comercial de alimentos enlatados o conservas.

II. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS

Insumos
Conservas o enlatados (2 por grupo)
Caldo Infusión Cerebro Corazón (BHI)
Almidón 0,1%
Alcohol al 70%

40
 Agua tibia
Parafina o agar –agar estéril

Materiales
Reactivos para coloración de Gram
Abrelatas estériles
Cuchillos-cucharas
Asa bacteriológica
Cajas de Petri vacías
Tubos estériles
Toallas desechables o papel filtro
Pipetas graduadas
Laminas portaobjetos

Equipos
Balanza
Incubadora regulada a una temperatura de 35C
Incubadora regulada a una temperatura de 55C
Microscopio con objetivo de inmersión
Potenciómetro

III. PROCEDIMIENTO

Para la evaluación de la esterilidad comercial de los enlatados es necesario dividir el

procedimiento en varias etapas que se describen a continuación.

PRE-INCUBACIÓN

1. Tomar dos conservas en lata para realizar el estudio de esterilidad comercial.

2. Retirar las etiquetas de los envases (en caso de tenerlas).
3. Anotar cuidadosamente y exactamente todos los defectos o señales de alteración tales
como abombamiento, oxidación, microfugas, deformaciones, etc.
4. Lavar bien los envases con agua tibia jabonosa y escobillón en caso de ser necesario.
5. Enjuagar con agua tibia.
6. Secar las latas con toallas de papel desechables.

INCUBACIÓN

1. Envolver los alimentos envasados en papel filtro o en toallas de papel absorbente con el fin
de descubrir microfugas durante el período de incubación.
2. Marcar las latas con el No. de identificación, fecha y temperatura de incubación.
3. Incubar una lata a 35°C y la otra a 55°C durante 8 días.
4. Agitar en invertir la posición de los envases diariamente.
5. Observar todos los días con el fin de descubrir microfugas y abombamiento, si un envase
presentase microfugas o abombamientos, se debe examinar inmediatamente.

PREPARACIÓN DE LAS LATAS PARA SU ANÁLISIS

1. Es necesario que los envases se estabilicen a temperatura ambiente durante 1 hora.

41
2. Examinar la conserva para comprobar posibles Alteraciones: abombamiento, oxidación y
deformación. Olor: putrefacto, fecal, a ácido sulfhídrico, a queso, a acido butírico. Aspecto:
textura blanda, dura. Consistencia: liquida, o viscosa; presencia de elementos extraños.
3. Desinfectar con alcohol al 70% toda el área de trabajo y los envases a analizar.
4. Flamear rápidamente la parte a ser abierta, en caso de estar las latas abombadas tomar
precauciones para evitar un peligro.
5. Abrir los envases con ayuda de un abrelatas o tijeras estéril.
6. Cubrir inmediatamente con la base de una placa de Petri la superficie expuesta al aire.

ANÁLISIS DEL CONTENIDO DE LA LATA

1. Pesar 0,1 gramo del contenido de cada envase, homogenizando previamente a fin de que
la muestra sea representativa.
2. Disponer de 4 tubos con caldo Cerebro Corazón con almidón al 0,1% para el envase
incubado a 35°C y 4 tubos para el envase incubado a 55°C.
3. Adicionar el contenido pesado de cada envase en cada uno de los tubos con caldo cerebro
corazón con 0,1% de almidón.
4. Verter una capa de 1 cm de parafina estéril o agar agar al 2% en 4 tubos (2 de los envases a
35°C y 2 de los envases a 55°C), con el fin de crear condiciones de anaerobiosis.
5. Una vez hecha la siembra, medir el pH con la ayuda de un potenciómetro.
6. Incubar los 4 tubos de la lata a 35°C y los 4 tubos de la lata a 55°C (4 en aerobiosis y 4 en
anaerobiosis) durante 72 horas.
7. Observar si hay desarrollo microbiano que se evidencia por turbidez en el tubo.
8. Considerar que el producto es estéril comercialmente o satisfactorio, cuando máximo un
tubo en aerobiosis muestra turbidez.

IV. INTERPRETACIÓN

INCUBACIÓN EN CALDO BHI

 Si ninguno de los 4 tubos aerobios da positivo y ninguno de los 4 tubos anaerobios

muestra crecimiento, se reportará en el informe “prueba de esterilidad comercial
satisfactoria”.
 Si hay crecimiento aeróbico en el medio incubado a 35°C para latas normales, indica
esterilidad no satisfactoria o contaminación en el laboratorio.
 Para descartar problemas ambientales se debe examinar si no hay crecimiento en los
tubos incubados a 55°C; en este caso se debe verificar la muestra en cuanto a olor y
apariencia normal, pH o presencia de bacterias en el examen microscópico de la lata
original lo cual corroboraría concepto de “Prueba de esterilidad comercial no
satisfactoria”.
 Si hay crecimiento a 35°C y ausencia de crecimiento a 55°C confirman el concepto de
esterilidad no satisfactoria. Para este caso se debe sembrar en agar nutritivo a 55°C y
confirmar la presencia de esporas después de 75h causantes de una descomposición
agria.

V. CUESTIONARIO

1. Consulte las normas y criterios existentes para el análisis microbiológico de conservas.

2. Investigue el método para evaluar la esterilidad comercial de leche de larga vida.
3. Además de la prueba de esterilidad comercial, ¿qué otros ensayos de microorganismos
indicadores se pueden determinar en las conservas?

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 VI. BIBLIOGRAFÍA

ESCOBAR DUQUE, María Beatriz. Programa de Microbiología e higiene de los alimentos.

Medellín, Universidad de Antioquia, Facultad Nacional de salud pública “Hector Abad Gómez”,
1990. ca. 150h. QW85 E8-90.

MINISTERIO DE SALUD. Instituto Nacional de Salud. Análisis Microbiológico de Alimentos.

Serie de Publicaciones científicas No. 10 Santa fe de Bogotá, 1998.

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