I.

OBJETIVOS

 Conocer el manejo y funcionamiento del espectrofotómetro Lambda 3B doble Haz

Perkin Elmer UV-VIS.

 Determinar la máxima longitud de onda de una solución de NaOH con

fenolftaleína, una solución de Cobalto y una solución de Manganeso, haciendo uso
del método óptico de espectrofotometría visible.

 Calcular la correspondiente longitud de onda óptima, empleando lectura de A vs

longitud de onda, y %T vs longitud de onda.

II. MARCO TEORICO

La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica que permite determinar la
concentración de un compuesto en solución. Se basa en que las moléculas que absorben
las radiaciones electromagnéticas y a su vez que la cantidad de luz absorbida dependen
de forma lineal de la concentración. Además, es usada para identificar compuestos por su
espectro de absorción y conocer la concentración de un material o sustancia, esto último
permite, seguir el curso de reacciones químicas y enzimáticas, así como determinar
enzimas y proteínas incluso ácidos nucleicos.

El instrumento utilizado en la espectrometría ultravioleta-visible se llama

espectrofotómetro UV-Vis. Mide la intensidad de luz que pasa a través de una muestra (I),
y la compara con la intensidad de luz antes de pasar a través de la muestra (Io). La
relación I / Io se llama transmitancia, y se expresa habitualmente como un porcentaje
(%T). La absorbancia (A) se basa en la transmisión:

A = - log (%T) 

Las partes básicas de un espectrofotómetro son una fuente de luz (a menudo una
bombilla incandescente para las longitudes de onda visibles, o una lámpara de arco de
deuterio en el ultravioleta), un soporte para la muestra, una rejilla de difracción o
monocromador para separar las diferentes longitudes de onda de la luz, y un detector. El
detector suele ser un fotodiodo o un CCD. Los fotodiodos se usan con monocromadores,
que filtran la luz de modo que una sola longitud de onda alcanza el detector. Las rejillas
de difracción se utilizan con CCDs, que recogen la luz de diferentes longitudes de onda en
píxeles.

Un espectrofotómetro puede ser único o de doble haz. En un instrumento de un solo haz

(como el Spectronic 20), toda la luz pasa a través de la célula muestra. La Io debe
medirse retirando la muestra. Este fue el primer diseño, y todavía está en uso en la
enseñanza y laboratorios industriales.

En un instrumento de doble haz, la luz se divide en dos haces antes de llegar a la

muestra. Un haz se utiliza como referencia, y el otro haz de luz pasa a través de la
muestra. Algunos instrumentos de doble haz tienen dos detectores (fotodiodos), y el haz
de referencia y el de la muestra se miden al mismo tiempo. En otros instrumentos, los dos
haces pasan a través de un bloqueador que impide el paso de un haz. El detector alterna
entre la medida del haz de muestra y la del haz de referencia.

Las muestras para espectrofotometría UV-Vis suelen ser líquidas, aunque la absorbancia
de los gases e incluso de los sólidos también puede medirse. Las muestras suelen ser
colocadas en una célula transparente, conocida como cubeta. Las cubetas suelen ser
rectangulares, con una anchura interior de 1 cm. Esta anchura se convierte en la longitud
de ruta, L, en la Ley de Beer-Lambert. También se pueden usar tubos de ensayo como
cubetas en algunos instrumentos. Las mejores cubetas están hechas con cuarzo de alta
calidad, aunque son comunes las de vidrio o plástico. El cristal y la mayoría de los
plásticos absorben en el UV, lo que limita su utilidad para longitudes de onda visibles.

En espectroscopia el término luz no sólo se aplica a la forma visible de radiación

electromagnética, sino también a las formas UV e IR, que son invisibles. En
espectrofotometría de absorbancia se utilizan las regiones del ultravioleta (UV cercano, de
195-400 nm) y el visible (400-780 nm).

La región UV se define como el rango de longitudes de onda de 195 a 400 nm. Es una
región de energía muy alta.

En la región visible apreciamos el color visible de una solución y que corresponde a las
longitudes de onda de luz que transmite, no que absorbe. El color que absorbe es el
complementario del color que transmite. Por tanto, para realizar mediciones de absorción
es necesario utilizar la longitud de onda en la que absorbe luz la solución coloreada. La
fuente de radiación visible suele ser una lámpara de tungsteno y no proporciona suficiente
energía por debajo de 320 nm.
La transmitancia (T) de una sustancia en solución es la relación entre la cantidad de luz
transmitida que llega al detector una vez que ha atravesado la muestra y la absorbancia
(A) es un concepto más relacionado con la muestra puesto que nos indica la cantidad de
luz absorbida por la misma.

LEY DE LAMBERT-BEER

La espectrometría UV-Vis se utiliza con mayor frecuencia en forma cuantitativa para

determinar las concentraciones de especies absorbentes en solución, usando la Ley de
Lambert-Beer:

A = log I/Io = ε·c·l

Donde A es la absorbancia medida, I0 es la intensidad de la luz incidente a una

determinada longitud de onda, I es la intensidad de transmisión, L la longitud de ruta a
través de la muestra, y c la concentración de las especies absorbentes. Para cada
especie y longitud de onda, ε es una constante conocida como absortividad molar o
coeficiente de extinción. Esta constante es una propiedad fundamental molecular en un
solvente dado, a una temperatura y presión particular, y tiene como unidades 1/M * cm o,
a menudo, U/M * cm.

La absorbancia y el coeficiente de extinción ε a veces son definidas en términos de

logaritmo natural en lugar de logaritmo de base 10.

La ley de Lambert-Beer es útil para la caracterización de muchos compuestos, pero no

sirve como relación universal para la concentración y absorción de todas las sustancias.
En moléculas complejas de gran tamaño, como los tintes orgánicos (Xylenol Naranja o
Rojo Neutro, por ejemplo), a veces se encuentra una relación polinómica de segundo
orden entre la absorción y la concentración.
 III. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS

MATERIALES
 Celdas portamuestras
 Vasos de precipitados

REACTIVOS
 NaOH
 Fenolftaleina
 Co(NO3)·6 H2O
 KMnO4
 Agua desionizada.

EQUIPOS
 Espectrofotómetro Lambda 3B doble Haz Perkin Elmer UV-VIS
 Balanza analítica

IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Para poder empezar con la experiencia, debemos calibrar el equipo; una forma de
comprobar la calibración es cuando se cumple que A = 0 y %T = 100. En el primer caso
(indicador) se calibra con la solución de hidróxido de sodio, en cambio, en el caso del Co 2+
y Mn2+, se realizada con agua desionizada. Todas las muestras deberán ser analizadas
por triplicado.

1. Determinar la longitud de onda óptima, de un indicador ácido-base (fenolftaleína), el

indicador actúa en medio alcalino dando el color característico (blanco). Su rango es
de 500 – 600 nm. Tomar de 10 en 10 nm.

𝑁𝑎𝑂𝐻 + 𝐹𝑒𝑛𝑜𝑙𝑓𝑡𝑎𝑙𝑒𝑖𝑛𝑎 → 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑟

ABSORBANCIA (A) TRANSMITANCIA (%T)

λ TOMA 1 TOMA 2 TOMA 3 TOMA 1 TOMA 2 TOMA 3
500 0.268 0.266 0.259 54 55 55.1
510 0.35 0.343 0.342 44.6 45.4 45.5
520 0.447 0.437 0.436 35.8 36.6 36.6
530 0.566 0.559 0.558 27.2 27.6 27.6
540 0.729 0.723 0.722 18.7 18.9 19
550 0.833 0.827 0.828 14.7 14.9 14.9
560 0.688 0.684 0.684 20.5 20.7 20.7
570 0.397 0.393 0.394 40.2 40.4 40.4
 580 0.183 0.181 0.181 65.5 66 65.9
590 0.08 0.078 0.078 83.2 83.6 83.6
600 0.037 0.035 0.035 91.8 92.2 92.2

2. Determinar de la longitud de onda óptima, de una solución de cobalto 0.15 M.

disolvente agua (blanco). Su rango es de 450 – 550 nm. Tomar de 10 en 10 nm.

ABSORBANCIA (A) TRANSMITANCIA (%T)

λ TOMA 1 TOMA 2 TOMA 3 TOMA 1 TOMA 2 TOMA 3
500 0.455 0.457 0.468 35.2 34.9 34
510 0.595 0.596 0.605 25.4 25.3 24.9
520 0.688 0.69 0.698 20.5 20.4 20.1
530 0.766 0.765 0.771 17.1 17.2 16.9
540 0.845 0.846 0.855 14.3 14.3 14
550 0.943 0.944 0.951 11.4 11.4 11.2
560 0.99 0.988 0.988 10.2 10.3 10.3
570 0.943 0.939 0.931 11.4 11.5 11.7
580 0.808 0.802 0.787 15.6 15.8 16.3
590 0.614 0.607 0.591 24.3 24.7 25.6
600 0.428 0.423 0.41 37.3 37.7 38.9

3. Determinar la longitud de onda óptima, de una solución de manganeso 66mg/L.

disolver en agua (blanco). Su rango es de 500 – 550 nm. Tomar de 5 en 5 nm.

Absorbancia (A) Transmitancia (%T)

λ TOMA 1 TOMA 2 TOMA 1 TOMA 2
500 1.045 1.045 9 9
505 1.099 1.099 8 8
510 1.08 1.079 8.3 8.3
515 1.202 1.2 6.3 6.3
520 1.382 1.376 4.2 4.2
525 1.361 1.358 4.4 4.4
530 1.206 1.204 6.2 6.3
535 1.205 1.203 6.2 6.3
540 1.317 1.314 4.8 4.8
545 1.29 1.289 5.1 5.1
550 1.049 1.05 8.9 8.9
 V. CÁLCULOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS

1. Calculamos el promedio de A y %T de las 3 tomas correspondiente a cada sustancia

coloreada.

Fenolftaleína Cobalto Manganeso

2. λ A %T λ A %T λ A %T
(nm) (nm) (nm)
500 0.264 54.70 500 0.460 34.70 500 1.045 9.00
510 0.345 45.17 510 0.599 25.20 505 1.099 8.00
520 0.440 36.33 520 0.692 20.33 510 1.080 8.30
530 0.561 27.47 530 0.767 17.07 515 1.201 6.30
540 0.725 18.87 540 0.849 14.20 520 1.379 4.20
550 0.829 14.83 550 0.946 11.33 525 1.360 4.40
560 0.685 20.63 560 0.989 10.27 530 1.205 6.25
570 0.395 40.33 570 0.938 11.53 535 1.204 6.25
580 0.182 65.80 580 0.799 15.90 540 1.316 4.80
590 0.079 83.47 590 0.604 24.87 545 1.290 5.10
600 0.036 92.07 600 0.420 37.97 550 1.050 8.90
Determinamos la correspondiente longitud de onda óptima, empleando lectura de A vs
longitud de onda, y %T vs longitud de onda.

λó ptima = 550 nm
λó ptima = 510nm

λó ptima = 520nm
 VI. CONCLUSIONES
 Determinamos la longitud de onda óptima de las tres soluciones coloreadas
empleando las gráficas de “A Vs λ” y “%T Vs λ”. Para esto intersectamos el
mayor valor de A de la gráfica “A Vs λ” con el menor valor de %T de la gráfica
“%T Vs λ”. En el caso de la solución de fenolftaleína con NaOH fue de 550 nm,
para la solución cobalto 510nm, y para la solución de manganeso fue un
aproximado de 520nm.

 Teniendo en cuenta que los datos obtenidos experimentalmente se encuentran

dentro del rango de los valores teóricos, podemos decir que el equipo presenta
una adecuada precisión y exactitud; y que aprendimos correctamente el uso del
espectrofotómetro.

VII. BIBLIOGRAFIA

 Day Jr. R, Underwood A. Química Analítica Cuantitativa. (1989). Pearson.

Naucalpan de Juárez.

 Skoog, D. y West, D. (2010) "Fundamentos de Química Analítica octava

edición", Cengage Learning Editores.

 Skoog D.A; West D.M. Principios de análisis Instrumental.

VIII. CUESTIONARIO
1. ¿Cómo serán identificadas las sustancias coloreadas?

Determinamos la longitud de onda óptima de la sustancia, para esto intersectamos el

mayor valor de A de la gráfica “A Vs λ” con el menor valor de %T de la gráfica “%T Vs
λ”. Ésta longitud de onda nos indicará el color que absorbe la sustancia y con este
valor podremos averiguar cuál será el color visible.

λóptimo Color absorbido Color observado

520 - 550 nm 380 – 420 nm
Fenolftaleína 550 nm
amarillo-verde violeta
500 – 520 nm 680 – 780 nm
Cobalto 510 nm
verde púrpura

520 - 550 nm 380 – 420 nm

Manganeso 520 nm
amarillo-verde violeta
2. La representación gráfica A vs longitud de onda ¿qué forma toma?

Toma una forma de campana donde el mayor valor de absorbancia permite hallar la
longitud de onda óptica de la sustancia a identificar.

3. El conocimiento de las bandas de absorción ¿qué permite?

Nos permite que, ya sea teniendo el color que absorbe la sustancia o el rango de la
longitud de onda, podamos determinar el color visible de una sustancia y/o su
respectivo rango de longitud de onda.

4. Indique a que banda de absorción corresponden las sustancias de color: verde

y amarillo.

λ para color λ para color color

visible absorbido absorbido
Verde 500 – 520 nm 680 – 780 nm púrpura
Amarillo 550 – 580 nm 420 – 440 nm azul - violeta