ESCUELA SUPERIOR POLITECNICA DE CHIMBORAZO
FACULTAD DE CIENCIAS
INGENIERIA QUIMICA
MICROBIOLOGIA
TINCION GRAM
INTEGRANTES:
CRISTIAN CHAMBA
LISZETH CRUZ
CINTHIA ESCOBAR
KAREN ALVARADO
JORGE JIMENEZ
2011-2012
TEMA:
TINCION GRAM
OBJETIVOS:
OBJETIVO GENERAL
Conocer el procedimiento para la tinción Gram, reconocer la morfología e identificar las
bacterias como bacterias Gram positivas y negativas.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
Determinar el tipo de pared celular de acuerdo a la coloración que tome por la tinción gram.
Observar el tipo de las bacterias de acuerdo a la forma por medio de la tinción gram.
Conocer el procedimiento que se debe seguir para la determinación de la morfología de las
bacterias por la tinción gram.
MARCO TEORICO:
Tinción Gram (1)(2)(3)
La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción diferencial empleado en microbiología
para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Se utiliza tanto para poder
referirse a la morfología celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximación a la
diferenciación bacteriana, considerándose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de
color moradas y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo o grosella.
El cristal violeta (colorante catiónico) penetra en todas las células bacterianas (tanto Gram positivas
como Gram negativas) a través de la pared bacteriana.
El lugol es un compuesto formado por I 2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio), el cual está
presente para solubilizar el yodo y actúa de mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije con
mayor intensidad a la pared de la célula bacteriana. El I 2 entra en las células y forma un complejo
insoluble en solución acuosa con el cristal violeta.
La mezcla de alcohol-acetona que se agrega sirve para realizar la decoloración ya que en la misma es
soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que
los Gram negativos sí lo hacen.
Para poner de manifiesto las células Gram negativas se utiliza una coloración de contraste.
Habitualmente es un colorante de color rojo como la safranina o la fucsina. Después de la coloración
de contraste las células Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen
azules.
La facultad de las células para tomar la coloración Gram no es propia de toda sustancia viviente, sino
que se limita casi en absoluto a hongos y bacterias. Así vemos que las células de plantas y animales
superiores no conservan la primera coloración; los mohos se tiñen con cierta irregularidad; los
gránulos de micelios propenden retener el colorante. La reacción de Gram no es infalible ni
constante puede variar con el tiempo del cultivo y el pH del medio y quizá por otras causas como:
I: Edad de la bacteria.
II: Errores del operador.
III: Uso de antibióticos
A pesar de la gran utilidad del la tinción de Gram, este método debe ser valorado con precaución ya
que la reacción puede variar según la edad de las células y la técnica empleada, por ella junto a la
muestra deben teñirse controles con grampositivas y gramnegativas.
TEORIA DEL PROCESO DE TINCION (1)(3)(4)
Un microorganismo gram positivo debe presentar una pared celular sana. El mismo microorganismo
si sufre daño de la pared por una u otra causa se vuelve gram negativo. Esto indica la importancia de
la pared para la retención o el escape del colorante.
Existen varias teorías para explicar el proceso de tinción gram, pero en mi grupo hemos tomado
como la más acertada a la de Gram. Stearn que basó la suya en una combinación química entre el
colorante y las proteínas de las bacterias. Las proteínas y aminoácidos son cuerpos anfóteros es decir
tienen la facultad de reaccionar con ácidos y con bases gracias a sus grupos amino y carboxilo en
soluciones ácidas.
Reaccionan con los ácidos y en soluciones alcalinas lo hacen con las bases. De igual manera
comprobaron que la reacción de tinción de las bacterias obedece en gran parte a su contenido
proteínico estos microorganismos se conducen como cuerpos anfóteros, al combinarse con
colorantes ácidos en soluciones ácidas y con los básicos en medio alcalino. La combinación con
ambos tipos de colorante no se produce en el “punto isoeléctrico”. Como los microorganismos
contienen más de una proteína ese punto no tiene un valor preciso y definido sino que constituye
más bien una gama o escala que comprende dos o tres unidades de pH. Según Stern y Stearn, los
microorganismos grampositivos tienen una escala isoeléctrica de pH inferior a la de los
microorganismos gramnegativos.
BACTERIAS RESISTENTES A LA TINCION GRAM (1)(3)
Las siguientes bacterias de naturaleza grampositiva tiñen como gramnegativas:
Mycobacterias (están encapsuladas).
Mycoplasmas (no tienen pared).
Formas L (pérdida ocasional de la pared).
Protoplastos y esferoplastos (eliminación total y parcial de la pared, respectivamente).
UTILIDADES (1)(2)
La utilidad de la tinción se refiere a la rapidez con que se puede actuar frente a un agente
bacteriano patógeno, en ocasiones es urgente actuar frente a una infección por lo tanto el
médico requiere conocer las características de la bacteria y así al saber si es gram positiva o
gram negativa determinará que tratamiento antibiótico se debe seguir; muchas veces el
gram puede ser una información que puede salvar una vida.
Utilidad como control calidad del aislamiento bacteriano. Los morfotipos bacterianos
identificados en la tinción de Gram se deben de corresponder con aislamientos bacterianos
realizados en los cultivos. Si se observan mayor número de formas bacterianas que las
aisladas hay que reconsiderar los medios de cultivos empleados así como la atmósfera de
incubación.
MATERIALES Y REACTIVOS
MATERIALES REACTIVOS
Muestras Bacterianas - Cristal Violeta
Microscopio Óptico - Lugol
Guantes y Mascarilla - Safranina
Placas Portaobjetos - Solución Decolorante
Hisopos Estériles - Aceite de Inmersión
Mechero o lámpara de alcohol
Soporte para placas
PROCEDIMIENTO
Lavar el portaobjetos destinado para bacteriologia,
limpiar con un solvente organico (alcohol) para
EXTENDIDO eliminar grasa e impurezas.
Si la muestra es DIRECTA (un medio de cultivo, un
Codificar con la palabra Gram e
raspado, una mucosa), se realizara un extendido con
identificar la muestra
un aplicador o hisopo esteril
Si la muestra es solida se hara una
Si la muestra es LIQUIDA se dibujara un circulo
suspension en 0,5ml de solucion
de 1 cm de diametro sobre el portaobjetos y
fisiologica y se tratar como si fuese
colocamos 50 ul de muestra y dejar secar.
liquida.
Al calor usando un
mechero o lampara de
alcohol flameando la
placa portaobjetos
rompiendo la llama del
mechero de 3 a 4 veces
Con metanol
someter a los
vapores
durante 30
minutos
FIJACION DE LA MUESTRA
Se tendra un soporte en donde va
a descansar la placa , se colocara
TINCION dentro de una cuba de tincion o el
lavamanos
Eliminar el colorante y la lavamos
Añadir gotas del cristal
con agua corriente, no sobre el
violeta sobre el frotis y dejar
frotis directamente sino por los
actuar durante 1 min
bordes
Eliminar el exceso de Lavar con agua
agua y colocamos corriente y eliminar
gotas de lugol dejando todo el colorante
actuar 1 min.
Lavar con agua Adicionar gotas del
corriente, eliminar el colorante y dejar
exceso de agua actuar 30 min.
Colocar gotas de safranina sobre Dejar escurrir sobre
el frotis y dejar 1 min. Lavar con papel absorvente
agua corriente y dejar secar durante 15 min o
hasta eliminar completamente el abanicando al aire
agua
Añadimos una gota de aceite de
inmersion y observamos con el
Volvemos a codificar
lente de 100x la forma y
coloracion de las bacterias
OBSERVACIONES
En la primera muestra se observo bacterias de forma esférica, de manera de racimo y de
color moradas es decir bacterias con pared celular gram positivas.
En la segunda muestra se observo bacterias de color rosado fucsia es decir bacterias de
pared celular gram negativas y de forma de bastoncitos.
En la tercera muestra se observo levaduras de una forma ovoide irregular y estas tenían
un tamaño mayor que las bacterias, fueron de color rosado fucsia es decir de pared
celular gram negativas
CONCLUSIONES
El color fucsia rosado determina que la pared celular es gram negativa y el color morado
determina que la pared celular es gram positiva.
Las bacterias de forma esférica son denominados cocos, las de forma de bastoncitos son
denominados bacilos y las bacterias de forma encorvada se denominan de forma
helicoidal.
El procedimiento a seguir para la determinación de la morfología de las bacterias por
tinción gram es:
Se tendrá un soporte en donde va a descansar la placa , se colocara dentro de
una cuba de tinción o el lavamanos
Añadir gotas del cristal violeta sobre el frotis y dejar actuar durante 1 min
Eliminar el colorante y la lavamos con agua corriente, no sobre el frotis
directamente sino por los bordes
Eliminar el exceso de agua y colocamos gotas de lugol dejando actuar 1 min.
Lavar con agua corriente y eliminar todo el colorante
Adicionar gotas del colorante y dejar actuar 30 min.
Lavar con agua corriente, eliminar el exceso de agua
Colocar gotas de safranina sobre el frotis y dejar 1 min. Lavar con agua corriente
y dejar secar hasta eliminar completamente el agua
Dejar escurrir sobre papel absorbente durante 15 min o abanicando al aire
Volvemos a codificar
Añadimos una gota de aceite de inmersión y observamos con el lente de 100x la
forma y coloración de las bacterias
CUESTIONARIO
1.- Porque unas bacterias se colorean rosadas, y otra quedan azules después de la coloración de
Gram. Explique sustentadamente el fundamento de la tinción. (1)(6)(7)
La pared celular es una cubierta rígida y porosa que confiere a la bacteria su forma característica y
protección física, incluso contra ruptura osmótica.
La bacteria produce su propia pared celular de peptidoglucano que consiste en cadenas paralelas de
polisacárido unidas transversal y covalentemente a péptidos. No todas las paredes celulares de
bacterias son iguales.
La técnica de tinción de Gram consiste en la aplicación del colorante cristal violeta, cuya reacción con
la pared celular ha permitido tradicionalmente clasificar a las bacterias en dos grupos:
Bacterias Gram positivas. Poseen una pared celular gruesa con numerosas capas de peptidoglucano,
las cuales retienen el colorante cristal violeta. Algunas de estas bacterias se rodean además de una
cápsula o cubierta gruesa y viscosa de polisacáridos, cuya función puede ser adherencia, resistencia a
la desecación, material de reserva o patogenicidad, como en Mycobacterium tuberculosis.
Bacterias Gram negativas. Poseen una pared celular fina y una segunda membrana lipídica
denominada membrana externa, la cual no retiene el colorante cristal violeta, como en Escherichia
coli, de ahí que tome una tonalidad de color rosado.
2.- Investigue cinco nombres científicos de bacterias Gram positivas y Gram negativas. (1)(2)(8)
GRAM POSITIVAS
1. Bacillus anthrasis
GENERO : Bacillus
ESPECIE: B. Anthracis
2. Clostridium
GENERO : Clostridium
ESPECIE: C. Botulinum
3. Lactobacillus Acidophilus
GENERO : Lactobacillus
ESPECIE: L. acidophilus
4. Listeria monocytogenes
GENERO : Listeria
ESPECIE: L. monocytogenes
5. Staphylococcus aureius
GENERO : Staphylococcus
ESPECIE: S. aureius
GRAM NEGATIVAS
1) Neisseria gonorrhoeae
GENERO : Neisseria
ESPECIE: N. gonorrhoeae
2) Haemophilus influenzae
GENERO : Haemophilus
ESPECIE: H. influenzae
3) Klebsiella pneumoniae
GENERO : Klebsiella
ESPECIE: K. pneumoniae
4) Escherichia coli
GENERO : Escherichia
ESPECIE: E. coli ( E. freundi)
5) Helicobacter pylori
GENERO : Helicobacter
ESPECIE: H. pylori
BIBLIOGRAFIA
LIBROS
1.) ROGER Y. Stanier, Microbiología, Cuarta Edición, Barcelona, 1992, página 155
2.) MURALI Dharan, Introducción a la Microbiología, Segunda Edición, México, 1982, página 121
INTERNET
3.) Tinción de Gram
http://www.ojocientifico.com/2010/10/23/las-bacterias-gram-positivas
130911
4.) Teoría del Proceso de tinción
http://www.biologia.edu.ar/bacterias/micro4.htm
230711
5.) Utilidades de la tinción de Gram
http://danival.org/600%20microbio/6000notasmicro/tincion/tincion_gram-morfo.html
220611
6.) Fundamento de la Tinción
http://www.facultadsalud.unicauca.edu.co/Documentos2010/DptoMedInt/Tencion_de_gra
m.pdf
141011
7.) Coloración de las bacterias Gram ( Fundamento de la tinción)
http://www.mendoza-sierra.org/ Mendoza, Biología, Editorial Trillas
290811
8.) Nombres científicos de Bacterias Gram Positivias y Gram Negativas
http://www.slideshare.net/jujenio/la-tincin-de-gram
190811
ANEXOS
Muestra 1: Cocos en forma de racimo.
Bacterias con pared celular Gram Positivas
Muestra 2: Bacillus
Bacterias con pared celular Gran Negativas
Muestra 3: Levaduras
Tiene pared celular Gram Negativas.
