Licenciatura Médico cirujano.

Microbiología y parasitología.
Práctica No. 3:

Integrantes:

Jhoany Montserrat Ávila Aguilar.

Perla Quetzaly Guzmán Vuelvas.
Claudio Gatica Dimas.
Erendira Medina Valdivia.

Grupo:
MEDA3.

INTRODUCCIÓN:
 Un medio de cultivo es una técnica de laboratorio (véase microbiología) que
consta de un gel o una solución que contiene los nutrientes necesarios para
permitir, en condiciones favorables de pH y temperatura, el crecimiento de virus,
microorganismos, células, tejidos vegetales o incluso pequeñas plantas.
Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es
observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el
laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el
Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el cultivo. Se han
preparado más de diez mil medios de cultivo diferentes.
Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial
debe reunir una serie de condiciones como: temperatura, grado de humedad y
presión de oxígeno adecuadas, así como un grado correcto de acidez o
alcalinidad. Existen rangos de temperatura dónde la tasa máxima de crecimiento
se encuentra entre 20 y 42 °C. A esas bacterias se las conoce como mesófilas. Un
medio de cultivo debe contener los nutrientes mínimos para establecer un medio
que contenga solamente los componentes necesarios para el crecimiento y debe
estar exento de todo microorganismo contaminante. Los medios de cultivo para
microbiología permiten el crecimiento y desarrollo de diferentes microorganismos
(bacterias, levaduras y mohos) necesarios para el sector clínico e industrial. El
estudio de los microorganismos desde el área clínica es muy importante pues
gracias a este se pueden detectar cuales son los causantes de ciertas afecciones
en el organismo y así mismo crear métodos de prevención de las mismas ya sea
mediante vacunas y/o antibióticos. Es por eso que los medios de cultivo para
microbiología aportan gran fuerza en la búsqueda de soluciones efectivas.
En la siguiente práctica, el alumnado de la licenciatura Médico cirujano del grupo A
dará a conocer los procedimientos para realizar medios de cultivo, los diferentes
tipos de cultivo y los resultados de dichos procedimientos empleados de manera
adecuada, empleando así una correcta discusión, conclusión y respondiendo el
cuestionario impuesto por la profesora.

MARCO TEÓRICO
  El material alimenticio en que crecen los microorganismos, es el
medio de cultivo y el crecimiento de microorganismos es el cultivo.
Un medio cultivo es un sustrato artificial que brinda las condiciones necesarias
adecuadas para el desarrollo de microorganísmos, estas condiciones son
nutricionales, las condiciones nutricionales brindan al microorganismo la
capacidad de poder germinar crecer y reproducirse adecuadamente bajo las
condiciones controladas en un laboratorio, dentro de los medios de cultivo
podemos tener diversos medios de esos tipos para su crecimiento

Las necesidades nutricionales básicas que debe tener todos los microorganismos
son, una fuente de carbono, el carbono es un componente esencial y central para
conformar la estructura celular y permitir a la célula realizar todas sus funciones.
Una fuente de nitrógeno, elemento esencial para que la célula constituya
macromoléculas como proteínas y ácidos nucleicos, elementos no metálicos,
iones no metálicos como el azufre y el fósforo, el azufre puede encontrarse en
proteínas, sulfatos o como azufre elemental, mientras que el fósforo puede
encontrarse formando sales, elementos metálicos calcio, zinc, sodio, potasio
cobre, magnesio, manganeso, hierro, llamados también micronutrientes
oligoelementos o elementos traza, vitaminas los microorganismos pueden
tomarlas del medio ya elaboradas o iniciar procesos de síntesis de las mismas,
agua y energía.

CLASIFICACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO DE ACUERDO A SU ESTADO

FÍSICO COMPOSICIÓN Y SU PROPÓSITO.

 SEGÚN SU ESTADO FÍSICO.

 Sólidos 1.5 a 2% de agar agar.

 Semisólidos 0.5 por ciento de agar agar.
 Líquidos no contienen agar agar.
 Bifásico contienen fase sólida y fase líquida listos para utilizar.
 Según su naturaleza o composición, naturales utilizados para cultivar
microorganismos tal y como se encuentran en la naturaleza se usan
con base a la experiencia y no a su composición.

 TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO.

MEDIOS GENERALES. Son aquellos que permiten el crecimiento de una gran
variedad de microorganismos.
MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO. Son aquellos que favorecen el crecimiento de
u determinado tipo de microorganismo sin llegar a inhibir totalmente el crecimiento
de los demás. Con adición de sangre, suero o extractos de tejidos de animales o
plantas al caldo o agar proporcionando sustancias nutritivas complementarias para
el crecimiento de microorganismos exigentes. Entre ellos, agar sangre, chocolate y
tioglicolato.
MEDIOS SELECTIVOS. Son aquellos que permiten el crecimiento de un tipo de
microorganismos determinado, inhibiendo el desarrollo de los demás. Tnemos
aquí a microorganismos que se desarrollan en medios orgánicos poco comunes
caso en el cual se omiten otros compuestos de carbono.
MEDIOS DIFERENCIALES. Son aquellos en los que se pone de manifiesto
propiedades que un determinado tipo de microorganismos posee. Contienen
reactivos químicos que atraen como resultado determinado tipo de crecimiento
bacteriano después de incubación observación de hemo los is coloraciones de las
colonias y otras reacciones indicadoras.
Existen medios que pueden cumplir funciones mixtas, es decir, selectivos y
diferenciales al mismo tiempo 8agar macconkey, ss, EMB).

OBJETIVO GENERAL:

Al finalizar este ejercicio el alumno será capaz de:

• Describir el término de esterilización y su utilidad en microbiología.
• Identificación de microorganismos por medio de su aumento en sustancias
alimenticias preparadas en laboratorio.
• Conocer las necesidades nutricionales simples que debería contener todo
microorganismo.
• Preparar de manera correcta el material que se someterá a esterilización.
• Utilizar varias metodologías para esterilizar material y medios de cultivo.
• Verificar la efectividad del proceso de esterilización.
• Describir el término de medio de cultivo en microbiología.
• Remover correctamente los desperdicios biológicos.
• Conocer la categorización de medios de cultivo.

EQUIPO, MATERIALES Y REACTIVOS

  Balanzas granatarias
 Potenciómetro
 Espátulas
 Tiras de papel kraft de 2.5 cm de ancho (para envolver pipetas)
 Tiras de papel kraft de 20 cm de ancho (para envolver cajas)
 Indicador biológico de esterilización (ampolletas o tiras de papel filtro
impregnada con esporas de
 Geobacillus stearothermophylus)
 Agua destilada
 Caldo nutritivo o caldo tripticasa soya (medio de cultivo líquido
deshidratado)
 Gelosa nutritiva o tripticasa soya agar (medio de cultivo sólido
deshidratado)
 Agar-Agar
 Solución de NaOH 1.0 N,
 Solución de HCl al 10%
___________________________________________________________
 Tripié
 Charola metálica para Tripié
 Matraz Erlenmeyer de 50 mL
 Matraz Erlenmeyer de 250 o 300mL
 Probeta de 100 o 250 mL
 Varilla de vidrio
 Gradilla
 Pipeta de 10 mL
 Pipetas de 1.0 mL
 Pipetas Pasteur (esterilizar para la siguiente clase)
 Tubos de ensayo de 16x150
 Tubos de ensayo de 22x175
 Hisopos (palitos de madera con algodón)

PROCEDIMIENTO.

a) Preparación y esterilización de material de vidrio. (Se debe realizar previo a

la preparación de medios de cultivo)
 Lavar material con detergente líquido, enjuagar con abundante agua de la
llave y al final con agua destilada.
  Secar el material de vidrio de preferencia en horno, si no es posible secar al
aire.
 En las pipetas de 1.0 mL colocar (con un clip) un filtro de algodón en la
boquilla.
 Envolver las cajas de Petri de vidrio (o se puede utilizar cajas de Petri
desechables) y pipetas de vidrio de con papel kraft de acuerdo a las
indicaciones del profesor.
 Introducir los hisopos en un tubo de 22x175 y tapar con algodón.
 En el papel de la envoltura identificar con nombre y marcar el volumen de
las pipetas. Introducir el material en un horno previamente calentado a
180ºC, esperar a que la temperatura se estabilice nuevamente y a partir de
este momento contar el tiempo de esterilización (1 hora).

b) Preparación y esterilización de medios de cultivo.

Medio de cultivo sólido

Leer cuidadosamente la etiqueta del medio de cultivo deshidratado.
Calcular la cantidad necesaria de medio de cultivo sólido deshidratado para
preparar:
Equipo Medio de cultivo Cantidad a preparar
1 XLD 150 cajas Petri c/25 mL
2 Sal y manitol 40 cajas Petri c/25 mL
3 Agar Mueller 500 mL en cajas Petri de 9 cm
Hinton c/25 mL c/u
4 Agar TCBS 100 cajas Petri c/25 mL
5 Agar gelosa 50 cajas Petri c/25 mL
sangre
6 Agar Dextrosa 20 cajas Petri c/25 mL
Sabouraud

y seguir las instrucciones del fabricante.

Tapar el matraz y calentar hasta disolución total, para ello agitar repetidamente y
evitar que el medio de cultivo hierva y se derrame.
Distribuir el medio de cultivo en recipientes adecuados y esterilizarlos en autoclave
a 121°C y 15 lbs. de presión durante 15 minutos.
Enfriar el medio entre 45°C a 50°C y distribuir en las Cajas Petri estériles en
volumen adecuado.
Antes de distribuir en las cajas Petri adicionar los suplementos.

RESULTADOS
Práctica No. 3
Equipo No. Medio de cultivo Cantidad Marca Fórmula
a Comercial
preparar
AGAR
DEXTROSA
SABOURAUD.
6. 20 cajas  DEXTROSA
Petri 40
c/25 mL LYOSTRAIN  AGAR 15.
 MEZCLA
DE
DIGERIDO
PÈPTICO:
10

= 65ML.
Poner los 65 gramos del medio en un litro de agua destilada.
Mezclar bien y disolver con calor y agitación frecuente.

Hervir durante un minuto hasta la disolución completa. Distribuir en

recipientes adecuados y esterilizar en autoclave a 21° durante 15
Instruccione minutos.
s
Dependiendo de que esten formadas las muestras, se deben
colocar el material en el centro de la superficie del medio.

- Inocular en superficie. Estrías paralelas con el asa o hisopo.

- Incubar en condiciones aeróbicas a 30±2 °C durante 18-48 horas
y hasta 7 días si fuera necesario.
- Lectura e interpretación de los resultados.

Así tendremos el resultado que queremos.

Cálculo

 25mL x 20 = 500mL.

DISCUSIÓN
¿Cuál es el punto crítico para preparar un medio de cultivo sólido? El punto crítico
para preparar un medio de cultivo solido es Calcular la cantidad necesaria de Agar
Dextrosa Sabouraud y de agua y así lograr para la preparación del medio solido
esto se logra siguiendo las instrucciones del fabricante
El fabricante en el recipiente del producto nos da una recomendación la cual es
agregar 65 gramos del medio en un recipiente y agregar un litro de agua destilada.
Para después Mezclar continuamente y disolver con calor al igual que agitar
frecuente. Una vez hecho esto se procede a Hervir durante un minuto hasta la
disolución completa. para poder
Distribuir en recipientes adecuados (recipientes Petri) y se procederá a esterilizar
en la autoclave a 118-121 ºC por un tiempo de 15 minutos.
El fabricante recomienda no sobrecalentar ya que esto Facilitaría la hidrólisis de
los componentes y que el medio permanezca blando
Discute los cálculos para preparar los medios de cultivo.
USO
el fabricante recomienda el uso de Agar Dextrosa Sabouraud para cultivar
levaduras, mohos (como hongos patógenos, particularmente aquellos asociados
con
infecciones de la piel) Este medio también se usa para determinar el contenido
microbiano y fúngico de los cosméticos y para la evaluación micológica de los
alimentos.

PRINCIPIO
La dextrosa es el carbohidrato fermentable que proporciona carbono y energía. La
mezcla de peptona proporciona nitrógeno, vitaminas, minerales y aminoácidos
esenciales para el crecimiento. El agar bacteriológico es el agente solidificante.
La alta concentración de dextrosa y el pH ácido hacen que este medio sea
selectivo para los hongos.

CONCLUSIÓN

1- Como conclusión podemos observar que para cada medio de cultivo el

proceso de preparación cambia según su fabricante ya que él es el que nos
da las recomendaciones sobre que medio de cultivo es ya para que
organismos este está hecho

2- El auto una autoclave en una herramienta indispensable ya que nos ayuda

a la esterilización de los medios de cultivos lo que nos permite utilizar el
cultivo ya sea de manera inmediata o almacenar el cultivo durante un
determinado tiempo hasta su utilización y poder analizar los diferentes
organismos
 3- Dependiendo del medio de cultivo se tiene que realizar un determinado
calculo dependiendo de la cantidad de muestras que necesitemos para
poder tener los resultados exactos.
Reportar la bibliografía consultada.
https://www.probiotek.com/productos/reactivos/medios-de-cultivo-reactivos/agar-
dextrosa-sabouraud/
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Protocolo2_3_19088.pdf
http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/10_Esteri
lizaci%C3%B3n_por_calor_seco.pdf
https://www.probiotek.com/productos/reactivos/medios-de-cultivo-reactivos/agar-
dextrosa-sabouraud/
CUESTIONARIO
PRÁCTICA No. 3

Esterilización
1. Esquematice una autoclave, indicando cuáles son las partes que la
conforman, así como la función de cada una de ellas.

Tapa: Permite retirar la parte superior del

equipo
Válvula de control: Permite controlar la
presión dentro del autoclave, así como la
apertura y cierre de purga.
Tubo de purga: Conducto por donde es
liberado el vapor.
Contenedor de aluminio: Funciona como el
chasis de la autoclave.
Soporte de contenedor / Bandeja: Base de
aluminio del contenedor
 2. ¿Qué es y cómo se lleva a cabo la esterilización por calor húmedo?
El calor húmedo destruye los microorganismos por coagulación de sus proteínas
celulares.
El primordial procedimiento de esterilización que emplea calor húmedo es la
esterilización por vapor a presión, realizando uso de una autoclave.

3. ¿Qué es y cómo se lleva a cabo la esterilización por calor seco?

La esterilización por calor seco produce la destrucción de los microorganismos por

oxidación de sus componentes celulares.

La esterilización por calor seco se puede realizar por

varios métodos:
• Aire caliente
• Llama directa
• Incineración

4. Describe los siguientes métodos de esterilización: pasteurización,

filtración, radiaciones, gases.

La pasteurización, es un procedimiento de calor húmedo, en el que se exponen los

elementos a una temperatura elevada para borrar patógenos.

La filtración descarta microorganismos/virus. No modifica estructura, y es

regularmente usada para porciones pequeñas o vitaminas, hormonas, antibióticos.

Las radiaciones se manejan en UV, su mecanismo de acción se atribuye a la

absorción por DNA, construyendo distorsiones en él, y ocasionando la inhibición
de sus síntesis y la inhibición del incremento y la respiración.

La esterilización por gases, tiene relación con una esterilización de tipo química,
donde es muchas veces utilizado el formaldehido.

5. ¿Qué es una sustancia termolábil? ¿Cómo se esteriliza?

Una sustancia termolábil, es aquella que se destruye/cambia sus propiedades a
determinada temperatura.
Una manera de esterilizar sustancias termolábiles, es haciéndolo por separado en
un pequeño volumen de agua y usando el método de filtración.

6. ¿Qué tipo de indicadores se utilizan para verificar el proceso de

esterilización?

Indicadores físicos: Termómetro, manómetro, cronometro, sensor de carga.

Indicadores químicos: Negro de eriocromo, Anaranjado de Metilo, fenolftaleína.
Indicadores biológicos: Tira de papel impregnada con esporas, vial autocontenido

7. ¿Qué microorganismo se utiliza como indicador biológico de

esterilización?
Esporas

Medios de cultivo

8. ¿Qué es un medio de cultivo y para qué se utiliza?

Es un sustrato artificial que brinda las condiciones necesarias adecuadas para el

desarrollo del microorganismo. (Condiciones nutricionales). Brindan al organismo
la capacidad de germinar, crecer y reproducirse adecuadamente.

9. ¿Qué es el agar? ¿Cuál es la forma de obtención? ¿cómo se utiliza en

la preparación de medios de cultivo.

El agar es una sustancia que sirve como medio de cultivo para el desarrollo de
hongos y de bacterias.

Obtención: El agar de tipo bacteriológico posee como componente principal un

polisacárido de complejas ramificaciones extraído de algas.

Uso: Se usa en los cultivos como agente gelificante y se añade cuando se busca
un medio sólido o semisólido.

10. Indica la clasificación de los medios de cultivo de acuerdo a su estado

físico y la utilidad de cada uno de ellos

Solidos: (1.5% agar agar)

La mezcla solidificada tiene una superficie que resiste el fino movimiento del asa
de platino, sin que este se rompa.

Semisólidos (0.5% agar agar)

es un estado intermedio entre el líquido y el sólido. Ideal en medios que sirven
para ver motilidad. Además son recomendables para la conservación de cepas,
puesto que dichos mantienen por muchísimo más tiempo la humedad.
Líquidos (No contienen agar agar)
El incremento bacteriano o fúngico se prueba por la turbidez del caldo, que
originalmente es traslúcido.

Bifásicos (Fase sólida y liquida, listo para su uso)

Son medios que se preparan de tal forma que hay una etapa sólida y sobre este
un medio líquido. Bastante usado para los hemocultivos.

11. De acuerdo a su utilidad defina ¿qué es un medio de cultivo

enriquecido, selectivo, diferencial, de transporte?

.- Medio de cultivo enriquecido:

Si se les agrega sangre o sangre calentada a los medios básicas nutritivo, se
convierten en medios enriquecidos (agar sangre y agar chocolate
respectivamente).

Dichos medios resultan muy útiles para plantar muestras que comúnmente son
estériles, para salvar cepas que se hallan débiles y para aislar microorganismos
exigentes a partir de la perspectiva nutricional.

- Medio de cultivo selectivo:

Se le adicionan sustancias inhibidoras, como por ejemplo antibióticos, anti
fúngicos, colorantes, sales biliares, entre otros.

Las sustancias inhibidoras poseen el fin de minimizar la diversidad de cepas que

logren crecer, favoreciéndose el aumento de un conjunto especialmente particular
que se quiere salvar.

- Medio de cultivo diferencial:

Contienen recursos nutricionales necesarios para el incremento de un conjunto
específico de microorganismos y además tiene sustancias que en presencia de
ciertos microorganismos van a ser metabolizados o degradados.

O sea, producirán actitudes químicas que de una u otra forma va a ser

evidenciada en el medio de cultivo.

- Medio de cultivo de transporte:

Usados para transportar muestras que fueron captada en un espacio más o
menos lejano al laboratorio que procesará la muestra. El medio de trasporte
mantiene la muestra en las superiores condiciones para que se obtengan
resultados confiables
 12. ¿Qué cuidados se deben tener al preparar los medios de cultivo?

Esterilizar el material a usar

Esterilizar el medio
Tener un punto de control
Incubación en tiempo

13. Identificar y describir el material y equipo de laboratorio que se utiliza,

así como su función en la preparación de los medios de cultivo.

 Balanzas granatarias: Muy útil al pesar cantidades muy pequeñas. Alta

extactitud.
 Potenciómetro: Es una división de tensión o voltaje.
 Caldo nutritivo o caldo tripticasa soya (medio de cultivo líquido
deshidratado): Medio muy nutritivo, no selectivo.
 Gelosa nutritiva o tripticasa soya agar (medio de cultivo sólido
deshidratado)
 Agar-Agar: Medio de cultivo sin ramificaciones, obtenido de algas (géneros
gelidium, eucheuma, gracilaria).

14. Escriba los nombres de 4 sustancias que son utilizadas en los medios
de cultivo como fuente de carbono, nitrógeno, fósforo y azufre.

Peptona: representa una fuente de nitrógeno y carbono

Guano. Más conocido como fertilizante nitrogenado, también es utilizado como
fuente de fósforo (1 a 9 % P).
Sacarosa, glucosa, fructosa, galactosa: Son fuentes de carbono
Aminoácidos como: Metionina, cisteína, son una fuente de azufre

15. ¿Qué factores físicos y químicos afectan la estabilidad de los medios

de cultivo?
 Temperatura: Cada microorganismo tiene una temperatura de crecimiento
adecuada. Un cambio en la temperatura podría afectar la velocidad de
crecimiento en función del cultivo.
 pH: Es un parámetro crítico en el crecimiento de microorganismos ya que
cada tipo de microorganismo tiene un rango de pH en el que puede vivir
adecuadamente, fuera de este rango muere.
 Tiempo de exposición A mayor tiempo de exposición, mayor es el número
de organismos destruidos.