PRÁCTICA 1

ANÁLISIS CUANTITATIVO DE CARBOHIDRATOS

OBJETIVO GENERAL
Comparar curvas de calibración de diferentes carbohidratos para cada uno de cuatro diferentes métodos de análisis cuantitativo de
carbohidratos; a saber: Antrona para hexosas, Bial para pentosas, DNS para azúcares reductores y Fenol-Sulfúrico para azúcares totales.

Objetivos conductuales
Durante la sesión práctica cada equipo de dos estudiantes deberá:
Para cada uno de los cuatro métodos, elaborar la curva de calibración de un carbohidrato asignado por el profesor.
Posteriormente la sesión práctica cada estudiante deberá ser capaz de:
Comparar las curvas de calibración de las sustancias tipo y discutir sus similitudes o diferencias.
Explicar con ecuaciones cada una de las pruebas.

MARCO TEÓRICO
Las pruebas cualitativas que utilizamos en la Práctica 1, pueden usarse para el análisis cuantitativo de los carbohidratos.
La Determinación de Hexosas Totales con Antrona se basa en la Prueba de Antrona [Ashwell, 1957], que como discutimos en la Práctica 1.
En ella, las hexosas se deshidratan a hidroximetilfurfural por las hexosas en presencia de ácido sulfúrico concentrado. Este luego
reacciona con el antranol, un tautómero enólico de la antrona para dar un color verde en soluciones diluidas y un color azul en soluciones
concentradas.
La fructosa y la glucosa reaccionan dando una coloración de igual intensidad con máximo a 620 nm. A dicha longitud de onda, la galactosa
da un 54% del color de la glucosa. Las pentosas son mucho menos sensitivas con máximo a 600 m . El ácido ascórbico da un color rojo
cereza y el triptofano un color rojo naranja con pico a 515 nm. El ácido glutámico y la gelatina dan color azul con pico a 620 m . Los
mono-, di- y trisacáridos, así como las dextrinas, dextranos, almidones, polisacáridos vegetales y gomas dan también un resultado positivo.
Los alcoholes de azúcares no dan color.
La Prueba de Bial da origen a la Determinación de Pentosas con Orcinol [Ashwell, 1957]. El método original propuesto por Bial utiliza 20
minutos de reacción en los cuales solo el 88% de la reacción se ha dado para las pentosas libres y la ribosa-3-fosfato. Horecker encontró
que la máxima producción de color se da a los 40 minutos. Sin embargo, el mayor tiempo de calentamiento afecta la interferencia de otros
azúcares. La glucosa puede convertirse en un problema en este caso al igual que la fructosa o las tetrosas. En estos casos, se
recomienda determinar la absorbancia a 580 y 670 m. Esto porque la glucosa absorbe igual a ambas longitudes de onda.
Otro método muy utilizado en el análisis de carbohidratos es la Determinación de Azúcares Reductores con DNS [Miller, 1959]. Existen
diversos métodos de análisis de azúcares reductores basados precisamente en la facilidad de oxidación que tiene el carbono hemiacetálico
libre de los azúcares. Entre ellos tenemos métodos tales como el de Somogyi-Nelson, el de Barfoed, el de Benedict y el del ácido 3,5-
dinitrosalicílico. Todos estos métodos tienen buen comportamiento cuantitativo, pero son poco específicos. Esto se debe a que muchas
sustancias reductoras pueden interferir en los mismos; por ejemplo, aminoácidos tales como la cistina, la tirosina y el triptofano son
interferentes.
La reacción de oxidación-reducción en este caso es la oxidación del carbonilo del azúcar reductor para formar el ácido mientras que el
ácido 3,5-dinitrosalicílico se reduce a ácido 3-amino, 5-nitrosalicílico.

Las hexosas, disacáridos, oligosacáridos y polisacáridos y sus derivados que posean un grupo reductor libre, reaccionan para dar un color
anaranjado amarillento con máximo de 485-490 m. Las pentosas, metilpentosas y ácidos urónicos presentan el máximo a 480 m . La
intensidad del color varía con el azúcar y los valores obtenidos para mezclas son arbitrarios.
Finalmente, existe un método utilizado para analizar azúcares totales, el Método de Fenol-Sulfúrico para Azúcares totales [Ashwell, 1966].
Este método tiene los mismos principios que los métodos de Antrona y Molisch: Simplemente que el reactivo que va a condensarse con el
derivado del furfural es el fenol. Al igual que en la reacción de Molisch, se aprovecha el calor generado por la reacción exotérmica entre el
ácido y el agua en lugar de calentar. Eso sí, se debe agregar el ácido rápidamente (entre 5 y 10 segundos) y lograr una buena mezcla para
aprovechar al máximo el calor de reacción. Al igual que con el método de DNS, para soluciones relativamente puras de un solo azúcar se
puede construir y usar la curva de calibración preparada con ese mismo azúcar, pero para mezclas los valores son totalmente arbitrarios.

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MATERIALES Y REACTIVOS

Lista de Materiales

NOTA: Los EQUIPOS son de dos personas y los GRUPOS se estimaron con 8 equipos (16 personas).
MATERIALES POR EQUIPO POR GRUPO
Agitador Vortex 1 8
Balón aforado de 50.00 mL 1 8
Baño de metal para acomodar la gradilla para tubos de 16×100 mm 2 16
Calentadores eléctricos de superficie de cerámica o metálica 1 8
Celdas para espectrofotómetro 2 16
Espectrofotómetro con lectura de 400 a 700 nm y filtros correspondientes 1 4
Gradilla para tubos de ensayo de 16×100 mm resistente a la temperatura capaz de acomodar al menos 20 1 8
tubos
Pipeta graduada de 0.100 mL (o micropipeteador graduable de 10 -100 L) 1 8
Pipeta graduada de 1.00 mL (o micropipeteador graduable de 100 -1000 L) 1 8
Pipeta graduada de 2.00 mL (o macropipeteador graduable de 0.2 - 2.0 mL) 1 8
Pipeta graduada de 5.00 mL (o macropipeteador graduable de 0.50 - 5.00 mL) 1 8
Tubos de ensayo de 16×100 mm 20 160

Lista de Reactivos

MATERIAL POR EQUIPO POR GRUPO

Ácido sulfúrico concentrado 100 mL 1000 mL
Reactivo de Antrona 100 mL 1000 mL
Reactivo de Cloruro Férrico 100 mL 1000 mL
Reactivo de Orcinol 10 mL 100 mL
Reactivo de DNS 100 mL 1000 mL
Reactivo de Fenol 4 mL 40 mL
Solución Madre de Glucosa de 2.00 mg/mL 2 mL (todos) 20 mL
Solución Patrón de Arabinosa de 200 g/mL 24 mL (1 equipo) 50 mL
Solución Patrón de 2-Desoxirribosa de 200 g/mL 24 mL (1 equipo) 50 mL
Solución Patrón de Fructosa de 200 g/mL 24 mL (1 equipo) 50 mL
Solución Patrón de Galactosa de 200 g/mL 24 mL (1 equipo) 50 mL
Solución Patrón de Glucosa de 200 g/mL 24 mL (todos) 250 mL
Solución Patrón de Lactosa de 200 g/mL 24 mL (1 equipo) 50 mL
Solución Patrón de Ribosa de 200 g/mL 24 mL (1 equipo) 50 mL
Solución Patrón de Sacarosa de 200 g/mL 24 mL (1 equipo) 50 mL
Solución Patrón de Xilosa de 200 g/mL 24 mL (1 equipo) 50 mL
Solución Patrón de Arabinosa de 25 g/mL 24 mL (1 equipo) 50 mL
Solución Patrón de 2-Desoxirribosa de 25 g/mL 24 mL (1 equipo) 50 mL
Solución Patrón de Fructosa de 25 g/mL 24 mL (1 equipo) 50 mL
Solución Patrón de Galactosa de 25 g/mL 24 mL (1 equipo) 50 mL
Solución Patrón de Glucosa de 25 g/mL 24 mL (1 equipo) 50 mL
Solución Patrón de Lactosa de 25 g/mL 24 mL (1 equipo) 50 mL
Solución Patrón de Ribosa de 25 g/mL 24 mL (todos) 200 mL
Solución Patrón de Sacarosa de 25 g/mL 24 mL (1 equipo) 50 mL
Solución Patrón de Xilosa de 25 g/mL 24 mL (1 equipo) 50 mL

IMPORTANTE: La idea de esta práctica es que cada equipo haga para cada determinación la curva de calibración
de la Glucosa, la Ribosa y algunos azúcares más a definir por el profesor, a fin de que entre todos se completen las
curvas para todos los azúcares indicados en cada procedimiento.
Por lo tanto, se debería colocar en el estante central de cada una de las cuatro mesas de trabajo del laboratorio un
juego completo de los primeros cinco reactivos de la lista.
Las soluciones patrón se pueden preparar en una sola botella y, de acuerdo con la asignación del profesor, los
estudiantes tomarían la cantidad necesaria de dichas botellas.

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Preparación de los Reactivos
NOTA: La preparación de los reactivos puede no seguir precisamente la de los documentos citados. En muchos casos, se ha
modificado el método de preparación con base en la experiencia previa.
Ácido Sulfúrico Concentrado
PELIGRO: El ácido sulfúrico concentrado (H2SO4 95-97%) es corrosivo a los metales (Categoría 1), altamente corrosivo a la piel y a los ojos (categoría
1A) causando quemaduras severas.

Reactivo de Antrona [Ashwell, 1957]

NOTA: Los mejores resultados se obtienen con el reactivo recién preparado y mantenido en un baño de agua con hielo. Sin embargo, el reactivo se
puede mantener de 7 a 8 días si se conserva entre 0 y 4°C.
PELIGRO: El Reactivo de Antrona, por su alto contenido de ácido sulfúrico, es corrosivo a los metales (Categoría 1), altamente corrosivo a la piel y a
los ojos (categoría 1A) causando quemaduras severas.
En un beaker de 150 mL, coloque 100 mL de ácido sulfúrico concentrado.
PELIGRO: El ácido sulfúrico concentrado (H 2SO4 95-97%) es corrosivo a los metales (Categoría 1), altamente corrosivo a la piel y a los ojos
(categoría 1A) causando quemaduras severas.
Agregue, lentamente, y con constante agitación con varilla de vidrio, 200 mg de antrona; y mantenga la agitación hasta disolverlos
totalmente.
NOTA: La antrona [9(10H)-antracenona – C14H10O) no está clasificada como una sustancia peligrosa.
ENVASADO: Coloque en un frasco de vidrio oscuro con gotero.
ALMACENAMIENTO: Si se preparó fresco para usar el mismo día, coloque el beaker con el reactivo en un baño de agua con hielo (0°C-4°C). Si se va
a usar en los próximos 7 a 8 días, manténgase refrigerado a 0-4°C.

Reactivo de Cloruro Férrico [Ashwell, 1957]

PELIGRO: Por su alto contenido de ácido clorhídrico concentrado (HCl concentrado el Reactivo de Cloruro Férrico es corrosivo para metales
(categoría 1) y provoca irritación cutánea (categoría 2), irritación ocular grave (categoría 2) e irritación en las vías respiratorias (categoría 3).

Disuelva 167 mg de cloruro de hierro hexahidrato (FeCl3 6H2O) en 100.0 mL de HCl concentrado.
PELIGRO: El cloruro de hierro hexahidratado (FeCl 3 6H2O) es nocivo en caso de ingestión (toxicidad aguda categoría 4), provoca irritación
cutánea (categoría 2), irritación ocular (categoría 2) y provoca lesiones oculares graves (categoría 1).
PELIGRO: El ácido clorhídrico (HCl) concentrado puede ser corrosivo para metales (categoría 1) y provoca irritación y lesiones graves cutáneas
(categoría 1B), irritación y lesiones graves oculares (categoría 1B) e irritación en las vías respiratorias (categoría 3).
PRECAUCIÓN: Se debe trabajar en la capilla por los vapores de HCl que libera el reactivo.
ENVASADO: Se debe guardar en frasco de vidrio con gotero.
ALMACENAMIENTO: Se puede almacenar a temperatura de laboratorio (15°C-25°C).

Reactivo de DNS [Ghose, 1987]

PELIGRO: El Reactivo de DNS puede ser nocivo en caso de ingestión y puede provocar irritación y quemaduras en la piel así como irritación y
quemadura ocular grave debido a su alcalinidad y contenido de fenol.
En un beaker de 2 litros, coloque 1416 mL de agua destilada; agregue al beaker con agua, 10.6 g de ácido 3,5-dinitrosalicílico y 19.8 g de
hidróxido de sodio.
ATENCIÓN: El ácido 3.5-dinitrosalicílico (C7H4N2O7) es nocivo en caso de ingestión (toxicidad aguda categoría 4).
PELIGRO: El hidróxido de sodio (NaOH) es corrosivo para los metales (categoría 1) y provoca quemaduras graves en la piel y lesiones oculares
graves (categoría 1A). Su ingestión puede resultar en quemaduras graves internas.
A la disolución anterior, agregue 306 g de tartrato de sodio y potasio y agite hasta disolver.
NOTA: El tartrato de sodio y potasio tetrahidrato (C 4H4KNaO6•4H2O) no está clasificado como una sustancia peligrosa.
Seguidamente, agregue 7.6 mL de fenol fundido a 50°C y, nuevamente, agite hasta disolver.
PELIGRO: El fenol (C6H6O) es nocivo en caso de ingestión (toxicidad aguda categoría 3), contacto con la piel (toxicidad aguda categoría 3) o
inhalación (toxicidad aguda categoría 3). Provoca quemaduras graves en la piel (corrosivo, categoría 1B) y lesiones oculares graves. Se
sospecha que provoca defectos genéticos (mutagenicidad en células germinales categoría 2), puede provocar daños en los órganos tras
exposiciones prolongadas o repetidas (toxicidad categoría 2) y es tóxico para los organismos acuáticos (categoría 2) con efectos nocivos
duraderos.
PRECAUCIÓN: Se debe trabajar en la capilla por los vapores de fenol son tóxicos.
Finalmente, agregue 8.3 gramos de metabisulfito de sodio y agite hasta disolver.
PELIGRO: El metabisulfito de sodio (Na 2S2O5) es nocivo en caso de ingestión (toxicidad aguda categoría 4) y provoca lesiones oculares graves
(categoría 1).
Tome una alícuota de 3.0 mL de la solución anterior y titúlela con solución de ácido clorhídrico 0.1M.
NOTA: El ácido clorhídrico 0.1M (HCl 0.1M) no está clasificado como una sustancia peligrosa.
Debería consumir entre 5 y 6 mL del ácido clorhídrico 0.1 M.
Si se consume menos volumen de ácido clorhídrico 0.1 M, agregue a la solución final 2 g de hidróxido de sodio por cada mililitro de ácido
clorhídrico 0.1M consumido de menos.
PELIGRO: El hidróxido de sodio (NaOH) es corrosivo para los metales (categoría 1) y provoca quemaduras graves en la piel y lesiones oculares
graves (categoría 1A). Su ingestión puede resultar en quemaduras graves internas.
ENVASADO: Coloque en un frasco de vidrio claro.
ALMACENAMIENTO: Se puede almacenar a temperatura de laboratorio (15°C-25°C).

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Reactivo de Fenol al 80% p/p [Ashwell, 1966]
PELIGRO: Por su alto contenido de fenol el Reactivo de Fenol al 80% es corrosivo para metales (categoría 1) y provoca irritación cutánea (categoría
2), irritación ocular grave (categoría 2) e irritación en las vías respiratorias (categoría 3).
En una capilla de gases, coloque un beaker de 150 mL en una balanza granataria y pese en el mismo 80 g de fenol redestilado.
PELIGRO: El fenol (C6H6O) es nocivo en caso de ingestión (toxicidad aguda categoría 3), contacto con la piel (toxicidad aguda categoría 3) o
inhalación (toxicidad aguda categoría 3). Provoca quemaduras graves en la piel (corrosivo, categoría 1B) y lesiones oculares graves. Se
sospecha que provoca defectos genéticos (mutagenicidad en células germinales categoría 2), puede provocar daños en los órganos tras
exposiciones prolongadas o repetidas (toxicidad categoría 2) y es tóxico para los organismos acuáticos (categoría 2) con efectos nocivos
duraderos.
PRECAUCIÓN: Se debe trabajar en la capilla por los vapores de fenol son tóxicos.
Entonces, agregue al fenol en el beaker de 150 mL. 20 mL de agua destilada y mezcle bien.
ENVASADO: Se debe guardar en frasco de vidrio.
ALMACENAMIENTO: La solución es estable durante meses a temperatura de laboratorio (15°C-25°C). Puede desarrollar un color amarillo pálido con
el tiempo, pero este cambio de tonalidad no interfiere con el ensayo.

Reactivo de Orcinol [Ashwell, 1957]

PELIGRO: Por su alto contenido de orcinol el Reactivo de Orcinol es corrosivo para metales (categoría 1) y provoca irritación cutánea (categoría 2),
irritación ocular grave (categoría 2) e irritación en las vías respiratorias (categoría 3). Además, en caso de ingestión, además de provocar quemaduras
(por el ácido concentrado) pude ser nocivo (por el orcinol).
Pese 10 g de orcinol y disuélvalos en 100 mL de etanol al 95%.
PELIGRO: El orcinol (C 7H8O2) es nocivo en caso de ingestión (toxicidad aguda categoría 4), provoca irritación cutánea (categoría 2), irritación
ocular (categoría 2) e irritación en las vías respiratorias (categoría 3).
PELIGRO: El etanol al 95% (C 2H5OH al 95%) es un líquido inflamable (categoría 2), provoca irritación ocular grave (categoría 2), provoca irritación
de la piel y vías respiratorias y puede ser dañino si se ingiere.
ENVASADO: Coloque en un frasco de vidrio oscuro con gotero.
ALMACENAMIENTO: Se debe preparar fresco cada día.

Soluciones Madre de Azúcares de 2.00 mg/mL

Prepare una Solución Madre de 2.00 mg/mL para cada uno de los siguientes azúcares: Arabinosa, 2-Desoxirribosa, Fructosa, Galactosa,
Glucosa, Lactosa, Ribosa, Sacarosa y Xilosa.
Para ello, pese 0.2000 g del azúcar anhidro seco y colóquelos en un beaker de 100 mL
NOTA: Ninguno de los azúcares arriba mencionados está clasificado como una sustancia peligrosa.
Agregue al beaker 30 mL de agua destilada y disuelva el azúcar.
Finalmente, transfiera, cuantitativamente, la solución del beaker a un balón aforado de 100 mL y afore a la marca con agua destilada.
ENVASADO: Coloque en botella plástica oscura.
ALMACENAMIENTO: Se debe guardar en congelación, hasta antes de usar.

Solución Patrón de Azúcares de 200 g/mL

NOTA: Ninguna de las soluciones acuosas de azúcares preparadas en esta práctica están clasificadas como una sustancia peligrosa.
Con una pipeta volumétrica de 5.00 mL, tome una alícuota de 5.00 mL de Solución Madre de 2.00 mg/mL del azúcar y dispénsela en un
balón aforado de 50.00 mL. Afore a la marca con agua destilada.
ENVASADO: Coloque en botella plástica oscura.
ALMACENAMIENTO: Se debe guardar en congelación, hasta antes de usar.

Solución Patrón de Azúcares de 25 g/mL

NOTA: Ninguna de las soluciones acuosas de azúcares preparadas en esta práctica están clasificadas como una sustancia peligrosa.
Con una pipeta graduada de 10.00 mL, tome una alícuota de 6.25 mL de Solución Patrón de 200 g/mL del azúcar y dispénsela en un balón
aforado de 50.00 mL. Afore a la marca con agua destilada.
ENVASADO: Coloque en botella plástica oscura.
ALMACENAMIENTO: Se debe guardar en congelación, hasta antes de usar.

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PROCEDIMIENTO:

Determinación de Hexosas Totales con Antrona [Ashwell, 1957]

Cada equipo hará una curva de calibración para glucosa y otro azúcar asignado.
Para cada curva, prepare soluciones de 0, 30, 60, 90, 120 y 150 g/mL del azúcar a analizar de acuerdo con el siguiente procedimiento.
NOTA: Ninguna de las soluciones acuosas de azúcares preparadas en esta práctica están clasificadas como una sustancia peligrosa.
Identifique seis tubos de ensayo de 16×100 mm con los números 0, 30, 60, 90, 120 y 150 y colóquelos en una gradilla para tubos de
ensayo.
NOTA: Use un marcador indeleble resistente al agua en ebullición.
NOTA: Estos números corresponden a la concentración, en g/mL, de la disolución del azúcar a probar, que se medirá para confeccionar la curva de
calibración.
Dispense en dichos tubos los volúmenes de Solución Patrón de 200 g/mL del azúcar, y de agua destilada, indicados en el Cuadro 1 a
continuación.

CUADRO 1. PREPARACIÓN DE CURVA DE CALIBRACIÓN PARA HEXOSAS CON ANTRONA

Identificar los tubos por contenido de azúcar en g/mL 0 30 60 90 120 150
Agregue a cada tubo los mililitros indicados de Solución Patrón de 200 g/mL del
0.00 0.30 0.60 0.90 1.20 1.50
azúcar.
Agregue a cada tubo los mililitros indicados de agua destilada y mezcle bien en el
2.00 1.70 1.40 1.10 0.80 0.50
Vortex.
Coloque todos los tubos identificados en un baño de agua con hielo (0-4°C) y déjelos alcanzar la temperatura del baño.
Agregue a cada tubo —poco a poco, con agitación y manteniendo en el baño frío— 4.00 mL de Reactivo de Antrona.
PELIGRO: El Reactivo de Antrona, por su alto contenido de ácido sulfúrico, es corrosivo a los metales (Categoría 1), altamente corrosivo a la piel y a
los ojos (categoría 1A) causando quemaduras severas.
Mezcle bien el contenido del tubo de ensayo en el Vortex y coloque nuevamente el tubo en el baño de agua con hielo.
Saque los tubos del baño de agua con hielo y déjelos alcanzar la temperatura ambiente.
Coloque una bola de vidrio en la boca de cada tubo.
Coloque la gradilla con los tubos tapados en un baño hirviendo por 15 minutos.
Remueva la gradilla con los tubos del baño de agua hirviendo.
Deje los tubos enfriar hasta temperatura ambiente.
Lea la absorbancia a 625 nm, usando el tubo marcado 0 como blanco de reactivo, y anote en el Cuadro 2, en la fila correspondiente al
azúcar utilizado.

CUADRO 2. CURVAS DE CALIBRACIÓN PARA HEXOSAS CON ANTRONA

Concentración del azúcar en g/mL 0 30 60 90 120 150
Absorbancia para Arabinosa 0.000
Absorbancia para 2-Desoxirribosa 0.000
Absorbancia para Fructosa 0.000
Absorbancia para Galactosa 0.000
Absorbancia para Glucosa 0.000

Absorbancia para Lactosa 0.000

Absorbancia para Ribosa 0.000
Absorbancia para Sacarosa 0.000
Absorbancia para Xilosa 0.000

Recolecte las lecturas obtenidas por cada equipo del grupo para los otros azúcares.
Elabore las curvas de calibración para cada azúcar en un mismo gráfico de absorbancia vs concentración y comente los resultados.

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Determinación de Pentosas Totales con Orcinol [Ashwell, 1957]
Cada equipo hará una curva de calibración para ribosa y otro azúcar asignado.
NOTA: Ninguno de los azúcares utilizados en esta prueba está clasificado como una sustancia peligrosa.
Para cada curva, prepare soluciones de 0, 5, 10, 15, 20 y 25 g/mL del azúcar a analizar de acuerdo con el siguiente procedimiento.
Identifique seis tubos de ensayo de 16×100 mm con los números 0, 5, 10, 15, 20 y 25 y colóquelos en una gradilla para tubos de ensayo.
NOTA: Use un marcador indeleble resistente al agua en ebullición.
NOTA: Estos números corresponden a la concentración, en g/mL, de la disolución del azúcar a probar, que se medirá para confeccionar la curva de
calibración.
Prepare 50 mL de Solución Patrón de 50 g/mL del azúcar siguiendo lo indicado a continuación. Con una pipeta graduada de 20.00 mL,
tome una alícuota de 6.25 mL de Solución Patrón de 200 g/mL del azúcar y dispénselos en un balón aforado de 50 mL. Afore a la marca
con agua destilada.
Dispense en dichos tubos los volúmenes de Solución Patrón de 25 g/mL del azúcar, y de agua destilada, indicados en el Cuadro 3 a
continuación.

CUADRO 3. PREPARACIÓN DE CURVA DE CALIBRACIÓN PARA PENTOSAS CON ORCINOL

Identificar los tubos por contenido del azúcar en g/mL 0 5 10 15 20 25
Agregue a cada tubo los mililitros indicados de Solución Patrón de 25 g/mL del
0.00 0.60 1.20 1.80 2.40 3.00
azúcar.
Agregue a cada tubo los mililitros indicados de agua destilada y mezcle bien en
3.00 2.40 1.80 1.20 0.60 0.00
el Vortex.
Agregue a cada tubo 3.00 mL del Reactivo de Cloruro Férrico y mezcle bien en el Vortex.
PELIGRO: Por su alto contenido de ácido clorhídrico concentrado (HCl concentrado el Reactivo de Cloruro Férrico es corrosivo para metales
(categoría 1) y provoca irritación cutánea (categoría 2), irritación ocular grave (categoría 2) e irritación en las vías respiratorias (categoría 3).
Agregue a cada tubo 0.30 mL del Reactivo de Orcinol y mezcle bien en el Vortex
PELIGRO: Por su alto contenido de orcinol el Reactivo de Orcinol es corrosivo para metales (categoría 1) y provoca irritación cutánea (categoría 2),
irritación ocular grave (categoría 2) e irritación en las vías respiratorias (categoría 3). Además, en caso de ingestión, además de provocar quemaduras
(por el ácido concentrado) pude ser nocivo (por el orcinol).
Coloque una bola de vidrio en la boca de cada tubo.
Coloque la gradilla con los tubos tapados en un baño hirviendo por 40 minutos.
Remueva la gradilla con los tubos del baño de agua hirviendo.
Deje los tubos enfriar hasta alcanzar temperatura ambiente.
Lea la absorbancia a 670 nm, usando el tubo marcado 0 como blanco de reactivo, y anote en el Cuadro 4, en la fila correspondiente al
azúcar utilizado.

CUADRO 4. CURVAS DE CALIBRACIÓN PARA PENTOSAS CON ORCINOL

Concentración del azúcar en g/mL 0 5 10 15 20 25
Absorbancia para Arabinosa 0.000
Absorbancia para 2-Desoxirribosa 0.000
Absorbancia para Fructosa 0.000
Absorbancia para Glucosa 0.000
Absorbancia para Lactosa 0.000
Absorbancia para Ribosa 0.000
Absorbancia para Xilosa 0.000
Recolecte las lecturas obtenidas por cada equipo del grupo para los otros azúcares.
Elabore las curvas de calibración para cada azúcar en un mismo gráfico de absorbancia vs concentración y comente los resultados.

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Determinación de Azúcares Reductores con DNS [Ghose, 1987]
Cada equipo hará una curva de calibración para glucosa y otro azúcar asignado.
NOTA: Ninguno de los azúcares utilizados en esta prueba está clasificado como una sustancia peligrosa.
Para cada curva, prepare soluciones de 0, 40, 80, 120, 160 y 200 g/mL del azúcar a analizar de acuerdo con el siguiente procedimiento.
Identifique seis tubos de ensayo de 16×100 mm con los números 0, 40, 80, 120, 160 y 200 y colóquelos en una gradilla para tubos de
ensayo.
NOTA: Use un marcador indeleble resistente al agua en ebullición.
NOTA: Estos números corresponden a la concentración, en g/mL, de la disolución del azúcar a probar, que se medirá para confeccionar la curva de
calibración.
Dispense en dichos tubos los volúmenes de Solución Patrón de 200 g/mL del azúcar, y de agua destilada, indicados en el Cuadro 5 a
continuación.

CUADRO 5. PREPARACIÓN DE CURVA DE CALIBRACIÓN PARA AZÚCARES TOTALES CON DNS

Identificar los tubos por contenido del azúcar en g/mL 0 40 80 120 160 200
Agregue a cada tubo los mililitros indicados de patrón Solución Patrón de 200
0.00 0.30 0.60 0.90 1.20 1.50
g/mL del azúcar.
Agregue a cada tubo los mililitros indicados de agua destilada y mezcle bien en
1.50 1.20 0.90 0.60 0.30 0.00
el Vortex.
Agregue a cada tubo de ensayo 25 μL (0.025 mL) de la Solución Madre de 2.00 mg/mL de Glucosa como patrón interno.
NOTA: La Solución Madre de Glucosa de 2.00 mg/mL no está clasificada como una sustancia peligrosa.
Agregue a cada tubo 4.50 mL de Reactivo de DNS y mezcle bien en el Vortex.
PELIGRO: El Reactivo de DNS puede ser nocivo en caso de ingestión y puede provocar irritación y quemaduras en la piel, así como irritación y
quemadura ocular grave debido a su alcalinidad y contenido de fenol.
Coloque una bola de vidrio en la boca del tubo.
Coloque la gradilla con los tubos tapados en un baño de agua hirviendo por 5 minutos.
Remueva los tubos del baño de agua hirviendo y colóquelos en el baño de agua con hielo por 3 minutos para enfriar.
Remueva los tubos del baño de agua con hielo y déjelos que alcancen la temperatura ambiente.
Lea la absorbancia a 550 nm, usando el tubo marcado 0 como blanco de reactivo, y anote en el Cuadro 6, en la fila correspondiente al
azúcar utilizado.

CUADRO 6. CURVAS DE CALIBRACIÓN PARA AZUCARES REDUCTORES CON DNS

Concentración del azúcar en g/mL 0 40 80 120 160 200
Absorbancia para Arabinosa 0.000
Absorbancia para 2-Desoxirribosa 0.000
Absorbancia para Fructosa 0.000
Absorbancia para Galactosa 0.000
Absorbancia para Glucosa 0.000
Absorbancia para Lactosa 0.000
Absorbancia para Ribosa 0.000
Absorbancia para Xilosa 0.000
Recolecte las lecturas obtenidas por cada equipo del grupo para los otros azúcares.
Elabore las curvas de calibración para cada azúcar en un mismo gráfico de absorbancia vs concentración y comente los resultados.

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Determinación de Azúcares Totales con Fenol-Sulfúrico [Ashwell, 1966]
Cada equipo hará una curva de calibración para glucosa y otro azúcar asignado.
NOTA: Ninguno de los azúcares utilizados en esta prueba está clasificado como una sustancia peligrosa.
Para cada curva, prepare soluciones de 0, 20, 40, 60, 80 y 100 g/mL del azúcar a analizar de acuerdo con el siguiente procedimiento.
Identifique seis tubos de ensayo de 16×100 mm con los números 0, 20, 40, 60, 80 y 100 y colóquelos en una gradilla para tubos de ensayo.
NOTA: Use un marcador indeleble resistente al agua en ebullición.
NOTA: Estos números corresponden a la concentración, en g/mL, de la disolución del azúcar a probar, que se medirá para confeccionar la curva de
calibración.
Dispense en dichos tubos los volúmenes de Solución Patrón de 200 g/mL del azúcar, y de agua destilada, indicados en el Cuadro 7 a
continuación.

CUADRO 7. PREPARACIÓN DE CURVA DE CALIBRACIÓN PARA AZÚCARES TOTALES CON FENOL-SULFÚRICO

Identificar los tubos por contenido de azúcar en g/mL 0 20 40 60 80 100
Agregue a cada tubo los mililitros indicados de Solución Patrón de 200 g/mL del
0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00
azúcar.
Agregue a cada tubo los mililitros indicados de agua destilada y mezcle bien en el
2.00 1.80 1.60 1.40 1.20 1.00
Vortex.
Agregue a cada tubo 50 μL (0.050 mL) de Reactivo de Fenol al 80% p/p y mezcle bien en el Vortex.
PELIGRO: Por su alto contenido de fenol el Reactivo de Fenol al 80% es corrosivo para metales (categoría 1) y provoca irritación cutánea (categoría
2), irritación ocular grave (categoría 2) e irritación en las vías respiratorias (categoría 3).
Rápidamente, agregue a cada tubo 5.00 mL de Ácido Sulfúrico Concentrado y mezcle rápido y bien en el Vortex.
PELIGRO: El ácido sulfúrico concentrado (H2SO4 95-97%) es corrosivo a los metales (Categoría 1), altamente corrosivo a la piel y a los ojos (categoría
1A) causando quemaduras severas.
NOTA: Es muy importante que el ácido sulfúrico concentrado se agregue muy rápidamente (4 -6 segundos) y se agite de inmediato pues se debe
asegurar el calentamiento de la mezcla por el calor de dilución del ácido.
Deje los tubos en reposo por 30 minutos.
NOTA: El color es estable por varias horas.
Lea la absorbancia a 485 nm, usando el tubo marcado 0 como blanco de reactivo, y anote en el Cuadro 8, en la fila correspondiente al
azúcar utilizado.

CUADRO 8. CURVAS DE CALIBRACIÓN PARA AZÚCARES TOTALES CON FENOL-SULFÚRICO

Concentración del azúcar en g/mL 0 20 40 60 80 100
Absorbancia para Arabinosa 0.000
Absorbancia para 2-Desoxirribosa 0.000
Absorbancia para Fructosa 0.000
Absorbancia para Galactosa 0.000
Absorbancia para Glucosa 0.000
Absorbancia para Lactosa 0.000
Absorbancia para Ribosa 0.000
Absorbancia para Sacarosa 0.000
Absorbancia para Xilosa 0.000
Recolecte las lecturas obtenidas por cada equipo del grupo para los otros azúcares.
Elabore las curvas de calibración para cada azúcar en un mismo gráfico de absorbancia vs concentración y comente los resultados.

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BIBLIOGRAFIA
Ashwell, G. (1957) “Colorimetric Analysis of Sugars” en Methods in Enzymology, Vol. 3, pp 73-105.
Ashwell, G. (1966) “New Colorimetric Methods of Sugar Analysis” en S.P. Collowick & N.O. Kaplan, Eds., Methods in Enzymology, Vol. 8, pp
85-95.
Miller, G.L. (1959) “Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugars”, Anal. Chem., 31, 426.
Ghose, T.K. (1987) “Measurement of Cellulase Activities” Pure & Appl. Chem. 59 (2) 257-268-.

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