Crom atografía

Parám etros básicos en

crom atografía
 Introducción

 La cromatografía es un sistema de separación

dinámica, porque continuamente se producen
equilibrios entre los componentes de la mezcla a
separar y las fases móvil y estacionaria.

 La fase estacionaria consiste en partículas,

generalmente sólidas, pequeñas y con una
superficie micro-porosa, de forma que presenta
un amplio desarrollo superficial. Puede estar
empaquetada en forma de columna o extendida
en forma de capa .
 Parámetros
Factor de retención
Considerando un solo analito que se encuentra en equilibrio entre la
fase estacionaria y la fase móvil, se define el llamado coeficiente de
reparto o constante de distribución (KD) como la concentración molar
de analito en la fase estacionaria (Cs) dividida por la concentración
molar del analito en la fase móvil (Cm):

sustituyendo (C) por el número de moléculas por unidad de volumen:

donde (k') es el factor de retención o factor de capacidad, que define

la velocidad de migración de un analito en una columna determinada,
y (² ) es la relación de fases.
 Parámetros
Factor de retención
El tiempo que tarda la fase móvil en pasar a través de la columna se le
conoce como (t0) y equivale al tiempo para una sustancia no retenida.

El volumen de elución de la fase móvil en el que sale el compuesto de

interés se conoce como volumen de retención (VR), y el tiempo
transcurrido desde que el compuesto es inyectado hasta que alcanza
el detector es conocido como tiempo de retención (tR). El volumen de
retención es característico de cada compuesto y está relacionado con
la constante de distribución. Al volumen de fase móvil requerido para
eluir una sustancia no retenida se le conoce como (Vm o Vo).
 Parámetros
Factor de asimetria
Si se observa las Figuras , puede verse que para un pico perfectamente
simétrico, los segmentos A y B medidos al 10 % de la altura del pico
son iguales, por tanto el valor de asimetría (Af) según la fórmula sería
de 1:
 Parámetros
Factor de cola
Para la no existencia de colas, la suma de los segmentos A y B partido
por el doble de uno de ellos debería ser 1, siendo (Tf) el factor de cola.
 Parámetros
Factor de cola
Para la no existencia de colas, la suma de los segmentos W 0,05 partido
por el doble de f, siendo (Tf) el factor de cola.

W0, 05
Tf =
2f
 Parámetros
Eficiencia
El modelo del plato teórico supone que la columna cromatográfica
contiene gran número de capas separadas, llamadas platos teóricos. Los
equilibrios para la separación de la muestra entre la fase estacionaria y la
fase móvil tienen lugar en estos supuestos platos. El analito se mueve en
la columna por transferencia de fase móvil equilibrada desde un plato
hasta otro

El modelo proporciona una medida de la eficiencia de la columna, que se

puede expresar como el número de platos teóricos de una columna (N),
cuántos más platos la columna será más eficiente. O como lo que mide
cada plato (HEPT, altura equivalente del plato teórico), cuánto más
pequeño mayor eficiencia. Siendo (L) la longitud de la columna, estos
conceptos quedan relacionados de la siguiente forma
:
HEPT = L / N donde L es el largo de la columna
Parámetros
Eficiencia
Concepto de Plato Teórico (N)

Altura de la
L fase
Altura del plato (HEPT) H = estacionaria
N
Parámetros
Eficiencia
Concepto de Plato Teórico (N)

Altura de la
L fase
Altura del plato (HEPT) H = estacionaria
N
 Tema dos

Resolución
La resolución R de una columna constituye una medida cuantitativa de su
capacidad para separar dos analitos, en este término si se toma en cuenta
el ensanchamiento de los picos, así que la magnitud de este valor si
permite asegurar la separación de dos picos.

2(t 2 − t1 )
R=
W2 + W1
Factor de Selectividad

El factor de selectividad ± de una columna, como su nombre lo indica, es un

término que define que tan selectiva es una columna para separar dos picos. Es
de hacer notar, que la columna puede ser selectiva a una separación, que se
identifica por un valor alto de este factor,

El factor de selectividad de una columna para dos especies A y B se define como:

t 2 − t0 k '
α= = 2
t1 − t0 k 1
'
 2
 t 
N = 16 
W 

2
 t 
N = 5,54 
 h/2 
W

2(t 2 − t1 )
R=
W2 + W1

t1 − t0
K=
t0

t 2 − t0
α=
t1 − t0

W0, 05
T=
2f
  Mediante la cromatografía de líquidos se consigue
separar seis hidrocarburos aromáticos policíclicos,
empleando una columna RP-18 de 25 cm de
longitud. El caudal dela fase móvil
acetonitrilo/agua es de 0'8 mL/ min,
obteniéndoselos siguientes resultados:

Analito tR (min) w (min)

A partir de estos datos, calcular:
No retenido 3'4
a. El factor de retención
Naftaleno 5'2 0'41 b. El número de platos teóricos promedio
c. La resolución
Fluoreno 7'4 0'62

Fenantreno 8'3 0'81

 t 
2 2(t 2 − t1 ) t1 − t0
Benzoantraceno 11'5 1'53 N = 16  R= K=
W  W2 + W1 t0
Criseno 12'1 1'95
  Mediante cromatografía HPLC se estudiaron varias disoluciones
de ibuprofeno de diferente concentración, obteniéndose los
siguientes resultados
Concentración ibuprofeno Atura relativa de
(µg/ mL) pico
0'5 5'0 Tiempo (h) Atura
1'0 10'1 relativade
pico
2'0 17'2
o O
3'0 19'8
0'5 91'3
6'0 39'7 1'0 80'2
8'0 57'3 1'5 52'1
10'0 66'9 2'0 38'5
15'0 95'3 3'0 24'2
4'0 21'2
Se perfeccionó un método para separar y determinar ibuprofeno en 6'0 18'5
muestras de plasma de rata. Se administró por vía oral este medicamento a 8'0 15'2
una rata de laboratorio. Posteriormente, se tomaron diferentes muestras de
sangre en diferentes tiempos y se analizaron mediante HPLC. Se
obtuvieron los siguientes resultados:
 x y x2 y2 X xY
p.p.m. C A c2 a2 cxa
0,5 5 0,25 25 2,5
(∑ xi ) 2
Sxx = ∑ xi2 − 1 10,1
n 1 102,01 10,1
(∑ yi ) 2 2 17,2 4 295,84 34,4
Syy = ∑ yi2 −
n 3 19,8 9 392,04 59,4
6 39,7 36 1576,09 238,2
(∑ xi ∑ yi )
Sxy = ∑ xy − 8 57,3
n 64 3283,29 458,4
−− ∑ Xi 10 66,9 100 4475,61 669
X= 15 95,3
n 225 9082,09 1429,5
−− ∑ Yi SUMATORIAS = 45,50 311,3 439,25 19231,97 2901,5
Y =
n n 8

Y −b
X =
m

Y = b + mX
__ __ S XY
b =Y−m X r= =
m=
Sxy
(S XX )(. SYY )
Sxx
Las sustancias A y B tienen tiempos de retención de 16.40 y 17.63 min,
respectivamente, en una columna de 30 cm. Una especie no retenida pasa
a través de la columna en 1.30 min. Las anchuras máximas (en la base) de
A y B son 1.11 y 1.21 min, respectivamente. Calcule:
a) la resolución entre los compuestos A y B
b) el número medio de platos de la columna
c) la altura de plato
d) la longitud de la columna necesaria para lograr una resolución de 1.5
e) el tiempo necesario para eluir la sustancia B en la columna que da un
valor de RS de 1.5

2
 t  t1 − t0
N = 16  K=
W  t0
2(t − t )
R= 2 1
W2 + W1
  t 
2
t1 − t0 2(t 2 − t1 )
N = 16  K= R=
W  t0 W2 + W1

La figura muestra el cromatograma de una mezcla de dos componentes

en una columna cromatográfica de líquidos empaquetada, de 25 cm. La
velocidad de flujo fue de 0.40 mL min-1.
a) Determina los factores de retención para los dos componentes
b) Calcula la resolución de los dos picos
c) Halla la altura media de plato
d) ¿Qué longitud de la columna se necesitaría para alcanzar una
resolución de 1.75?
e) Supongamos que la longitud de la columna se ha fijado a 25 cm y que
el material de empaquetamiento está fijo. ¿Qué medidas podría usted
tomar a fin de incrementar la resolución para lograr la separación en línea
base?
f)¿Hay alguna medida que usted pudiera usar para lograr una mejor
separación en menos tiempo con la misma columna que en el apartado
anterior?