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Aislados proteicos de semillas de olivo: composición química, propiedades

funcionales y caracterización proteica

Chapter · January 2013

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Agnieszka Zienkiewicz Alfonso Clemente

Nicolaus Copernicus University Spanish National Research Council
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Andrea Rueda
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 El Aceite de Oliva. Actas Simposio Expoliva 2013
Jaén (España) 8-11 mayo
I.S.B.N. 978-84-938900-1-8 

Aislados proteicos de semillas de olivo: composición química, propiedades

funcionales y caracterización proteica
Adoración Zafra1, Agnieszka Zienkiewicz1,3, Alfonso Clemente2, Sara Al-lach4, Ada Fernández Márquez4,
Irene Martín Aznarte4, Andrea Rueda4, Carmen Salmerón1, Jose Carlos Jimenez Lopez1,5,
Antonio Jesús Castro1, Maria Isabel Rodríguez García1, Juan de Dios Alché1
1
Estación Experimental del Zaidín, CSIC, Dpto. Bioquímica, Biología Celular y Molecular de Plantas, Granada (E)
2
Estación Experimental del Zaidín, CSIC, Instituto en Formación de Nutrición Animal, Armilla, Granada, (E)
3
Dept. Physiology and Molecular Biology of Plants, Nicolaus Copernicus University, Toruń, Poland,
4
IES Generalife, Granada, (E)
5
The UWA Institute of Agriculture, University of Western Australia, Crawley, Australia

RESUMEN algunas almazaras que realizan deshuesados

previos a la molturación de manera rutinaria, gracias
La industria alimentaria produce rutinariamente aislados
proteicos a partir de harinas desengrasadas de diversas a deshuesadoras de diseño propio o modificadas
fuentes vegetales. Estos aislados proteicos se utilizan en la sobre sistemas de tipo “Ulrich” (Luaces et al., 2004).
elaboración de productos alimenticios de calidad y con Por otra parte diversas industrias como las de
propiedades funcionales mejoradas respecto a las harinas elaboración de aceituna de mesa, generan
iniciales. Las fuentes proteicas más utilizadas son la soja, igualmente ingentes cantidades de hueso, que cada
cacahuete, trigo y diversas leguminosas. El olivo posee vez es utilizado en una mayor variedad de
semillas que no son hasta el momento utilizadas por estas aplicaciones (Rodríguez et al., 2007).
industrias de forma rutinaria, a pesar de su alto contenido
proteico. El presente trabajo explora diversos métodos A diferencia de otras plantas como la soja, colza,
para la preparación de aislados proteicos a partir de esta garbanzo, girasol, trigo, guisante, altramuz, haba,
fuente, y describe su posterior caracterización bioquímica etc., la semilla del olivo no ha sido tradicionalmente
mediante electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS- utilizada para alimentación animal, aunque diversos
PAGE) y su contenido en proteínas de tipo 11S similares a estudios han demostrado que las proteínas más
leguminas. Finalmente, se describe la localización celular y
subcelular de los lugares de acumulación de estos
abundantes en las semillas maduras del olivo son las
componentes. Los resultados obtenidos son de gran denominadas “proteínas de almacenamiento de
utilidad para establecer el potencial de esta fuente semillas” (SSPs) de tipo 11S, similares a leguminas
alimentaria y servirán de base a posteriores análisis (Alché et al., 2006; Wang et al., 2007; Castro et al.,
nutricionales en distintos animales de experimentación. 2007). En gran parte de las oleaginosas, la
Palabras clave: aislados proteicos, cuerpos proteicos,
extracción del aceite genera ingentes cantidades de
globulinas, leguminas, Olea europaea L., olivo, proteínas, harina desengrasada, cuyos principales
semillas, tripsina. componentes son fibra y proteína, y que son por
tanto utilizados como complemento en alimentación
animal (Vioque et al., 2001). Con objeto de
INTRODUCCIÓN incrementar el valor añadido de estos subproductos y
permitir aplicaciones de mayor interés como la
El olivo y sus industrias asociadas generan gran alimentación humana, las harinas son sometidas a
cantidad de residuos agroalimentarios cuyo procesos de extracción y mejora de estas proteínas
procesamiento y gestión son actualmente que culminan en la obtención de los denominados
susceptibles de optimización y valorización, de forma concentrados y aislados proteicos. En este trabajo se
que contribuyan a generar valor añadido y a describen procedimientos preliminares para la
disminuir su impacto ambiental. Los sistemas de generación de estos aislados proteicos a partir de la
elaboración de aceite más comunes en España semilla del olivo, mediante la utilización de métodos
utilizan en la actualidad la aceituna en su conjunto, a clásicos de precipitación isoeléctrica (Sánchez-
pesar de que históricamente se han desarrollado Vioque et al., 1999; Vioque et al., 2001; Robles y
sistemas para el deshuesado de la aceituna previo a Mora, 2012)
la molturación, como el clásico “trapetum” de origen
griego (S II A.C.) o el “Acapulco-Quintanilla” de MATERIAL Y MÉTODOS
principios del siglo XX. En la actualidad existe un Material
renovado y creciente interés por el deshuesado
previo, que ha motivado la existencia de diversos Se utilizaron almendras de olivo de la variedad
estudios que describen su efecto sobre el aroma del 'Picual', cedidas por las empresas Elayotecnia S.L.
aceite de oliva virgen (Luaces et al., 2004), o sobre (Castillo de Locubín, Jaén) y almazara “el Picón”
factores de calidad como el perfil fenólico, estabilidad (Albanchez de Mágina, Jaén). Estas almendras
y amargor (Joorani, 2010). Existen en la actualidad fueron obtenidas a partir de aceitunas maduras

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propiedades funcionales y caracterización proteica. A. Zafra, A.
Zienkiewicz, A. Clemente, S. Al-lach, A. Fernández Márquez, I.
Martín Aznarte, A. Rueda, C. Salmerón, J.C. Jiménez Lopez, A.J.
Castro, MªI. Rodríguez García, J.D. Alché. 

mediante deshuesado y posterior fractura y teniendo en cuenta el factor de dilución ocurrido

separación de los endocarpos (Fig. 1A, B). El durante la titulación. La electroforesis se realizó por
material se conservó a -20ºC hasta su uso. duplicado para las 11 muestras de pellet y para las
11 de sobrenadante. Una de las réplicas se utilizó
Preparación, desengrasado y pre-tratamiento de
para la visualización del perfil proteico mediante
la harina
tinción con sales de plata (Rabilloud et al., 1992) y la
Se trituraron 40 g de almendras, y la harina otra para transferencia y posterior inmunomarcado.
resultante fue desengrasada utilizando hexano El anticuerpo utilizado en el procedimiento de
(Figura 1C) (Sánchez-Vioque et al., 1998 con ligeras inmunomarcado fue un antisuero anti-proteínas 11S
modificaciones). Brevemente, el triturado se agitó de olivo desarrollado en nuestro laboratorio (Alché et
con 100 ml de hexano durante 20 min y continuación al., 2006). Como anticuerpo secundario se utilizó un
se eliminó la fase superior (hexano). Este proceso se anticuerpo anti-conejo IgG marcado con Alexa-488
repitió otras 3 veces más, dejándose secar (Molecular Probes) y el revelado se realizó en un
finalmente el triturado resultante. A continuación se equipo Pharos FX (Bio-Rad). Para la cuantificación
realizaron 4 lavados de 20 min con agua mediante de las bandas se utilizó el software Quantity One
agitación y posterior filtración. Finalmente, la harina 4.6.2 (Bio-Rad). La intensidad de las bandas fue
se lavó con etanol al 20% (v/v) y se dejó secar. expresada en CNT (unidades arbitrarias devueltas
por el software).
Extracción de proteínas
Microscopia óptica y electrónica
Se probaron dos métodos de extracción alcalina
(Sánchez-Vioque et al., 1998). El método 1 incluyó la Las semillas fueron obtenidas de aceitunas maduras
suspensión de 20 g de harina desengrasada en 200 de la variedad Picual. Estas semillas fueron
ml de NaOH al 0,2 % (p/v), pH 12. Se agitó durante 1 procesadas de forma paralela para microscopia
h y a continuación se centrifugó a 8.000 g durante 15 óptica y electrónica de transmisión (Alché et al.,
min. El sobrenadante se guardó a 4ºC y el pellet 2006) en resina Unicryl (BBInternational). Las
obtenido se volvió a resuspender en NaOH al 0.2%, muestras fijadas fueron cortadas en secciones
pH 12, repitiéndose el proceso otras dos veces más semifinas de 1µm (que fueron teñidas con azul de
hasta obtener el producto de tres sobrenadantes, Toluidina), y ultrafinas de 70 nm (que en este caso
que fueron finalmente combinados. El método 2 se fueron contrastadas con acetato de uranilo y nitrato
ejecutó de igual forma, pero la solución utilizada para de plomo), y fueron visualizadas respectivamente en
la extracción de proteínas fue en este caso Na2SO3 un microscopio óptico Zeiss Axioplan y un
al 0,25% (p/v), pH 10,5. Las proteínas obtenidas en microscopio electrónico JEOL TEM1011.
las distintas extracciones fueron cuantificadas
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
mediante el método Bradford (Bradford, 1976).
Los huesos de olivo suministrados como resultado
Determinación del punto isoeléctrico de las
del deshuesado de la aceituna (Fig. 1A) están
proteínas de harina de semillas de olivo
integradas por el endocarpo leñoso (que procede del
Se llevó a cabo mediante una titulación de alícuotas lóculo) y la almendra, semilla o embrión localizada en
del primero de los tres sobrenadantes arriba su interior, y que puede ser aislada del hueso tras la
mencionados para cada procedimiento. Para el fractura del endocarpo y su separación (Fig. 1B). El
cambio de pH se utilizó HCl 0,5 M hasta conseguir resultado de la trituración de estas almendras fue
un total de 11 alícuotas con pHs desde 7,0 hasta 2,0, una pasta rica en componentes lipídicos (Fig. 1C)
con una diferencia de media unidad entre ellas. que fue sometida a un desengrasado mediante
Estas alícuotas fueron centrifugadas a 8.000g disolventes orgánicos, lavado posterior y desecado
durante 30 min a 4ºC y tanto los sobrenadantes para generar la harina desengrasada que
como los precipitados fueron almacenados para consideramos el material original de partida para la
posteriores determinaciones. La cantidad de generación de los aislados proteicos (Fig. 1D). El
proteínas de los sobrenadantes obtenidos fue proceso indicado puede considerarse simple y
igualmente cuantificada por el método Bradford. efectivo, y está destinado a evitar la formación de
complejos lípido-proteína que puedan deteriorar la
Separación electroforética de las proteínas
calidad del producto final (Clemente, 1998). Sin
Las proteínas presentes en los sobrenadantes y embargo, podrían ser utilizados otros métodos
precipitados resultantes del método 1 fueron alternativos que pueden mejorar los rendimientos
separadas mediante SDS-PAGE en gradiente 4-20% posteriores. Estos procedimientos incluyen la
(Sistema CriterionTM, BioRad) en condiciones utilización alternativa de harinas ya desengrasadas
desnaturalizantes y reductoras (tampón de muestras parcialmente, obtenidas por prensado de las
50 mM Tris-HCl pH 6,8, 2% SDS, 50% glicerol, 0,1 M almendras en factorías especializadas mediante
DTT, 0,03% azul de bromofenol). El volumen de condiciones adecuadas, y destinado a la obtención
muestra cargado fue igual en todas las calles, de aceite de almendra de olivo. Otro procedimiento

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Martín Aznarte, A. Rueda, C. Salmerón, J.C. Jiménez Lopez, A.J.
Castro, MªI. Rodríguez García, J.D. Alché. 

alternativo ampliamente descrito en la literatura es el compatible con estudios anteriores realizados en

uso del extractor Soxhlet con el mismo propósito distintas fuentes de harina desengrasada como la
(Clemente, 1998; Sánchez-Vioque et al., 1999; colza y el garbanzo (Gonçalvez et al., 1997;
Robles y Mora, 2012). Sánchez-Vioque et al., 1999).
Tras el desengrasado de la harina, la preparación de Los análisis de los perfiles proteicos mediante SDS-
aislados proteicos se realiza generalmente en el PAGE de los sobrenadantes y precipitados obtenidos
caso de leguminasas siguiendo alguno de los a diferentes pHs durante la titulación (Fig. 4),
siguientes procedimientos: i) precipitación confirman los resultados obtenidos mediante el
isoeléctrica de las proteínas y posterior separación método de Bradford mencionado anteriormente
de las mismas del resto de las moléculas solubles (Fig.3). Es por ejemplo claro el aumento de la
mediante centrifugación, ii) concentración proteica cantidad de proteína presente en los precipitados
por ultracentrifugación, o iii) extracción de proteínas exactamente a pH 4,0 (Fig 4B).
con cloruro de sodio y precipitación por micelación
Por otra parte, los inmunoblots permiten ratificar que
(Clemente, 1998 ; Vioque et al., 2001; Robles y
las especies peptídicas presentes en los perfiles a
Mora, 2012). En el presente trabajo se ha utilizado el
distintos pHs corresponden en una elevada
primero de estos procedimientos. En este caso se
proporción a proteínas de almacenamiento de tipo 11
han preparado dos tipos de aislados de la almendra
similares a leguminas (Fig. 4C y D, y cuantificación
de olivo, usando sulfito sódico en el medio de
en Fig. 4), dado su reconocimiento por el anticuerpo
extracción o sin él. La extracción con NaOH es
específico anti-11S y el patrón característico de los
económicamente más barata que la extracción con
péptidos obtenidos en condiciones desnaturalizantes
sulfito sódico, aunque este segundo tipo tiene
y reductoras (Alché et al., 2006; Wang et al., 2007;
ventajas como el uso de condiciones menos severas
Castro et al., 2007). Este patrón está bien
de extracción (pH 10,5 frente a pH 12), y el hecho de
conservado en diferentes subproductos del
que el sulfito inhibe la oxidación de polifenoles
procesado de la semilla del olivo y de la producción
presentes en la muestra, eliminando posibles
del aceite (Jiménez-López et al., 2007; Ben Ali, 2011)
reacciones secundarias de éstos. En relación a la
y es incluso similar en otras especies vegetales
cantidad de proteínas extraídas mediante ambos
(Allach et al., 2009).
métodos, dicha cantidad es sustancialmente superior
usando NaOH (Fig. 2). Las extracciones sucesivas Finalmente, el análisis de la estructura celular y
(rondas 2 y 3 de extracción) de la harina subcelular de los tejidos de la semilla permite
desengrasada no mejoran esencialmente el identificar los lugares de acumulación de los
rendimiento en proteína obtenido en la primera componentes lipídicos y proteicos, respectivamente
extracción (Fig. 2). en cuerpos lipídicos y proteicos, con una distribución
subcelular altamente organizada y repetitiva. Esta
A lo largo de las titulaciones correspondientes, la
distribución sufre una serie de modificaciones como
solubilidad de las proteínas de semillas de olivo fue
respuesta a los cambios fisiológicos que experimenta
decreciendo de forma exponencial desde pH 7,0
la semilla por ejemplo durante la germinación
hasta llegar a un mínimo entre los pHs 4 y 4,5 (Fig.
(Zienkiewicz et al., 2011a).
3). Las titulaciones a pHs inferiores (entre 4,0 y 2,0),
aunque también produjeron lecturas inferiores de la Los resultados obtenidos representan una primera
cantidad de proteína medida mediante el método de aproximación a la generación de aislados proteicos
Bradford, supusieron cambios en la tendencia de las en el caso de la harina de semillas de olivo. Estos
curvas, por lo que es probable la presencia de algún resultados deben ser complementados con otros
tipo de interferencia en la lectura espectrofotométrica numerosos parámetros que incluyen la
que limite la fiabilidad del método Bradford a esos determinación de la composición química de los
pHs. Estas mediciones deberían ser por tanto aislados (proteína total por diversos métodos, fibra,
contrastadas mediante métodos de determinación grasa residual, azúcares…), presencia de factores
proteica alternativos (ej. Lowry) o la determinación de antinutritivos como la sinapina de colza, gosipol de
nitrógeno in los sobrenadantes en relación al algodón, ácido clorogénico en girasol y de aflatoxinas
nitrógeno total extraído (Sánchez-Vioque et al., (provenientes de contaminación por Aspergilus por
1999). Las tendencias son idénticas en el caso de condiciones de almacenamiento en humedad). Al
ambos métodos de extracción (NaOH y Na2SO3), igual que la mayoría de leguminosas sería razonable
aunque la curva de disminución de solubilidad es determinar la presencia de inhibidores de la tripsina y
más regular en el caso del Na2SO3. Como se otras proteasas, así como lectinas, que
observa en la Fig. 2, la capacidad extractiva total de generalmente están presentes en cantidades
proteínas es superior en el caso del método 1 moderadas. Igualmente sería conveniente testar la
(NaOH) que en el 2 (Na2SO3) (Fig.3). El pI presencia de taninos en la testa, palatabilidad de la
mayoritario de las proteínas presentes en los harina, y contenido en metales. Otros factores a
extractos es por tanto próximo a 4,0-4,5, lo que es tener en cuenta para el uso potencial de estos

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aislados serían la uniformidad de la disponibilidad de ƒ Jiménez-López, J.C., Alché, J.D., Wang, W.,
la fuente primaria de material (harina) a lo largo del Rodríguez-García, M.I. (2007) El contenido proteico
año. y la posible existencia de diferencias entre mayoritario del alpeorujo corresponde a proteínas de
variedades o entre métodos de obtención. Es almacenamiento de semillas tipo 11S. En: El Aceite de
Oliva. Actas del Simposium Científico-Técnico
previsible la presencia de algunas diferencias en los EXPOLIVA 2005. Fundación del olivar, Jaén. ISBN 978-
perfiles proteicos entre harinas de semillas 84-934503-0-4, pp-365-376.
procedentes de deshuesado previo a molturación o
de deshuesado de aceitunas de mesa, tras el ƒ Joorani, B. (2010) Influencia del tratamiento de
proceso de cocción. Finalmente, sería interesante deshuesado de aceitunas en la calidad del aceite de
oliva virgen: Caracterización del perfil fenólico y su
conocer la digestibilidad de las harinas y aislados
efecto sobre la estabilidad y el amargor. Tesis de
proteicos en comparación con la de los extractos Máster, Universidad de Córdoba.
completos de semillas (Zienkiewicz et al., 2011b).
ƒ Luaces, P., Pérez, A.G., Sanz, C. (2004) Efecto del
AGRADECIMIENTOS. Este trabajo ha sido deshuesado de la aceituna sobre el aroma del aceite
sufragado por los siguientes proyectos cofinanciados de oliva virgen. Grasas y Aceites 55: 174-179.
con fondos FEDER: MCINN BFU2011-22779,
ƒ Rabilloud, T., Brodard, V., Peltre, G., Righetti, P.G.,
P2010-AGR6274 y P2011-CVI7487 (J. Andalucía), Ettori, C. (1992) Modified silver-staining for immobilized
así como una Acción Marie Curie programa pH gradients. Electrophoresis 113: 262-266.
PEOPLE. CE. PIOF-GA-2011-301550. Los autores ƒ Robles, M.C., Mora, E.R. (2012) Influencia del método
agradecen a la almazara ”El Picón” S.L. (Albanchez de obtención en las características fisicoquímicas y
de Mágina, Jaén) y a Elayotecnia S.L. (Castillo de estructurales de aislados de soja. IX Congreso de
Locubín, Jaén) la cesión del material utilizado. Ciencias de los Alimentos y V Foro de Ciencia y
Tecnología de Alimentos. XXV Aniversario de la
REFERENCIAS Carrera de Ingeniería en Alimentos en el Instituto de
Ciencias Agrícolas, Universidad de Guanajuato,
ƒ Alché, J.D., Jimenez-Lopez, J.C., Wang, W., Castro,
México, pp. 716-721
A.J., Rodríguez-García, M.I. (2006) Biochemical
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ƒ Allach, M., M´rani, M., Sabouni, I., Alché, J.D. (2009)
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máster “Master of Science” en Olivicultura y (Cicer arietinum L.) flour and protein isolates. Food
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Figura 1. Semillas maduras de O. europaea cv. 'Picual' y productos de su transformación. A: semillas resultantes del
deshuesado de aceitunas maduras. B: almendras obtenidas tras la ruptura y separación del endocarpo. C: pasta oleaginosa
generada mediante triturado de las semillas. D: harina resultante del desgrasado de la pasta mediante tratamiento con hexano
y posterior secado de la muestra.

Figura 2. Contenido en proteína total recuperada de la harina de semilla utilizando dos soluciones básicas alternativas.
Concentración de proteínas (µg/µl) en cada una de las tres extracciones realizadas para cada solución, calculada mediante el
método de Bradford.

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Figura 3. Contenido de proteína total soluble tras ajustar el pH de las soluciones básicas alternativas de extracción a valores
entre 2.0 y 7.0. Concentración de proteínas calculada mediante el método de Bradford (µg/µl) en los sobrenadantes, tras la
titulación de los extractos a distintos valores de pH para cada uno de los dos métodos de extracción utilizados.

Figura 4. Perfiles proteicos SDS-PAGE (A y B) e inmunoblots correspondientes a proteínas 11S (C y D) de las fracciones
solubles (sobrenadantes) e insolubles (precipitados) obtenidos tras la titulación del extracto obtenido mediante el método 1 a
diferentes pHs. E: cuantificación de las bandas reactivas al anticuerpo anti-proteínas de almacenamiento de tipo 11S de olivo.
Los péptidos p1 a p5 corresponden a las distintas cadenas de tipo α y β que integran los precursores Pro 1 y Pro 2,
generalmente observados en condiciones no reductoras (Alché et al., 2006). Se observa una progresiva disminución en la
cantidad de proteína soluble, de forma coincidente con la disminución del pH de la solución. Alternativamente se produce un
incremento en la cantidad de proteína 11S presente en los precipitados, con un pico alrededor de pH 4.0.

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Figura 5. Estructura tisular y subcelular del endospermo de la semilla de olivo.

A y B: secciones semifinas observadas a microscopía óptica en la que se observan los tegumentos, compuestos por una
cutícula (flechas), y una testa formada por varios estratos (exo-, meso- y endotesta) que rodea a las células del endospermo
(E). Las células del endospermo contienen numerosos cuerpos densamente teñidos por azul de Toluidina en el citoplasma
(cuerpos proteicos: CP), rodeados por estructuras birrefringentes no teñidas (cuerpos lipídicos: CL). En algunas células del
endospermo se observa el núcleo intensamente teñido, y con localización central. Las estructuras mencionadas son
claramente distinguibles en secciones ultrafinas observadas a microscopía electrónica de transmisión (C y D). En este caso, los
cuerpos lipídicos, de unas 2 µm de diámetro, contienen material con baja densidad electrónica en comparación con los cuerpos
proteicos a los que rodean, y que presentan en su interior zonas translúcidas a los electrones.

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