AISLAMIENTO DE INTEGRANTES:

-JESÚS ARROYO

MITOCONDRIAS
-VALENTINA BEDOYA
-DANIELA VERBEL
-JUAN PRETELT

Las mitocondrias son orgánulos dinámicos, cuya DOCENTE:

EYDYELIANA MONTH
función principal es la generación de ATP a través
JURIS
de un sistema de fosforilación oxidativo.

UNIVERSIDAD DE
SUCRE

2020
INTRODUCCIÓN
Las mitocondrias son orgánulos dinámicos, cuya función principal es la generación de ATP
a través de un sistema de fosforilación oxidativo. También participan en numerosas rutas
metabólicas, como son: la síntesis de nucleótidos, genera como subproducto la mayor
parte de las especies reactivas de oxígeno, generación y modulación de las señales de
Ca2+ y la muerte celular programada denominada apoptosis. Según la Teoría de la
Endosimbiosis Seriada, “Las mitocondrias son orgánulos intracelulares derivados de la
endosimbiosis de un organismo del grupo de las proteobacterias con un ancestro de las
células eucariotas que contenía un núcleo”. Una característica importante en la que se
basa esta teoría, es el sistema de doble membrana que poseen las mitocondrias,
constituido por una membrana mitocondrial externa y otra interna separadas por un
espacio intermembrana. La membrana externa la separa del citoplasma y permite el paso
de moléculas pequeñas, mientras que la membrana interna es una barrera muy selectiva,
lo que permite el mantenimiento del gradiente de protones para la síntesis de ATP y
presenta una serie de pliegues denominados crestas que le proporcionan una gran
superficie. Otra característica importante de las mitocondrias, y que sustenta la propuesta
antes mencionada es que ellas poseen su propio genoma, denominado ADN mitocondrial
(mtDNA) el cual codifica para proteínas, tRNA y ribosomas; por lo tanto, el resto de las
proteínas mitocondriales están codificadas por genes nucleares y traducidos mediante su
ARN mensajeros con lo que se obtienen proteínas precursoras mitocondriales. Debido a la
estructura de doble membrana de las mitocondrias, el importe de proteínas es un proceso
complejo ya que las proteínas dirigidas a la matriz deben cruzar la membrana mitocondrial
externa y la interna. El mtDNA es altamente polimórfico, ya que presenta numerosas
diferencias en la secuencia entre individuos del mismo grupo étnico, se ven
incrementados entre individuos de grupos distintos. Los haplotipos de mtDNA se basan en
patrones específicos de polimorfismos y algunos de ellos, parecen estar relacionados con
diversos procesos como la motilidad espermática, el envejecimiento, la susceptibilidad a
diversas enfermedades o la expresión de algunas mutaciones. Debido a la importancia
biológica de estas partículas intracelulares, se han desarrollado diversos métodos para su
aislamiento. La mayoría de estos métodos se basan en el tamaño, relativamente grande
de las mitocondrias y utilizan para su purificación la centrifugación de tejidos
homogeneizados. En esta práctica del Laboratorio del Curso Biología Celular se realizará
un procedimiento para el aislamiento de mitocondrias de corazón de res con el fin de
observar las diferencias en relación a sus patrones de sedimentación y tinción con
colorantes indiferentes, ácidos y básicos. Este conocimiento es fundamental para que el
biólogo que realice investigaciones bioquímicas, poblacionales o histológicas por citar
algunos de ellos tenga los elementos básicos para la purificación de mitocondrias.
Competencias
 Comprende los procesos metodológicos para la purificación de mitocondrias.
 Aprende los elementos básicos de centrifugación para la purificación de mitocondrias.
 Aíslala mitocondrias de tejidos animales.
 Diferencia mitocondrias de órganos animales por tinción.
Materiales y reactivos para la práctica
 3 Cajas de Petri.
 Probeta de 50 ml.
 Filtro de malla de tela.
 Gasas (traer los estudiantes).
 Embudo.
 Gradilla
Tubos de fondo cónico, en polipropileno transparente de 15 ml.
 Tubos Eppendorf de 1.5 ml.
 Balanza analítica.
 Vaso de precipitado.
 Centrífuga.
 Rotor con cabezal oscilante.
 Adaptador para rotor de cabezal oscilante para tubos de
15 ml.
 Propipeta automática.
 Pipetas de 5 y 10 ml.
 Micropipetas con puntas desechables de 0.1-1ml y0.02-0.2 ml.
 Pipetas Pasteur.
 Procesador de alimentos (Traer los estudiantes).
 Láminas porta y cubre objetos (Traer los estudiantes).
 Microscopio marca NIKON modelo ECLIPSE E200.
 Lámpara de alcohol.
Tejidos y soluciones:
 Corazón de res (traer los estudiantes).
 Amortiguador fosfatos (HPO4/H3PO4 pH 7.4).
 Gradiente discontinuo de sacarosa al: 30%, 25%, 20%, 15% y 10% disuelta en
amortiguador fosfatos (peso/volumen). Nota el gradiente puede ser también en Percol a
una concentración 60%, 50%, 40%, 30%, 20%disueltas en amortiguador fosfatos.
Sudán IV al 2%, Azul de Metileno al 2% y Eosina al 2%,
disueltos en amortiguador fosfatos.
 Agua desionizada.
Material requerido por los estudiantes:
 Bata de laboratorio.
 Guantes.
 Las personas con cabello largo emplear cofia.
 Tijeras quirúrgicas.
 Pinza hemostática.
Metodología
1. Se lavó con agua corriente aproximadamente 250 gramos corazón de res.
2. Con unas tijeras se cortaron los tejidos en fragmentos pequeños y se colocaron en
su respectiva caja de Petri.

3. Se colocaron 25 ml de amortiguador fosfatos en el procesador de alimentos junto

con 15 fragmentos de corazón de res y se trituraron por 3min. El restante de este
se maceró a mano.
4. Se filtró el lisado con una malla de tela y con 6-8 gasas hasta obtener 10 ml del
lisado.

5. Equilibramos en balanza cada uno de los tubos que contienen en lisado Y

procedimos a centrifugar a 1000 gravedades por 10 min a temperatura ambiente.
6. Se transfirió el sobrenadante que contenía las mitocondrias a un nuevo tubo

7. Se colocaron 3 ml en la parte superior del gradiente de sacarosa 30, 25, 20, 15, 10
en una proporción 1:1:1:2:2. Centrifugamos a 3500 g por 45 min.

8. Se equilibró y centrifugó la fracción recuperada a 3500 x g durante 10 min a

temperatura ambiente.
9. Colocamos las mitocondrias en cuatro tubos Eppendorf y se aforó con 900
microlitros de amortiguador fosfatos.

10. Adicionamos 100 µl de los colorantes Sudán III, Azul de Metileno y Eosina, y
mezclamos suavemente con vortex por 30 segundos.
11. Incubamos las mezclas por 5 min a 50 grados centígrados.
12. De cada tinción realizamos un frotis de 50 µl en el cubre objetos y fijamos la
muestra por calor.
13. Sumerjimos los portaobjetos en un vaso de precipitado con agua desionizada para
retirar el exceso de colorante y observamos sus muestras en el microscopio.
Resultados:
Comprobación de lisis celular bajo el microscopio.

Luego de retirar el exceso de colorante se observó la muestra en el microscopio y se

comprobó que esta lisis celular se produce debido a que las mitocondrias se rompen al
entrar en contacto con el agua desionizada lo cual esto produce un choque osmótico
entre ellas.
Es de mucha importancia que su proceso purificador no entre en contacto con ella de tal
forma que así se asegura su fortalecimiento en su método. Si se llega a estandarizar o a
homogenizar por demasiado tiempo produciría el efecto que las mitocondrias harían la
lisis en menor calidad de preparación.

Centrifugación diferencial:
Luego la centrifugación de los 10ml a 1000 rotaciones por minuto a temperatura
ambiente, cuyo proceso se realizó por 5 min. A partir de esto se obtuvo la separación de
las organelas que se produjo debido a que los componentes de este se separan en función
de su tamaño y densidad: los componentes de gran tamaño y más densos migran más
rápidamente hasta el fondo a velocidades relativamente bajas y forman un sedimento.

Figura 1. Representación del patrón de centrifugación para el aislamiento de mitocondrias.

Los valores corresponden al procedimiento experimental

También es de mucha importancia no traer fracciones de otras regiones de centrifugación ya que

esta puede contaminar la muestra la representación de los patrones de centrifugación se indica en
la Figura 1.

Como resultado se observan como las concentraciones más altas

son prácticamente transparentes, Mientras que las densidades
más bajas (10, 15 y 20 de sacarosa) Presentan un color carmesí que
a medida que subimos de concentración se vuelve menos fuerte. fuerte.
Azul de Metileno
Corresponde a la tinción del genoma, DNA Mitocondrial y proteínas.

En la tinción de azul de metileno se puede observar que esta corresponde a la tinción del
genoma es decir proteínas y DNA mitocondrial.

Eosina:

En nuestro caso se lograron aislar proteínas individuales.

La tinción Eosina es únicamente con proteínas estas se

Aíslan debido a que la eosina tiene carácter acido por

Lo cual tiñe sustancias básicas.

En este montaje que fue teñido por sudan III se observan lípidos teñidos. En el centro del campo
visual se aprecian como los lípidos son teñidos por un color rojo carmesí.

Además de eso con esta tinción se observará que corresponde a las grasas y membranas de las
mitocondrias.
Análisis de resultados
Para el inicio de esta práctica, se lavaron con agua destilada aproximadamente 250
gramos del corazón de una res, luego con unas tijeras se cortaron los tejidos en trozos
pequeños y se colocaron en las cajas de Petri.

Seguidamente se colocaron 25 ml de amortiguador fosfato en el procesador de alimentos,

con 15 trozos de corazón de res los cuales se trituraron por 3 minutos y el sobrante de
este se maceró a mano en un mortero.
Entonces se filtró el lisado con una malla y con unas 6 a 8 gasas, hasta tener 10 ml del
lisado en un vaso precipitado.

El contenido se estabilizo en dos tubos de ensayo los cuales contenían la misma cantidad
del lisado en cada uno, luego se procedió a centrifugar a 100g por 10 minutos a una
temperatura ambiente.
Centrifugado.

De los tubos con un sobrenadante y un pequeño precipitado en el fondo, el sobrenadante

corresponde al resto de organelos, como son mitocondrias, vacuolas, lisosomas que se
encontraron dispersas en esta sustancia, y el precipitado corresponde al núcleo celular

Con mucho cuidado y sin agitar, se trasladó la sustancia a un segundo tubo para realizar
un procedimiento de centrifugado diferencial, este proceso es diferente a la
centrifugación antes realizada, porque en el centrifugado diferencial se utilizó el gradiente
de sacarosa en el cual cada fase de dicho gradiente tuvo un lugar dentro del tubo de
ensayo dependiendo de su peso.

Las concentraciones más altas se alojaron hacia el fondo del tubo y a medida que fue
disminuyendo la concentración se formaron las diversas capas menos concentradas, la
concentración fue de mayor a menor, iniciando desde la parte inferior del tubo como se
muestra:
 10

15

20

25

30

En una proporción 1:1:1: 2:2. Lo que significa que debe tener la misma proporción, lo que
significa que si la proporción es de 1:1 se debe tener la misma cantidad de una sustancia y
la otra, si es una proporción 1:2, significa que va a tener una parte de una y la otra el
doble.
Al construir el gradiente y partir la primera proporción que fue 30 μl y en la parte superior
30μl del sobrenadante obtenido.
Luego, lentamente por las paredes del tubo y con una pipeta Pasteur se colocó cada una
de las fases del gradiente con mucho cuidado y sobre el, 3 ml del sobrenadante.
Por último se procedió a centrifugar por 45 minutos por 3500g, para después observar
varias bandas en ese tubo de ensayo las cuales se separaron banda por banda para
obtener el aislamiento de las mitocondrias.
La sustancia suspendida se colocó en los tubos de plástico eppendorf y se le colocaron
aproximadamente 200μl y 900μl de amortiguador fosfato, se emplearon varios tubos
porque se usaron varios colorantes, en esencia, 3, que son, azul de metileno, eoscina y
sudán III.

Con ayuda de la micropipeta se adicionaron cada uno de los componentes y se le

adicionaron 100μl de los colorantes sudán III, azul de metileno y eoscina, luego se
procedió a mezclar suavemente con un vortex por alrededor de unos 30 segundos.
Luego del mezclado se llevaron las mezclas a una incubadora precalentada por 5 minutos
a unos 50°C, para que luego se tomaran 50μl de cada tinción y se realizó un frotis para
cada portaobjetos, finalmente se colocó un cubreobjetos y se fijó la muestra con calor.
Observaciones atreves del microscopio.

Comprobación de lisis celular bajo el microscopio.

Inicialmente al realizar el proceso de fraccionamiento en un procesador de alimentos y en
un mortero, las observaciones que se obtuvieron con mejores resultados fueron en el
mortero, ya que este permitió un mejor rompimiento de la membrana, donde el buffer
fosfato ayudó a estabilizar las células.
La imagen que se puede observar, es el procedimiento de centrifugación realizado antes,
para el aislamiento de las mitocondrias.

Posteriormente, luego de 45 minutos de centrifugación, se logró observar las

mitocondrias contenidas en una concentración de 30 a 25% de sacarosa, se observó de
manera muy clara como las concentraciones más altas eran casi transparentes, mientras
que las densidades más bajas (10, 15 y 20% de sacarosa)se presentaron en un color
carmesí y que a medida que subía la concentración se volvieron más fuerte, finalmente se
retiró cuidadosamente el sobrenadante, y se aseguró el anillo que contenía las
mitocondrias.
Cuestionario
¿Para qué me sirve el saber la forma de aislar mitocondrias en el laboratorio?
Esta nos sirve para futuras investigaciones y proyectos que tengan que ver por ejemplo
con la respiración celular y su funcionamiento.
¿Qué utilidad tienen el tener mitocondrias aisladas?
El tener mitocondrias aisladas nos permite investigar y diciéndolo de otra forma
"curiosear" desde más cerca su funcionamiento y composición
¿Existen otros métodos para aislar mitocondrias además de la centrifugación?
Según lo investigado no, siempre aparece por Centrifugación. Presuntamente creemos
que no.
¿Puedo usar el conocimiento de mitocondrias en biotecnología u otras áreas?
Sí, el conocimiento de mitocondrias se puede utilizar en distintos campos ya que la
mitocondria es parte esencial de la célula. Y esta es es la base para muchas investigaciones
¿Cuál es la utilidad del conocimiento de las mitocondrias en la biología?
Tener conocimiento sobre las mitocondrias es de gran importante, ya que este organelo
celular es el encargado de uno de los procesos mas importante en los seres vivos que es la
creación de ATP con la cual los seres vivos que la utilizan realizan sus procesos vitales, y si
este organelo presenta algún daño, se verían afectados estos procesos.

Conclusiones
A partir de la practica realizada y del análisis de sus resultados, obtenemos que a partir de
largos procesos se puede aislar la mitocondria de la célula y observarla con minuciosidad,
esta practica nos es de gran utilidad para analizar a las mitocondrias por aparte sin tener
que confundirla con otro organelo, ya que nos da la seguridad que estamos aislando este
organelo, todo esto con la ayuda de las tinciones de los reactivos.