BAM Capítulo 12: Staphylococcus aureus

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Autores: Sandra Tallent (mailto:[email protected]) , Jennifer Hait, Reginald W. Bennett (ret.) y Gayle A. Lancette (ret.)

Historial de revisión :

Marzo de 2016: La temperatura de incubación de S. aureus se cambió de 35 °C a 35-37 °C.

Staphylococcus aureus es muy vulnerable a la destrucción por tratamiento térmico y casi todos los agentes desinfectantes. Por lo tanto,
la presencia de esta bacteria o sus enterotoxinas en los alimentos procesados ​o en los equipos de procesamiento de alimentos es
generalmente una indicación de un saneamiento deficiente. s _ aureus puede causar una intoxicación alimentaria grave. Se ha
identificado como el agente causante de muchos brotes de intoxicación alimentaria y probablemente sea responsable de más casos en
individuos y grupos familiares de lo que muestran los registros. Los alimentos se examinan para detectar la presencia de S . aureus y/o
sus enterotoxinas para confirmar que S . aureuses el agente causante de enfermedades transmitidas por los alimentos, para determinar
si un alimento es una fuente potencial de intoxicación alimentaria por "estafilococos" y para demostrar la contaminación posterior al
procesamiento, que generalmente se debe al contacto humano o superficies contaminadas en contacto con alimentos. Conclusiones
sobre el significado de S . aureus en los alimentos debe hacerse con cautela. La presencia de un gran número de S . aureus en un
alimento puede indicar una mala manipulación o saneamiento; sin embargo, no es evidencia suficiente para incriminar a un alimento
como causa de intoxicación alimentaria. El aislado S. aureusdebe demostrarse que produce enterotoxinas. Por el contrario, las pequeñas
poblaciones de estafilococos en el momento de la prueba pueden ser remanentes de grandes poblaciones que produjeron enterotoxinas
en cantidad suficiente para causar intoxicación alimentaria. Por lo tanto, el analista debe considerar todas las posibilidades al analizar
un alimento para S . aureo _

Métodos utilizados para detectar y enumerar S . aureus dependen de las razones para probar el alimento y de la historia pasada del
material de prueba. Los alimentos procesados ​pueden contener cantidades relativamente pequeñas de células viables debilitadas, cuya
presencia debe demostrarse por los medios apropiados. Análisis de alimentos para S . aureus puede dar lugar a acciones legales contra la
parte o partes responsables de un alimento contaminado. Los métodos de análisis para S . aureus que se han estudiado en colaboración y
se han encontrado adecuados para proporcionar el tipo de información necesaria para los requisitos de la FDA se presentan en este
capítulo.

Ha habido una controversia considerable sobre el significado y el método correcto de lectura de la prueba de coagulasa. Los resultados
de la investigación han indicado que la débil actividad coagulasa representada por las reacciones 1+, 2+ y 3+ rara vez se corresponde con
otros criterios asociados con S . áureo (4). Un consenso de pares ha establecido que una reacción de coagulasa 4+ es necesaria para la
identificación incuestionable de S . aureo _ Aquellas cepas sospechosas de ser S . aureussobre la base de reacciones de coagulasa de
menos de 4+ debe confirmarse mediante otras pruebas, como la fermentación anaeróbica de glucosa, la sensibilidad a la lisostafina y la
producción de termonucleasa. Se realizaron estudios de morfología colonial en agar de Baird-Parker, sensibilidad a la lisostafina,
producción de coagulasa y termonucleasa, y fermentación de glucosa y manitol en 100 cepas enterotoxigénicas y 51 no enterotoxigénicas
de S . aureo (3). En todos los casos, las reacciones de las cepas enterotoxigénicas y no enterotoxigénicas variaron en un 12 % o menos.
Esta investigación indica que no se puede confiar en ninguna de estas pruebas para diferenciar los estafilococos tóxicos de los no tóxicos.

Método de conteo directo de placas

Este método es adecuado para el análisis de alimentos en los que más de 100 S . se pueden esperar células aureus /g. Se ajusta al método
de la ref. 1.

A. Equipos y materiales
1. Mismo equipo básico que para el recuento de placas convencional (Capítulo 3).

2. Gabinete de secado o incubadora para secar la superficie de las placas de agar

3. Varillas estériles de vidrio doblado para rayar, en forma de palo de hockey o de azada, con extremos pulidos al fuego, de 3-4
mm de diámetro, 15-20 cm de largo, con una superficie de extensión en ángulo de 45-55 mm de largo

B. Medios (/food/laboratory-methods/media-index-bam) y reactivos (/food/laboratory-methods/reagents-index-bam)

1. Baird-Parker mediano ( M17 (/food/laboratory-methods/bam-media-m17-baird-parker-medium-ph-70) )

2. Agar tripticasa (tríptico) soja (TSA) ( M152 (/food/laboratory-methods/bam-media-m152-trypticase-tryptic-soy-agar) )

3. Caldo de infusión de cerebro y corazón (BHI) ( M24 (/food/laboratory-methods/bam-media-m24-brain-heart-infusion-bhi-

broth-and-agar) )
4. Plasma coagulasa (conejo) con EDTA
 5. Agar azul de toluidina-ADN ( M148 (/food/laboratory-methods/bam-media-m148-toluidine-blue-dna-agar) )

6. Lisostafina (Schwartz-Mann, Mountain View Ave., Orangeburg, NY 10962)

7. Agar de extracto de levadura de triptona ( M165 (/food/laboratory-methods/bam-media-m165-tryptone-yeast-extract-agar) )

8. Aceite de parafina, estéril

9. Tampón de solución salina fosfato 0,02 M ( R61 (/food/laboratory-methods/bam-r61-002-m-phosphate-saline-buffer-ph-

73-74) ), que contiene NaCl al 1 %
10. Prueba de catalasa ( R12 (/food/laboratory-methods/bam-r12-catalase-test) )

C. Preparación de la muestra (ver BAM  Capítulo 1 (/food/laboratory-methods/bam-food-samplingpreparation-sample-homogenate)

).
D. Aislamiento y enumeración de S . aureus

1. Para cada dilución que vaya a sembrarse en placas, transfiera asépticamente 1 ml de suspensión de muestra a 3 placas de agar
de Baird-Parker, distribuyendo 1 ml de inóculo equitativamente en 3 placas (p. ej., 0,4 ml, 0,3 ml y 0,3 ml). Esparza el
inóculo sobre la superficie de la placa de agar, utilizando una varilla de rayado de vidrio curvado estéril. Mantenga las placas
en posición vertical hasta que el agar absorba el inóculo (alrededor de 10 minutos en placas debidamente secas). Si el inóculo
no se adsorbe fácilmente, coloque las placas en posición vertical en la incubadora durante aproximadamente 1 hora. Invertir
las placas e incubar 45-48 h a 35-37°C. Seleccione placas que contengan de 20 a 200 colonias, a menos que solo las placas
con diluciones más bajas (>200 colonias) tengan colonias con la apariencia típica de S . aureo _ Colonias de S . aureusson
circulares, lisas, convexas, húmedas, de 2-3 mm de diámetro en placas despobladas, de color gris a negro azabache,
frecuentemente con un margen de color claro (blanquecino), rodeadas por una zona opaca y frecuentemente con una zona
exterior clara; las colonias tienen una consistencia mantecosa a gomosa cuando se tocan con la aguja de inoculación.
Ocasionalmente, en varios alimentos y productos lácteos, se pueden encontrar cepas no lipolíticas de apariencia similar,
excepto que no hay zonas opacas y claras circundantes. Las cepas aisladas de alimentos congelados o desecados que se han
almacenado durante períodos prolongados suelen desarrollar una coloración menos negra que las colonias típicas y pueden
tener una apariencia áspera y una textura seca.
2. Count and record colonies. If several types of colonies are observed which appear to be S. aureus on selected plates, count
number of colonies of each type and record counts separately. When plates of the lowest dilution contain <20 colonies, these
may be used. If plates containing >200 colonies have colonies with the typical appearance of S. aureus and typical colonies
do not appear at higher dilutions, use these plates for the enumeration of S. aureus, but do not count nontypical colonies.
Select > 1 colony of each type counted and test for coagulase production. Add number of colonies on triplicate plates
represented by colonies giving positive coagulase test and multiply by the sample dilution factor. Report this number as
number of S. aureus/g of food tested.

E. Coagulase test
Transfer suspect S. aureus colonies into small tubes containing 0.2-0.3 ml BHI broth and emulsify thoroughly. Inoculate agar slant
of suitable maintenance medium, e.g., TSA, with loopful of BHI suspension. Incubate BHI culture suspension and slants 18-24 h at
35-37°C. Retain slant cultures at room temperature for ancillary or repeat tests in case coagulase test results are questionable. Add
0.5 ml reconstituted coagulase plasma with EDTA (B-4, above) to the BHI culture and mix thoroughly. Incubate at 35-37°C and
examine periodically over 6 h period for clot formation. Only firm and complete clot that stays in place when tube is tilted or
inverted is considered positive for S. aureus. Partial clotting, formerly 2+ and 3+ coagulase reactions, must be tested further (4).
Test known positive and negative cultures simultaneously with suspect cultures of unknown coagulase activity. Stain all suspect
cultures with Gram reagent and observe microscopically. A latex agglutination test (AUREUS TESTTM, Trisum Corp., Taipei,
Taiwan) may be substituted for the coagulase test if a more rapid procedure is desired.
F. Ancillary tests
1. Catalase test. Use growth from TSA slant for catalase test on glass slide or spot plate, and illuminate properly to observe
production of gas bubbles.
2. Anaerobic utilization of glucose. Inoculate tube of carbohydrate fermentation medium containing glucose (0.5%).
Immediately inoculate each tube heavily with wire loop. Make certain inoculum reaches bottom of tube. Cover surface of agar
with layer of sterile paraffin oil at least 25 mm thick. Incubate 5 days at 35-37°C. Acid is produced anaerobically if indicator
changes to yellow throughout tube, indicating presence of S. aureus. Run controls simultaneously (positive and negative
cultures and medium controls).

3. Anaerobic utilization of mannitol. Repeat 2, above, using mannitol as carbohydrate in medium. S. aureus is usually positive
but some strains are negative. Run controls simultaneously.
4. Lysostaphin sensitivity. Transfer isolated colony from agar plate with inoculating loop to 0.2 ml phosphate-saline buffer, and
emulsify. Transfer half of suspended cells to another tube (13 × 100 mm) and mix with 0.1 ml phosphate-saline buffer as
control. Add 0.1 ml lysostaphin (dissolved in 0.02 M phosphate-saline buffer containing 1% NaCl) to original tube for
concentration of 25 µg lysostaphin/ml. Incubate both tubes at 35-37°C for not more than 2 h. If turbidity clears in test
mixture, test is considered positive. If clearing has not occurred in 2 h, test is negative. S. aureus is generally positive.
 5. Thermostable nuclease production. This test is claimed to be as specific as the coagulase test but less subjective, because it
involves a color change from blue to bright pink. It is not a substitute for the coagulase test but rather is a supportive test,
particularly for 2+ coagulase reactions. Prepare microslides by spreading 3 ml toluidine blue-deoxyribonucleic acid agar on
the surface of each microscope slide. When agar has solidified, cut 2 mm diameter wells (10-12 per slide) in agar and remove
agar plug by aspiration. Add about 0.01 ml of heated sample (15 min in boiling water bath) of broth cultures used for
coagulase test to well on prepared slide. Incubate slides in moist chamber 4 h at 35-37°C. Development of bright pink halo
extending at least 1 mm from periphery of well indicates a positive reaction.

G. Some typical characteristics of 2 species of staphylococci and the micrococci, which may be helpful in their identification, are
shown in Table 1.

Table 1. Typical characteristics of S. aureus, S. epidermidis, and micrococci(a)

Characteristic S. aureus S. epidermidis Micrococci

Catalase activity + + +

Coagulase production + - -

Thermonuclease production + - -

Lysostaphin sensitivity + + -

Anaerobic utilization of glucose + + -

mannitol + - -
a +, Most (90% or more) strains are positive; -, most (90% or more) strains are negative.

Most Probable Number Method for Staphylococcus spp.

The most probable number (MPN) method (2) is recommended for routine surveillance of products in which small numbers of S. aureus
are expected and in foods expected to contain a large population of competing species.

A. Equipment and materials--Same as for Direct Plate Count Method, above.

B. Media and reagents--Same as for Direct Plate Count Method, above. In addition: Trypticase (tryptic) soy broth (TSB) containing
10% NaCl and 1% sodium pyruvate (M154a).
C. Preparation of sample--Same as for Direct Plate Count Method, above.
D. Determination of MPN
Inoculate 3 tubes of TSB containing 10% NaCl and 1% sodium pyruvate (B, above) with 1 ml portions of decimal dilutions of each
sample. Highest dilution must give negative endpoint. Incubate tubes 48 ± 2 h at 35-37°C. Using 3 mm loop, transfer 1 loopful
from each tube showing growth (turbidity) to plate of Baird-Parker medium with properly dried surface. Vortex-mix tubes before
streaking if growth is visible only on bottom or sides of tubes. Streak inoculum to obtain isolated colonies. Incubate plates 48 h at
35-37°C. From each plate showing growth, transfer at least 1 colony suspected to be S. aureus to BHI broth (see D and E of Direct
Plate Count Method, above). Continue procedure for identification and confirmation of S. aureus (E and F, Direct Plate Count,
above). Report S. aureus/g as MPN/g, according to tables in Appendix 2, MPN Determination (/food/laboratory-methods/bam-
appendix-2-most-probable-number-serial-dilutions).

References
1. AOAC INTERNATIONAL. 1995. Official Methods of Analysis, 16th ed., sec. 975.55. AOAC INTERNATIONAL, Arlington, VA.

2. AOAC INTERNATIONAL. 1995. Official Methods of Analysis, 16th ed., sec. 987.09. AOAC INTERNATIONAL, Arlington, VA.
3. Bennett, R.W., M. Yeterian, W. Smith, C.M. Coles, M. Sassaman, and F.D. McClure. 1986. Staphylococcus aureus identification
characteristics and enterotoxigenicity. J. Food Sci. 51:1337-1339.

4. Sperber, WH y SR Tatini. 1975. Interpretación de la prueba de coagulasa en tubo para la identificación de Staphylococcus aureus .
aplicación Microbiol. 29 :502-505.

Fuente de hipertexto: Manual Analítico Bacteriológico, 8ª Edición, Revisión A, 1998. Capítulo 12.