La via
alternativa, mas primitiva evolutivamente hablando, se
activa espontaneamente por las paredes celulares de ciertos microorganismos (en ausencia de
anticuerpos unidos a
estos) y constituye una respuesta innata inespecffica inmediata. La via de las lectinas, que se activa
de manera innata inducida tras la sfntesis de una protefna capaz de unirse
a azucares de hongos y bacterias (Ia MBL, tabla 7.7). La via
c1asica, mas reciente evolutivamente, que se activa por
anticuerpos unidos a pat6genos, 10 que implica una respuesta adaptativa.
Electroforesis de suero humano. Banda de Gamma globulina
Es posible realizar una medición semi-cuantitativa de las bandas a través de un scanner
densitómetro que mide el grosor de la banda electroforética y gracias a un software en donde se
ingresa el valor de las proteínas totales en el suero analizado (rango normal entre 6,5 a 8 g/dl) se
realiza un cálculo matemático que entrega un valor aproximado de cada banda electroforética.
La electroforesis de proteínas en suero en gel de agarosa clásicamente muestra 5 bandas proteicas:
albúmina, fracción α1-globulinas, fracción α2-globulinas, fracción β-globulinas y fracción g-
globulinas.
Región g: clásicamente encontramos a las inmunoglobulinas (IgG, IgA, IgM, IgD e IgE), sin
embargo en algunas ocasiones pueden migrar a la región β (sobre todo IgA). Se pueden observar
disminuidas globalmente en inmunodeficiencias humorales o aumentadas en forma policlonal en
inflamación crónica tal como ocurre en enfermedades autoinmunes, VIH entre otras.
Actualmente la observación de un único peak estrecho en la región gamma de la electroforesis en
suero permite sospechar un aumento monoclonal de gammaglobulinas (paraproteina). Este hallazgo
corresponde a proteínas electroforéticamente y antigénicamente homogéneas, producidas por un
único clon de linfocito B/célula plasmática; que ha proliferado más allá de los mecanismos de
control
Métodos inespecíficos para la purificación de Ac
Purificación con ácido caprílico [3,4].
Fundamento:
El ácido caprílico bajo condiciones medianamente ácidas
precipita la mayoría de las proteínas plasmáticas no
inmunoglobulínicas, básicamente la albúmina, con
excepción de la fracción de las Igs. Morais y Massaldi (2012) reportaron que el efecto del
ácido caprílico es una interacción directa, a través de sitios específicos, con la proteína que
precipita, generando así una superficie altamente hidrofóbica en la proteína, produciendo un
aumento de la interacción proteína-proteína, causando asociación y precipitación de los
complejos macromoleculares.
Por medio de esta técnica se obtienen moléculas de IgG de alta pureza.
Para aumentar la eficiencia de la purificación, es necesario acoplar otros pasos de
purificación, por ejemplo una cromatografía de afinidad o precipitación con sulfato de
amonio. También se ha descrito para precipitar otras inmunoglobulinas dependiendo dela
concentración utilizada.
Cromatografia de adsorción (Adsorción tiofílica) [5, 6]
Fundamento:
La columna está constituida por esferas de agarosa químicamente unidas a 2-
mercaptoetanol que a su vez presentan una unión con grupos divinilsulfona activados,
los cuales presentan elevada afinidad por las inmunoglobulinas, esta unión es llamada
adsorción tiofílica, la cual es dependiente de la fuerza iónica promovida por sales no
caotrópicas (sales que atraen moléculas de agua y quitan la capa de solvatación de otras
moléculas).
Durante la elución se va siguiendo la absorbancia a 280nm de las fracciones recolectadas
hasta la disminución de la absorbancia.
Generalmente esta cromatografía es utilizada para purificar IgY en buena cantidad,
preservando la funcionalidad y características de estos anticuerpos. (también para IgM, IgE
e IgG).
Purificación por membrana (Ultrafiltración y microfiltración) [7].
No involucran cambios de fases o adición de productos químicos. Estas características
minimizan la desnaturalización, desactivación y/o degradación de anticuerpos, además los
costos de operación y mantenimiento son bajos.
Dentro de las separaciones por membranas se encuentran la ultrafiltración y microfiltración
que comúnmente son utilizadas para la recuperación, concentración y purificación de
anticuerpos monoclonales o proteínas glicosiladas producidas por cultivos celulares de
origen animal. Las IgG tienen un coeficiente de sedimentación de 7s y las IGm de 19s
Cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) [8, 9]
Fundamento:
Las proteínas se unen reversiblemente a ligandos hidrofóbicos que se encuentran
inmovilizados en el soporte cromatográfico, debido a la presencia de una elevada
concentración de sal. La elución se logra disminuyendo la fuerza iónica en la fase móvil,
formando un gradiente decreciente
Cromatografía de afinidad en metales inmovilizados [10, 11]
Fundamento:
Los ligandos como iminodiacetato o N,N,N’-
tris(carboximetil)-etilendiamina. Entre otros, son
inmovilizados en un soporte inerte (celulosa,
agarosa) los iones divalentes de metales de
transición (Cu2+. Zn2+, Ni2+, Co2+ y Fe2+),
pueden formar complejos de coordinación con ellos
para formar quelatos polidentados. Los sitios de
coordinación libres son ocupados provisionalmente
por moléculas de agua, las cuales son fácilmente
desplazadas por donadores de electrones como los
grupos imidazol, indol y tiol de His, Trp y Cys, presentes en las superficies de las proteínas
interaccionando con el metal inmovilizado. La IgG de mamíferos es una de las pocas
proteínas abundantes en el suero que poseen grupos de histidina capaz de unirse al níquel
inmovilizado.
BIBLIOGRAFÍA
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Carnet de vacunación [1]
Vacuna Vía de administración Adyuvante Formulación Temporada de
vacunación
BCG IM (B.D.) Bacterias vivas atenuadas Nacimiento
(bacilos de Calmette y
Guérin (Mycobacterium
bovis)).
Hepatitis B IM ASO4 Antígeno de superficie de Nacimiento, 2 y 6
≤18 meses de edad: M.I. la hepatitis B (proteína) meses
≥18 meses B.D.
Pentavalente acelular IM Toxoide diftérico, toxoide 2, 4, 6 y 18 meses
(DPaT+VIP+Hib) ≤18 meses de edad: M.D. tetánico, toxoide pertússico
≥18 meses B.I. (contra la Tos ferina), virus
inactivados de la
poliomelitis tipos I, II y III
y proteína de Haemophilus
influenzae tipo b
Rotavirus Oral Monovalente: un serotipo 2,4 y 6 meses
del virus vivos atenuados.
Tiene CaCO3. 2 y 4 meses.
Pentavalente: 5 serotipos
de virus vivos atenuados
Neumococo IM Polisacáridos de la bacteria 2, 4 y 12 meses
conjugada M.D. de 10 a 13 serotipos
Influenza I.M. Partículas del virus de la 6 y 7 meses, 2, 3, 4 y
influenza 5 años
SRP (triple viral: IM-B.I. Virus vivos atenuados 12 meses y 6 años
sarampión, rubéola y refuerzo
parotiditis)
DPT (refuerzo) IM-B.I. Toxoide diftérico, tetánico 4 años
y proteína de Bordetella
pertussis (Tos ferina)
OPV (poliomelitis Oral CONTIENE UN Virus vivos atenuados Niño@s de 6 meses
tipo Sabin) ESTABILIZADOR (debilitados), contiene los hasta 5 años
Ag de los virus tipo I, II y
III de la poliomelitis
VPH IM-B.I. Hidroxifosfato partículas no infecciosas 11 años o 5° de
sulfato de aluminio similares al VPH. primaria y a los 6
amorfo (AAHS) meses después de la
primer dosis.
Td (tétanos, difteria) IM-B.I. Toxoide tetánico de 15 años y cada 10
Clostridium tetani y años, embarazadas,
diftérico de trabajadores de la
Corynebacterium salud, de áreas
diphterae. rurales, deportistas
SR (sarampión, IM-B.I. Virus vivos atenuados de A los 11 años que no
rubeola) (doble viral) sarampión, preparados en cuenten con dosisi de
células humanas o en SRP o SR
células de embrión de
pollo y virus atenuados de
rubéola, preparados en
células humanas.
Antihepatitis B IM 11 años que no
cuenten con
antecedente vacunal
Tdpa (tétanos, IM-B.I. Toxoide diftérico, tetánico Embarazadas de 20
difteria, pertussis y fracción acelular de a 32 semanas de
acelular). Refuerzo Pertussis gestación
Antiinfluenza IM-B.I. Partículas del virus de la Población entre 19-
influenza 59 años con factores
de riesgo. Todos los
de 60 años o más
Antineumocócica Polisacárido de la bacteria 60-64 años con
polivalente (23 serotipos) factores de riesgo.
(infecciones por Todos los de 65
neumococo) años.
Varicela IM-B.I.
Hepatitis A IM VIROSOMAS
≤18 meses de edad: M.I.
≥18 meses: B.I.
I.M.= intramuscular
M.D.= muslo derecho
M.I.=muslo izquierdo
B.D.=brazo derecho
B.I= brazo izquierdo
Virus atenuados:
Cepa de virus cuya virulencia ha sido reducida por procesos físicos o químicos, o por paso repetido
a través de las células de otras especies. El virus no produce ningún tipo de lesión en el animal, pero
sigue teniendo la capacidad de replicarse o multiplicarse lo suficiente para que el sistema inmune
pueda procesarlo.
Ventajas: respuesta inmune superior a las vacunas inactivadas Desventajas: la atenuación puede no
ser estable y puede revertir a las formas virulentas. Necesita cadena de frío permanente.
Virus inactivados/vacunas inactivadas: virus “muertos” o microrganismos muertos por medio de
químicos, calor o radiación.
¿Por qué la vía oral no es buena vía para inmunizar?
¿Por qué la vacuna OPV (vacuna oral de la polio trivalente) su vía de administración es oral?
[2]
Antes de responder la pregunta debemos saber que el poliovirus silvestre entra en el organismo por
la boca, transportado en el agua o alimentos contaminados con materia fecal de una persona
infectada. Los virus se multiplican en el intestino y se excretan con las heces, a través de las cuales
se pueden transmitir a otras personas.
La vacuna OPV se administra oralmente debido a su capacidad única de inducir inmunidad
intestinal y local, es decir, de interrumpir efectivamente la transmisión del poliovirus al medio
ambiente. En el caso de la IPV (vacuna de la polio inactivada), la cual es intramuscular, la vacuna
antipoliomielítica con virus inactivados, induce niveles muy bajos de inmunidad al poliovirus en el
interior del intestino y, por consiguiente, si bien confiere protección frente a la poliomielitis a la
persona en cuestión, no puede impedir la propagación del poliovirus silvestre, a diferencia de la
OPV.
Superantígeno: molécula bacteriana o vírica
capaces de reaccionar con moléculas del MHC
clase II y con el TCR (unión externa de estos
dos receptores) de un mismo individuo
provocando una activación inespecífica de
linfocitos T. Ejemplos: enterotoxinas
estafilocócicas, toxina del síndrome de choque
tóxico, toxina de la dermatitis exfoliativa,
exotoxinas pirógenas estreptocócicas.
Adyuvante: sustancias o preparados químicos
que incrementan o potencian en forma
específica la respuesta inmune [3] tanto a nivel
celular como humoral.
Se utilizan en vacunas basadas en antígenos purificados, sintéticos, recombinantes (o bacterias
muertas) que son más específicos pero menos inmunogénicos. Con su empleo se logra una
economía de antígeno (menor cantidad de antígeno) y de tiempo, así como un mayor nivel de
anticuerpos específicos.
El mecanismo de acción de los adyuvantes se puede considerar bajo distintas características:
Retraso de la liberación del antígeno: actúan como reservorio antigénico de duración
prolongada en el sitio de inoculación y lo concentran. Esto conlleva una respuesta
inmunitaria de mayor intensidad. Ejemplo: Al(OH) 3, Freund.
Conversión de un Ag soluble en uno particulado.
La micobacteria en el adyuvante completo de Freund estimula la respuesta inmune celular
antimicobacteriana, la producción de citosinas, la atracción, acumulación y activación de
macrófagos, el procesamiento de Ag y la producción de Ac por parte de los LcB.
Todos los adyuvantes activan o estimulan los macrófagos; éstos cuando son activados
estimulan la respuesta inmune por un incremento de la cantidad de antígeno expresado en la
membrana celular y de la eficiencia de su presentación a los linfocitos. El macrófago
también libera factores solubles estimulantes, que amplifican la proliferación de los
linfocitos. Por otro lado, algunos adyuvantes poseen la capacidad de actuar específicamente
sobre los linfocitos. [4]
El hidróxido de aluminio tiene un punto isoeléctrico de 11.1 y, por tanto, está cargado
positivamente en las condiciones biológicas, por lo que puede adsorber proteínas cargadas
negativamente y adsorber débilmente las proteínas básicas. El grado de adsorción depende
de la naturaleza y concentración del antígeno, de la presencia de sales e iones bufferantes y
del pH de la mezcla resultante. Las fuerzas de atracción electrostáticas y las interacciones
hidrofóbicas son las responsables de la adsorción de los antígenos a los adyuvantes que
contienen aluminio, pero probablemente las fuerzas de Van der Waals y los enlaces de
hidrógenos también
contribuyan a la adsorción en
estos sistemas; sin embargo, se
ha señalado que el alumbre
puede inducir anticuerpos de la
clase IgE, así como reacciones
alérgicas. Según las
regulaciones de la FDA, son
permisibles cantidades no
mayores de 0,85 mg de
aluminio por dosis de vacuna.
Una clasificación basada en el
mecanismo de acción es la propuesta
por Schijns, quien los categoriza en:
a) facilitadores de la señal 1
(presentación de antígenos);
2) facilitadores de la señal 2
(coestimulación), y 3) facilitadores de la señal 3 (polarización a Th1/Th2). [5]
La inmunidad innata está directamente relacionada con la estimulación de una respuesta inmune
antígeno-específica. Diversos adyuvantes contienen componentes microbianos (PAMP) que se unen
a TLR de membrana o NLR citosólicos en las CPA (señal 0), o pueden producir citólisis en el sitio
de inoculación liberando moléculas endógenas (DAMP, del inglés: Danger-Associated Molecular
Patterns) que también se unen a los TLR y NLR, conllevando a la activación de las CPA. Otros
adyuvantes favorecen la presentación antigénica (señal 1) mediante el efecto depósito con
reclutamiento de células dendríticas para su traslado a los linfonodos regionales. La activación de
las CPA favorece la expresión de moléculas coestimuladoras de membrana o liberación de
mediadores solubles (citocinas) que participan en la activación de los linfocitos T inactivados o Th0
(señal 2). Los linfocitos T, una vez activados, pueden polarizarse hacia un patrón que puede ser:
Th1, Th2, Th9, TfH, Th17, Th22 o Treg, y en esto el tipo de adyuvante es determinante.
Estimulación de la señal 1 (presentación de antígenos): Adyuvantes que estimulan a los
linfocitos por la presentación antigénica en los ganglios linfáticos regionales, por medio de las
células presentadoras de antígeno (fundamentalmente las células dendríticas). Estos adyuvantes
tienen un efecto de depósito y una lenta y prolongada liberación de antígenos y reclutan CPA en el
sitio de inoculación. Ejemplos: geles de aluminio, emulsiones oleosas.
Estimulación de la señal 2 (coestimulación): Varios adyuvantes como el LPS de bacterias G (-)
estimulan las células de la inmunidad innata (CPA), induciendo la liberación de citocinas
proinflamatorias y otros mediadores que favorecen la respuesta inmune. Ejemplos: saponinas,
emulsiones, Al(OH)3.
Estimulación de la señal 3 (polarización a Th1/Th2): se activan los linfocitos T a través de las
células de la inmunidad innata, polarizando la respuesta inmune hacía un patrón Th1, Th2, Th9,
TfH, Th17, Th22 o Treg, determinado por el perfil de citosinas que liberen y otros factores. Esta
polarización depende de: antígeno, vía de inoculación y el adyuvante empleado. Ejemplos: hifas de
Candida albicans y Al(OH)3-Th2, monofosforil lípido A del LPS de Salmonella minessota y
proteoliposomas de Neisseria meningitidis B Th1
Composición [6, 7]:
Sales minerales: Al(OH)3, AlPO4, Ca3(PO4)2
Emulsiones: aceite de parafina y micobacterias muertas (Freund), escualeno y treonil-MDP.
Liposomas: vesículas de origen bacteriano con proteínas virales
Virosomas: vesículas con proteínas virales. Se fusionan con las células del sistema inmune,
liberando su contenido. Imita la forma de presentación del antígeno y estimula la vía
humoral y celular, al liberar los Ag en las dianas específicas y amplificar la respuesta
inmune.
Micropartículas de polímeros como el poliéster polilactide-co-glicosides (PGL)
Partículas virus like: cápsides vacías de un virus, contienen epitopos de otros virus o
bacterias
Adyuvantes tensoactivos: saponinas (glicósidos tensoactivos derivados de Quillaria
Saponaria (Quil A))
Derivados de bacterias: muramil dipéptido, DNA bacteriano (CpG), LPS. Monofosforil
lípido (MPL), lipopéptidos
Bromuro de dimetil dioctadecil amonio (DDA)
Microesferas de polímeros biodegradables
Toxina colérica, tóxina lábil de E. coli mutantes para inmunización en mucosas
Citocinas: IL-2, IL-12, INF-ɣ
Genes que codifican moléculas coestimuladoras
Aspectos a considerar para obtener una buena respuesta inmunológica [8, 9]:
-Proceso:
Frecuencia y periodicidad entre dosis. La mayoría de las veces sólo se logra una respuesta
adecuada llevando a cabo más de un estímulo antigénico, asegurando así que se obtendrán
títulos altos de Ac o el número deseado de células específicas estimuladas.
Vía de administración, generalmente la vía oral no es muy buena para la inmunización, la
que se recomienda es la intramuscular. Si la vía de administración fuese oral considerar las
condiciones ácidas del estómago para que el antígeno mantenga sus características físicas y
químicas.
Para la inyección intradérmica, el volumen no debe superar los 100 µL por punto. La
inyección intraperitoneal principalmente es para administrar volúmenes relativamente
grandes de sustancias solubles
-Antígeno:
Inmunogenicidad, si es poco inmunogénico considerar el uso de adyuvantes
Estado físico del antígeno. Si es particulado o soluble debe tenerse en cuenta para escoger
la ruta de inmunización; los Ag particulados por lo general son introducidos por vía
intravenosa, mientras que los Ag en solución pueden introducirse IM, IP, subcutánea o ID.
Dosis. Va a depender del tipo de animal, el título de anticuerpos que queremos obtener y
del tipo de antígeno que se trate.
-Animal:
Edad. Tener en cuenta que los animales con pocos días de nacidos aún no desarrollan su
sistema inmune al máximo; los animales jóvenes o adultos muestran ya un sistema inmune
más desarrollado.
Tipo de animal de experimentación, ya que la zona para inyectar el antígeno
intradérmicamente es diferente para conejos y ratones, para los primeros se aplica en el
lomo y para los ratones en el cojinete plantar, para inyectar intravenosomante en conejos es
por medio de la vena de la oreja y para los ratones por la vena caudal.
Tamaño. El inóculo para animales grandes como el conejo es mayor que en cobayos o
ratones.
Sexo. Los animales hembras al presentar ciclo menstrual, los efectos del antígeno al
inmunizarlas son menos predecible, sus hormonas actúan como inmunosupresores.
Genética. Si no se quiere tener como variable el factor genético en el proceso de
inmunización lo recomendable es utilizar animales singénicos, si esto no es así, se utilizan
animales alogénicos. .
Prueba de ensayo y error: método en dónde si para un problema hay una serie de posibles
hipótesis y sólo una o unas cuantas son correctas, se ensaya o se prueba cada hipótesis hasta llegar a
la acertada u obtener los resultados esperados.
En el caso de los esquemas de inmunización, se le aplica el antígeno al animal por una vía y se
evalúa la respuesta, si esta no es la deseada, se intenta por otra vía hasta obtener resultados
deseables.
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Bioprocesos. IPN-UPIBI. 2008. Pp. 8-9.
Determinación de células formadoras de anticuerpos
-Método directo
El método se basa en que algunas células linfoides liberarán anticuerpos que se difundirán en el
agar y se unirán con los GRC al colocar las células linfoides de un animal inmunizado con GRC, al
mismo tiempo que una
población densa de GRC
heterólogos en un medio de
gel, posteriormente se provoca
la lisis aquellos eritrocitos que
únicamente reaccionaron con
los anticuerpos, al agregar
complemento proveniente de
suero de cobayo, formando
una placa de lisis, la cual
representará una CFA.
-Método de Cuningham
(modificación del método de Jerne) [1]
Las células de un animal inmunizado con eritrocitos de carnero se suspenden junto con un exceso
de GRC y complemento dentro de una cámara poco profunda formada entre dos portaobjetos. Con
la incubación, las CFA liberan su inmunoglobulina, que recubre los eritrocitos circundantes. El
complemento causará la lisis de las células recubiertas por los anticuerpos y se observa como una
placa clara de glóbulos rojos alrededor de cada célula formadora de anticuerpo. Las placas directas
obtenidas de este modo revelan las células productoras de IgM, ya que este anticuerpo tiene una alta
eficiencia hemolítica.
Método de Cuningham
Ventajas Desventajas
Más sensible que la directa descrita por Jener: Cuantifica solo CFA que producen anticuerpos
visualización de placas con diámetro de 30- de clase IgM.
40µm La capacidad de la microcámara puede variar
Rápida: solo se incuba una vez a 37°C por 1h. (depende del grosor de la cinta con doble
Se coloca al mismo tiempo los GRC, células del adhesivo).
animal inmunizado y el complemento.
-Método indirecto [1]
Las IgG son menos eficientes en la activación del complemento. Para demostrar las células que
sintetizan IgG es necesario incrementar la unión del complemento del complejo eritrocito-
anticuerpo IgG mediante el agregado de suero de conejo anti-IgG al sistema.
Las placas indirectas así desarrolladas pueden utilizarse para cuantificar las células que elaboran
anticuerpos de diferentes subclases de inmunoglobulina, siempre que se disponga del antisuero de
conejo adecuado.
Las placas obtenidas por los métodos directo e indirecto dan el número de placas IgG.
Cuantificación de CFA contra antígenos que no sean eritrocitos de carnero por una técnica de
hemólisis en gel. [2]
Si se desea determinar el número de CFA contra otros antígenos que no sean eritrocitos, es
necesario conjugar o sensibilizar a la membrana del GRC con el antígeno en cuestión, por ejemplo:
ovoalbúmina o albúmina humana. Se utilizan GRC como soporte ya que son fáciles de obtener, de
mantenerse en el laboratorio y estandarizarse.
En el caso de antígenos de bajo peso molecular se utilizan métodos químicos apropiados para
establecer enlaces covalentes que unan tales antígenos con los grupos químicos de la membrana del
eritrocito. Casi todos los polisacáridos se absorben espontáneamente y las proteínas se pueden unir
a través de enlaces químicos usando carbodimida, glutaraldehído o bencidina bis-diazotizada o por
tratamiento previo del ertotrocito con ácido tánico o con cloruro de cromo.
Ácido tánico.
Se le adiciona al paquete de eritrocitos solución de ácido tánico, se incuba 10 minutos a
37°C. Se lava y se le adiciona el antígeno a cierto volumen de los eritrocitos previamente
tratados, y se incuba 10 min a temperatura ambiente, se centrifuga y vuelve a lavar.
BIBLIOGRAFÍA
1. Iván. M. R. Inmunología. Fundamentos. 11ª edición. Medica Panamericana. Buenos Aires,
2008. Pp. 159.
2. Manual del curso práctico de Inmunología. IPN-ENCB. Departamento de Inmunología.
México, 2015. Pp. 77, 113-116.
Reacciones de precipitación
Complejo inmune: Interacción de un antígeno polivalente y un anticuerpo específico. Estos
complejos también pueden contener fragmentos del complemento. [1]
¿Cómo se forma? [1]
Los inmunocomplejos se forman siempre que tiene lugar una respuesta inmune frente a antígenos
solubles. Estos complejos están unidos no covalentemente con el antígeno contra el cual va dirigido.
Las zonas de unión al antígeno de muchos anticuerpos son superficies planas que pueden
acomodar epítopos tridimensionales de macromoléculas, lo que permite a los anticuerpos
unirse a macromoléculas grandes (v. fig. 5-6). Los seis CDR, tres de la cadena pesada y tres de
la cadena ligera, se extienden para formar u n a superficie ancha. Superficies de unión anchas
análogas son características de las zonas de unión de los receptores para el linfocito T. Por el
contrario, las moléculas del MHC contienen hendiduras de unión al antígeno que alojan a
péptidos pequeños. En algunos anticuerpos específicos frente a moléculas pequeñas, como
monosacáridos y fármacos, el antígeno se u n e en u n a hendidura generada por la aposición
de los CDR de los dominios Vl y Vh. El reconocimiento del antígeno p o r el anticuerpo implica
una unión no covalente y reversible. Varios tipos de interacciones no covalentes pueden
contribuir a la unión del anticuerpo al antígeno, como las fuerzas electrostáticas, los enlaces de
hidrógeno, las fuerzas de van der Waals y las interacciones hidrófobas. La importan d a relativa
de cada uno de ellos depende de las estructuras de la zona de unión de cada anticuerpo y del
determinante antigénico. La fuerza de la unión entre u n a sola zona combinatoria de un
anticuerpo y un epítopo de u n antígeno se llama a fin id a d del anticuerpo. La afinidad suele
representarse mediante u n a constante de disociación (Kd), que indica la facilidad con la
que se separa u n complejo antígeno-anticuerpo en sus constituyentes. Una Kd pequeña indica
una afinidad más fuerte o mayor en la interacción, porque es necesaria u n a concentración
menor de antígeno y de anticuerpo para que se forme el complejo.
Como la región bisagra de los anticuerpos les aporta flexibilidad, u n solo anticuerpo puede
unirse a un solo antígeno multivalente a través de más de u n lugar de unión. Para la IgG o la IgE,
esta unión puede afectar, como mucho, a dos lugares de unión, u n o en cada Fab. Para la IgM
pentamérica, sin embargo, u n solo anticuerpo puede unirse hasta a 1 0 lugares diferentes. Los
antígenos polivalentes tendrán más de u n a copia de u n determinante particular. La fuerza de la
unión del anticuerpo con el antígeno deberá tener en cuenta la unió n de todos estos lugares a
todos los epítopos disponibles. Esta fuerza global de la unió n se llama avidez, y es mucho
mayor que la afinidad de cualquier lugar de unión al antígeno aislado. De este modo, una molécula
de IgM de afinidad baja puede unirse aun fuertemente a u n antígeno polivalente debido a que
muchas interacciones de afinidad baja (hasta 10 por molécula de IgM) pueden producir una
interacción con avidez elevada.
-Zona de exceso de Ac: Hay mayor cantidad de Ac que de Ag, de manera que las moléculas de Ac
libres desplazan al Ac unido de los determinantes antigénicos.
-Zona de equivalencia: el Ag y Ac forman una red extensamente entrelazada de moléculas unidas
tal que la mayor parte de todas las moléculas de Ag y de Ac se unen en grandes masas.
-Zona de exceso de Ag: Hay mayor concentración de antígeno y los inmunocomplejos pueden
disociarse, de manera que las moléculas de antígeno libres desplazan al Ag unido al Ac.
Explicación de Inmunoelectroforesisi unidimensional [2]
Es una combinación de una electroforesis en geles de agarosa seguida de una inmunodifusión. En la
primera parte, se realiza una
aplicación puntual de la muestra, por
lo que al final las distintas proteínas
estarán distribuidas a lo largo del gel
según el eje de migración. Acabada la
electroforesis, y sin efectuar la
tinción, se practica en el gel un canal
(“trinchera”) paralelo a la dirección de migración con un bisturí de doble hoja (la separación de las
hojas determina la anchura de la trinchera) en el que se deposita un antisuero que contenga
anticuerpos específicos frente a una o varias de las proteínas separadas en la electroforesis.
De 24-48 H a 20 o 22°C, los anticuerpos y las proteínas (que actúan como antígenos) difunden, y si
se encuentran en la proporción adecuada, producen complejos antígeno-anticuerpo insolubles que
precipitan y aparecen en el gel como bandas elipsoidales.
Una vez formadas las bandas de precipitación, el gel puede lavarse para eliminar las proteínas que
no hayan inmunoprecipitado y se puede teñir. Cada proteína de la muestra produce una banda de
precipitación independiente, por lo que es posible identificar el número de constituyentes de la
muestra que son reconocidos por los anticuerpos.
Explicación de electroforesis bidimensional
Se separan los Ag del espécimen por electroforesis en una dirección. Después se corta el gel, con
los Ag ya separados y se coloca en un
medio de soporte que contenga una mezcla
de Ac contra dichos Ag. A continuación se
realiza la segunda electroforesis en la
dirección que forme un ángulo recto con la
primera. Cuando se produce la reacción Ag-
Ac los complejos que se forman precipitan
y aparecen unas líneas de precipitación en
forma de arco.
Esta técnica tiene mayor resolución que la
IE. Los resultados se pueden interpretar desde un punto de vista cuali o cuantitativo (el área del arco
de precipitación es directamente proporcional a la concentración del constituyente).
BIBLIOGRAFÍA
1. ABUL, K. A., et al. Inmunología celular y molecular. 7ª edición. Elsevier. España, 2012. Pp. 101-102.
2. Métodos físico-químicos en Biotecnplogía. UNAM. 2006. Pp. 13-15 Disponible en
http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/plataformas_de_proteomica.pdf Consultado [28/03/2016].
