Obtención de anticuerpos monoclonales: (técnica de hibridomas).

Usamos linfocitos B de un animal

previamente inmunizado con el antígeno de interés + una celula maligna (celula de mieloma, capaces de
crecer en cultivo xq son células tumorales).
- Fusionamos los linfocitos B y la celula de mieloma con ETILENGLICOL y formamos el HÍBRIDO.
- Los hibridos se seleccionan en un medio HAT:
HIPOXANTINA Y TIMINA: precursores de las vías alternativas de ácidos nucleicos.
AMINOPTERINA: inhibidor que bloquea la ruta normal de biosíntesis de nucleótidos.
Uso el medio HAT para desechar las células que no hibridaron y seleccionar las que sí.
- Las células deben usar una ruta paralela para poder sintetizar sus ácidos nucleicos y para esto utilizan
la enzima HGPRT. Las células del mieloma son defectuosas en esta enzima (HGPRT -) y son no secretoras de
anticuerpos, en cambio los linfocitos B son HGPRT + y secretores de anticuerpos.
Los hibridos linfocito B-linfocito B, celula de mieloma-celula de mieloma son incapaces de crecer en este
medio debido a la aminopterina. Solo los hibridos linfocito B-celula de mieloma puede hacerlo,ya que las
células B son las que pueden, utilizando la enzima HGPRT, sintetizar nucleótidos por una via paralela a la
bloqueada por la aminopterina y por la capacidad de crecimiento en cultivo de las células de mieloma.
- Luego de seleccionar las células, las aislamos en un caldo de cultivo o capsula (donde suponemos que
hay una única celula) para que generen clones que generen anticuerpos específicos para el antígeno de
interés.
- Con las capsulas positivas se hace una dilución, de manera de asegurarnos de tener una alícuota con
un solo hibridoma o ninguna.
- Luego esta alícuota se siembra en otra capsula.
- Propagamos el cultivo en un medio adecuado para que crezca.
ESTE PROCEDIMIENTO NOS ASEGURA QUE LA PRODUCCION DE ANTICUERPOS DERIVA DE UNA SOLA
CELULA B, TENEMOS ANTICUERPOS CONTRA UN SOLO ANTIGENO.

ENSAYOS INMUNOQUIMICOS
- Precipitación y aglutinación:
Precipitación: antígenos grandes y deben tener multiples determinantes antigénicos. Precipitación de
antígenos solubles por el anticuerpo especifico provoca turbidez y esta la podemos medir con un
espectrofotómetro. La precipitación es máxima cuando las cantidades de ambos son equivalentes, para
cantidades menores o mayores de antígeno la precipitación se reducen, al no poder formarse estos
complejos grandes que generan precipitación,
Aglutinacion: precipitación con antígenos más grandes como diferentes tipos de células, bacterias o
parasitos. Ej: determinación de grupo sanguíneo.
- Marcaje: mayor sensibilidad.
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RIA (radioinmunoensayo): anticuerpos o antígenos marcados con radioisótopos.
 SANDWICH de fase solida: para determinar la cantidad de un antígeno en una muestra podría utilizarlo.
- Microplaca que tiene unido covalentemente anticuerpos de determinada especificidad, que tiene
cubiertos los sitios desprovistos de anticuerpos con suero bobino o gelatina, para evitar uniones
inespecíficas de antígenos a la microplaca.
- Agregamos la muestra que contiene al antígeno a cuantificar.
- Enjuague para eliminar el antígeno no unido.
- Incubamos con un anticuerpo radiomarcado (2do anticuerpo, OTRA ESPECIE) específico para ese
antígeno. Se unirá al antígeno en un sitio distinto que al que se unió el primer anticuerpo.
- Lavamos para eliminar el exceso de segundo anticuerpo no unido.
- La cantidad presente de radioisótopo presente en la fase solida es una medida de la cantidad de
antígeno en la muestra.
- Para cuantificar la cantidad de antígeno en la muestra: CURVA DE CALIBRADO (PENDIENTE +): a distintos
pocillos de una microplaca que tiene fijado el anticuerpo especifico se le agregan distintas
concentraciones del antígeno, lavamos y agregamos el anticuerpo 2dario marcado con I125 en una
concentración FIJA para todos los pocillos. Incubamos y lavamos nuevamente. Medimos la radiactividad
en la fase solida. Graficamos radioactividad unida/total vs concentración de antígeno.
 PREGUNTA DEL FORO: En un método inmunológico, de tipo sandwich, donde va a emplear una
antigamaglobulina marcada para detectar, que consideraciones fundamentales debe tener en cuenta
para su correcta elección.

RTA: vamos a tener un anticuerpo primario fijado al soporte solido, un aticuerpo secundario que debe
unirse a un sitio diferente al antígeno que el anticuerpo primario y en este caso DEBER SER DE UNA
ESPECIE DIFERENTE AL ANTICUERPO PRIMARIO porque luego vamos a emplear una antigamaglobulina
marcada; la antigamaglobulina debe reconocer a los anticuerpos secundarios y no primarios.
En la figura el anticuerpo primario unido al soporte (DE CONEJO) fijado a la placa, luego el antígeno,
seguido se une el anticuerpo secundario (de raton) marcada con fluoroforo que fue obtenido en cabra.
El anticuerpo primario y el secundario son de diferentes especies y a su vez la antigamaglobulina debe ser
anti especie del secundario, por lo cual no es correcto decir que la antigamaglobulina es de la misma
especie que el anticuerpo secundario.
 INHIBICION COMPETITIVA: por ejemplo: medición de la cantidad de antígeno viral de la hepatitis B en
una muestra de suero.
- se une a la superficie del soporte el anticuerpo contra el antígeno del virus de la hepatitis B.
- bloqueamos la superficie libre del soporte con gelatina.
- Agregamos a los diferentes pocillos cantidades FIJAS Y CONOCIDAS del antígeno radiomarcado de la
hepatitis B, con cantidades variables y conocidas del antígeno sin marcar (antígeno frio).
- Incubo y lavo.
- Registro y grafico la cantidad de radiacion unida en los distintos soportes.
- Cuantificación: pocillos con anticuerpo unido se le agrega la muestra de suero incognita y la misma
cantidad de antígeno marcado y no marcado. Tanto el antígeno frio como el marcado tienen las mismas
posibilidades de unirse con el anticuerpo fijo. Parte del antígeno marcado quedara libre. Lavamos para
eliminar cantidad de antígeno marcado y frio no unido. Para cuantificar interpolamos la curva con el
valor de radioactividad obtenido de la relación antígeno unido vs antígeno libre. PENDIENTE -.

Curva: concentración de antígeno marcado unido/ concentración de antígeno marcado libre vs

concentración de antígeno no marcado.
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ELISA (ensayos inmunoenzimaticos ligado a enzimas): utiliza como marcador una enzima.

 HOMOGENEO: en los que el compuesto marcado se comporta de manera diferente cuando esta unido o no.
No se requiere la separación de la fracción ligada de la libre.
 HETEROGENEO: compuesto marcado se comporta de la misma forma, ya sea que esta unido o no. Si se
requiere la separación física de la fracción unida y libre antes de realizar la medición. Son los mas usados.
- Tipo sándwich: en fase sólida.
Cubrir la superficie de la microplaca con un anticuerpo con especificidad para el antígeno en estudio. Lavo
para eliminar exceso de anticuerpo no pegado a la placa. Agrego muestra con el antígeno en cuestión y
dejo reaccionar. Lavo para eliminar antígeno no unido. Adiciono un 2do anticuerpo conjugado con una
ENZIMA MARCADORA especifico para ese antígeno que se une en un sitio diferente al primer anticuerpo.
Lavo para eliminar exceso del complejo anticuerpo-enzima que no se haya unido al antígeno. Adiciono el
SUSTRATO para que se produzca la reacción enzimática.
Cuantifico la transformación del sustrato en producto mediante reacción calorimétrica.
ENZIMAS MAS UTILIZADAS: UREASA, FOSFATASA ALCALINA, PEROXIDASA.
Utilizo espectrofotómetro.

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INMUNOFLUORESCENCIA: marco con un fluoroforo (compuestos marcadores fluorescentes), están unidos

covalentemente ya sea a antígeno o anticuerpo. Deben ser estables.

 DIRECTOS: anticuerpos fluorescentes son reactivos citoquimicos que reaccionan con antígenos y luego
pueden ser identificados por microscopia de fluorescencia. Ej: se puede visualizar la presencia del virus de la
rabia en tejido cerebral de un animal con rabia, para ello fijamos tejido en un portaobjetos del microscopio,
luego cubro el portaobjeto con el anticuerpo fluorescente especifico para dicho virus, se incuba y el exceso
de anticuerpo no unido se elimina con lavado. Se examina con microscopio de fluorescencia.
 INDIRECTO: fijar un antígeno de interés a un portaobjetos. Se cubre el portaobjeto con el suero del paciente.
Si existen anticuerpos contra el antígeno habrá una unión especifica. Se lava y elimina el exceso de
anticuerpo no especifico q no se unio. Utilizo un segundo anticuerpo CONTRA EL SUERO DEL PACIENTE:
antigammaglobulina humana obtenida a partir del suero de una cabra o conejo, esta antigamaglobulina esta
acoplada al fluoroforo. Observación de fluorescencia: paciente posee anticuerpo contra ese antígeno.
SE PUEDEN DETECTAR CANTIDADES MAS PEQUEÑAS DE ANTIGENO.
 ESPECIFICIDAD ES LA MISMA ENTRE METODO DIRECTO E INDIRECTO, DEBIDO A QUE LA REACCION
ANTIGENO-ANTICUERPO ES DETERMINADA POR EL ANTICUERPO PRIMARIO.

INMUNOENSAYOS: característica más importante: sensibilidad, para utlizarla podemos usar sistemas de
amplificación:

- Proteína avidina se une con afinidad a la vitamina biotina. Cada molecula de avidina es capaz de unir 4
moleculas de biotina.
- Un anticuerpo marcado con biotina puede reaccionar con un antígeno ligado a un soporte, posteriormente
se agrega avidina marcada con una enzima o molecula fluorescente, para visualizar y amplificar la reacción.
- Otra variable es partiendo del antígeno inmovilizado en un soporte solido, se lo hace reaccionar con un
anticuerpo especifico, acoplado a biotina. Se agrega ESTREPTAVIDINA (semejante a la avidina) junto a
tetrámeros de biotina marcadas con una enzima o colorante fluorescente.
ENSAYOS QUIMIOLUMINISCENTES: ECLIA

Ensayo de electroquimioluminiscencia:

- Fase solida de estreptavidina, que puede acoplarse a toda molecula inmunológica biotiniladas (anticuerpos
monoclonales). El sistema de estreptavidina-biotina muy eficaz para la unión de anticuerpos. Gracias a la
fijación indirecta de los anticuerpos a la fase solida.
- Partículas paramagnéticas ofrecen una gran capacidad de inmovilización de antígenos o anticuerpos,
facilita una cinetica mas rápida de reaccion inmunológica.
- Principal componente de detección: CELDA DE LECTURA. Diseñada como una cámara de flujo y en ella se
dan 3 funciones escenciales durante varios segundos. Por medio de un iman las microparticulas
paramagnéticas cargadas con los inmunocomplejos se depositan en el electrodo de trabajo.
- Solución tampón del electrodo lava la fase solida, mientras el exceso de muestra de las fracciones libres
son arrastradas por el flujo del liquido, fuera de la celda de lectura.
- Se produce la separación de lo unido y lo libre.
- Aplico un voltaje para comenzar la reaccion.
- Un fotomultiplicador mide la emisión de luz generada.
- Se completa la reaccion, se elimina el iman del electrodo, liberándose asi las partículas paramagnéticas y
lavándose toda la celda.
- LA CANTIDAD DE FOTONES SON PROPORCIONALES A LA CANTIDAD DE ANTIGENO EN LA MUESTRA.

APLICACIONES: enfermedades tiroideas, marcadores tumorales, enfermedades cardiacas, anemias, alergias,

enfermedades virosicas, fertilidad, embarazo.

Objetivo: detección de pequeñas concentraciones de un analito o minimos cambios de este analito.

“baja concentracion”, no utilizo para medir en tejidos o dentro de la membrana.

Si tengo particula paramagnética NO ES ECLIA.

 SONDAS INTRACELULARES, INDICADORES FLUORESCENTES Y LUMINISCENTES

las propiedades de emisión de luz se han utilizado para la fabricación de sondas intracelulares, con
características fluorescentes y luminiscentes.

- Usando microelectrodos se puede conocer la concentración de un ion en una zona determinada de la

celula, cambios rapidos, milisegundos y cambios en el interior celular.
- Si el ion esta en muy baja concentración o si la variación de concentración es muy alta, ej cuando el calcio
interviene como 2do mensajero, las respuesta no son demasiado precisas.

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ELECTROFISIOLOGÍA CLASICA

- Estudiar voltajes y flujo de corriente en la membrana plasmática.

- Microelectrodos usados para medir concentraciones intracelulares de iones como H+, K+, Cl-, Ca 2+, Mg 2+.
- Cambios estables, de ph, cambio de concentraciones, células que bajo alguna patología que cambia la
concentración del ion por un largo tiempo. Si quiero evaluar cambios de pH, concentración.
-  En neurociencias, se incluyen las medidas de la actividad eléctrica de neuronas, y particularmente
actividad de potencial de acción

PATCH CLAMP

- para estudiar el transporte ionico a través de proteínas especializadas que forman canales ionicos,
contenidos en un pequeño parche o patch de membrana plasmática.
- Permite realizar estudios sobre los canales ionicos, permite estudiar el funcionamiento de una molecula
simple en tiempo real.
- Las investigaciones son los distintos tipos de canales contenidos en las membranas, incluyendo canales
ionicos dependiente de voltaje activados por receptores de hormonas, de neurotransmisores y activados
por segundos mensajeros intracelulares como el Ca 2+, AMP, GTP, etc.
- Medir pequeñas concentraciones ionicas.
- Cell attached: elección cuando el canal en cuestión requiere factores citosolico para su apertura. Se usa
para estudiar moléculas que actúen sobre la cara extracelular de la membrana.
- Inside out: permite cambiar fácilmente la solución del lado citosolico del parche. Método de elección
cuando se quiere estudiar la activación de segundos mensajeros intracelulares.
- Outside out: método de elección cuando se estudia el efecto de hormonas o neurotransmisores que
actúan del lado extracelular de la membrana.
- Whole cell: medir los efectos de las hormonas extracelulares, sobre todo en los canales de la celula del
mismo tipo que se encuentran en la membrana plasmática, pero manteniendo el ambiente celular natural.
Se pueden estudiar moléculas que actúen sobre la cara extracelular de la membrana.

Mide actividad de canales (pasaje de corriente), se debe esperar un tiempo.

La membrana tiene distintas cargas dentro y fuera de ella, si pasa un ion cambia la carga, esto mido con
patch clamp.
Lo uso para saber si entreo o salio un ion, nada mas.