REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR):

Amplificación la región ITS1-5.8S-ITS2 de Saccharomyces cerevisiae

GARCÍA., Karen; DIOSA., Cristina; RESTREPO., Juan
Facultad de Ciencias Básicas, Programa de Microbiología, Universidad Santiago de Cali.
Octubre del 2021.

RESUMEN

La práctica de laboratorio permitió la aplicación de la técnica de reacción en cadena de la polimerasa

o PCR, la cual posibilitó generar una gran cantidad de copias de un fragmento de DNA del espécimen
Saccharomyces cerevisiae. El requisito fundamental para poder llevar a cabo la reacción fue la
implementación de reactivos como fragmentos cortos de DNA de cadena sencilla complementarios a
los extremos del fragmento a amplificar; primers; Taq polimerasa, MgCl2 y agua. Asimismo, se
empleó el Termociclador como dispositivo fundamental para realizar los ciclos de temperaturas
necesarios para la amplificación de diversas hebras de ADN. De forma complementaria, se evidenció
por medio de electroforesis en un gel de agarosa al 1.5% los productos amplificados de 400 pb
aproximadamente y los controles positivos y negativos obtenidos.

PALABRAS CLAVES: PCR, primers, termociclador, ADN, electroforesis.

ABSTRACT

The laboratory practice found the application of the polymerase chain reaction or PCR technique,
which made it possible to generate a large number of copies of a DNA fragment of the Saccharomyces
cerevisiae specimen. The fundamental requirement to carry out a reaction was the implementation of
reagents such as short fragments of single-stranded DNA complementary to the ends of the fragment
to be amplified; primers; Taq polymerase, MgCl2 and water. Likewise, the Thermocycler was used as
a fundamental device to carry out the temperature cycles necessary for the amplification of various
DNA strands. In a complementary manner, the amplified products of approximately 400 bp and the
positive and negative controls obtained were evidenced by means of electrophoresis on a 1.5%
agarose gel.

KEYWORDS: PCR, primers, thermal cycler, DNA, electrophoresis.

INTRODUCCIÓN

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) presente en diferentes muestras biológicas,

es una técnica para la síntesis "in vitro" de obteniendo millones de copias de una
secuencias específicas de ADN. Es una forma determinada secuencia de ADN. En poco
simple y muy rápida de multiplicar el ADN tiempo esta técnica ha conseguido ser
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ampliamente utilizada no sólo en el campo de 2. Hibridación de los primers a la zona 3

la genética molecular, sino en otras muchas específica de cada una de las hebras.
ciencias. 3. Extensión del primer por acción de la
ADN polimerasa.
El inventor de esta técnica fue Kary Mullis por
la cual se le otorgó el Premio Nobel de En la primera etapa (desnaturalización) la
Química en 1993. Utilizó la PCR para la doble hélice de ADN se separa en dos hebras.
amplificación del gen de la b-globina humana Para ello se realiza una incubación de la
(Mullis y cols., 1986; Mullis y Faloona., 1987) muestra a altas temperaturas (93- 97ºC). La
y el diagnóstico prenatal de la anemia renaturalización se producirá cuando la
falciforme (Saiki y cols., 1985; Saiki y cols., temperatura disminuya.
1986; Embury y cols.1987), desde entonces la
PCR ha revolucionado todos los campos que En el segundo paso (hibridación) los cebadores
estudian y manipulan los ácidos nucleicos. se unen a las zonas 3´ complementarias que
Mullis se basó en la replicación del ADN en flanquean el fragmento que queremos
los organismos eucariotas realizada por la amplificar. Se realiza gracias a la bajada de la
ADN polimerasa. Estas enzimas realizan la temperatura (50-65ºC).
síntesis de una cadena complementaria de
DNA en el sentido 5´> 3´ usando un molde de En la tercera etapa (elongación) se produce la
cadena sencilla, pero a partir de una región de síntesis de una cadena sencilla (produciéndose
doble cadena. Para crear esta región doble un fragmento de doble cadena por la
cadena se usan los denominados cebadores complementariedad) en la dirección 5´> 3´
(primers). Son una pareja de oligonucleótidos mediante la enzima DNA polimerasa, la cual
sintetizados de manera que sean incorpora los desoxinucleótidos fosfato
complementarios a cada uno de los extremos presentes en el medio siguiendo la cadena
3´ del fragmento de DNA que se desea molde.
amplificar.
De esta manera, el objetivo principal de esta
La reacción en cadena de la polimerasa se basa práctica de laboratorio técnica es conseguir
en un ciclo formado por tres etapas: una gran cantidad de copias de un fragmento
de ADN, partiendo de una cantidad ínfima de
1. Desnaturalización de ADN doble esta biomolécula.
cadena.
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METODOLOGÍA.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN.

Tabla 1. Volumen añadido de los principales componentes de una PCR considerando un volumen total de 25 μL.
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Primers (cebadores, oligonucleótidos)

Un iniciador o cebador es una secuencia corta mix contiene todos los componentes
de ADN de cadena simple que se utiliza en necesarios para una reacción de PCR. La
una reacción en cadena de la polimerasa concentraciones de sus reactivos han sido
(PCR). En el método PCR se emplea un par de optimizadas para obtener un alto desempeño.[3]
cebadores para hibridar con el ADN de la
muestra y definir la región del ADN que será El master mix contiene reactivos esenciales
amplificada para su posterior análisis. Es una tales como la Taq polimerasa; esta enzima
manera de seleccionar una secuencia muy cataliza la reacción de polimerización de una
específica del ADN [1]. cadena de ADN utilizando otra como molde,
añadiendo nucleótidos libres en sentido 5' -> 3'
ADN molde y complementarios a la hebra molde,
conformando un fragmento de ADN de doble
Contiene la región de ADN que se va a cadena. Del mismo modo, incluye Cloruro de
amplificar; asimismo, es fundamental para que Magnesio que se utiliza como fuente de iones
la enzima polimerasa sintetice las nuevas magnesio, cofactor de la polimerasa, depende
cadenas [2]. de su concentración la eficiencia de la reacción
será mayor o menor.[4]
Master mix
Agua
Este producto está diseñado para disminuir
tiempos en la preparación de la reacción de El agua es el disolvente de la reacción y se usa
PCR y evitar contaminaciones en las etapas de en forma ultrapura libre de nucleasas (enzimas
pipeteo, permitiendo obtener mayor que degradan los ácidos nucleicos) [2].
reproducibilidad en los resultados. La Master

Tabla 2. Pares de primers usados para la amplificación de la región ITS en Saccharomyces cerevisiae.

Las regiones ITS1-5.8S-ITS2 rDNA fueron capacidad de amplificar ambas regiones (ITS1
amplificadas con los cebadores ITS1 e ITS2) de cualquier hongo,
(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′) e ITS4
(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′) como Por otro lado, el ADN ribosómico (rDNA) es
se muestra en la tabla 2. Estos una secuencia de ADN contenida en los
oligonucleótidos empleados tienen la cromosomas del nucléolo que codifica ARN
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ribosómico. Estas secuencias regulan la corta de ADN proveniente de una región

transcripción e iniciación de la amplificación. estandarizada (ej: rDNA), la cual se compara
Contienen segmentos espaciadores con una secuencia de referencia con el fin de
transcribibles y no transcribibles. Estas identificar la especie a la cual pertenece un
regiones de ADNr se denominan también espécimen biológico.
regiones de organización del nucleolo. De
forma complementaria, para llevar a cabo la
técnica del “DNA barcoding” (código de
barras de ADN) se emplea una secuencia

Figura 2. Etapas de la PCR. Temperaturas, tiempos y ciclos estandarizados.

La figura 2 representa las condiciones de extensión, esta etapa se realiza 30 veces

amplificación establecidas previamente en el (puede variar).
termociclador para las 4 muestras. Por lo
general se utilizan los siguientes pasos: ● Desnaturalización. En esta etapa se
separa la doble hélice de ADN
Desnaturalización inicial. Habitualmente la mediante el calentamiento de la
PCR utiliza un ciclo de desnaturalización muestra a una temperatura entre 94°C
(separación de la doble hélice porque los durante 1 minuto para romper los
puentes de hidrógeno se rompen), la puentes de hidrógeno que las unían, de
temperatura y el tiempo se determinan de esta manera cada cadena queda como
acuerdo a las características del ADN y de la molde para la síntesis de una nueva
ADN polimerasa utilizada, en este caso es 94 cadena complementaria de ADN.
°C durante 5 minutos. ● Alineamiento. Una vez separadas las
cadenas del ADN, se alinean los
Ciclos de la PCR. Se realizan ciclos sucesivos iniciadores a sitios específicos
de desnaturalización, alineamiento y
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complementarios de las cadenas temperatura a la que se hibridan o se pegan los

sencillas de la región que se va a oligonucleótidos en los sitios que son
amplificar. Para que esto sucediera se complementarios. Este proceso dependerá
bajó la temperatura a 55 °C durante 1 principalmente del tipo de uniones (dobles o
minuto lo que permitió la unión triples enlaces de hidrógeno) que formarán sus
(alineamiento) de los iniciadores. bases, y por eso la secuencia de cada oligo es
● Extensión. En esta etapa se sintetiza la que se toma en cuenta para conocer cuál es
una nueva cadena en sentido 5’ a 3’ la temperatura óptima para su alineamiento.
Conocer la Tm puede darnos una idea, pero no
para lo cual se incrementó la
siempre es la temperatura que se utiliza en el
temperatura a 72 °C (durante 2
termociclador, ya que también los iones y otras
minutos), porque es la temperatura
sustancias que haya en la reacción pueden
óptima a la cual la Taq polimerasa influir en la forma en que se unen los oligos.[6]
alcanza su mayor actividad y se une a
los iniciadores y comienza la El número de ciclos de la PCR puede ser
replicación. La Taq polimerasa añade optimizado con respecto al número de copias
de 500 a 1000 nucleótidos por minuto. de ADN iniciales. En una PCR óptima, se
duplica la cantidad de copias de ADN en cada
Extensión final. Generalmente, al terminar los ciclo, bajo la ecuación 2n, donde n es el
ciclos, se realiza una última extensión, en este número de ciclos [7].Cada vez que se termina
caso 10 minutos a 72 ºC para permitir que la un ciclo de amplificación, se duplica la
polimerasa termine de sintetizar todos los cantidad de fragmento de ADN que teníamos
fragmentos que puedan haber quedado en un principio. Si partimos de una única copia
incompletos. del fragmento y hacemos 20 ciclos de
amplificación, al final de la reacción
Serrato Díaz, A. (s. f.). PROTOCOLO. En L. tendremos aproximadamente 1 millón de
Flores Rentería, J. Aportela Cortez, & E. copias del fragmento inicial. [7]
Sierra Palacios (Eds.), PCR: reacción en
cadena de la polimerasa (pp. 62–63). Al utilizar 30 ciclos se obtiene una
amplificación aproximadamente de 2 billones
En una PCR común las distintas temperaturas de copias de ADN , pero al incrementar los
usadas y el tiempo en cada ciclo dependen de ciclos puede dar lugar a la amplificación de
gran variedad de parámetros. Estos incluyen la productos no deseados originados por
enzima usada para la síntesis de ADN, la hibridaciones inespecíficas, después de un
concentración de iones divalentes y de los número determinado de ciclos la amplificación
dNTP en la reacción, y la temperatura de deja de producirse de manera exponencial y
unión de los cebadores, así como la longitud llega a una fase estacionaria.[7]
del ADN que se desea amplificar. [5]

Cuando se habla de la temperatura melting

(Tm) en procesos como la PCR, se refiere a la
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Los resultados observados en este estudio muestran la utilidad de las pruebas de PCR para la
amplificación de secuencias de ADN de un modelo tal como Saccharomyces cerevisiae.

Figura 1. Electroforesis en gel de agarosa al 1.5% de los productos amplificados por PCR de Saccharomyces
cerevisiae de 400 pb aproximadamente. MPM: Marcador de peso molecular (1 Kb); Carriles 1,2,3,4 y 5: control
positivo de PCR para las muestras analizadas; carril 6: control negativo.

En la figura superior se observa el amplicón de control positivo y negativo. Estos, son

400 pb aproximadamente en las reacciones de necesarios para corroborar que en la muestra
amplificación correspondientes a todos los reactivos funcionan adecuadamente
Saccharomyces cerevisiae (carriles 1, 2, 3, 4 y (control positivo)[8].Si la muestra es positiva
5, respectivamente); mientras que, en el carril aparecerá una línea en el gel correspondiente a
6 no se detectó producto de amplificación. La nuestro fragmento de interés [9] .El control
reacción se realizó en un termociclador negativo se utiliza para comprobar que
(Eppendorf Mastercycler) bajo las siguientes ninguno de los componentes de la reacción
condiciones: un pre-ciclo a 94 °C por 5 min; está contaminado con ADN de otra
30 ciclos a 94 °C por 1 min c/u, 1 ciclo a 55ºC procedencia y que no se han producido errores
por 1 min, 1 ciclo a 72ºC por 2 min y una de manejo que hayan provocado la
extensión final a 72ºC por 10 min. contaminación cruzada entre muestras.[7] Si la
muestra es negativa no se observará ninguna
Por otro lado, es de suma importancia línea en nuestros productos amplificados.
considerar que, la PCR siempre debe tener un
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CONCLUSIONES

Se confirma en este estudio que las concentraciones de MgCl2, Taq polimerasa,

primers-oligonucleótidos y la variación en temperatura de anillamiento permiten una mayor
especificidad de la amplificación de bandas de interés.

Se evidenció mediante la (PCR) un producto de 400 pb aproximadamente de la región

ITS1-5.8S-ITS2 de Saccharomyces cerevisiae.

Al utilizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR ) se permite amplificar millones de copias de

una región específica a partir de una o muy pocas copias del ADN molde. Es una técnica muy fuerte
debido, en gran medida, a la gran capacidad de los oligonucleótidos (primer forward) de unirse firme
y específicamente a sus secuencias complementarias de ADN descartando fácilmente entre muchos
sitios.

Es importante que en el proceso de desnaturalización la muestra de ADN esté a 94°C, ya que por
medio de la aplicación de calor se logró romper los enlaces de hidrógeno que la unían.

REFERENCIAS

1. Mas, E., Poza, J., Ciriza, J., Zaragoza, P., Osta, R., & Rodellar, C. (2001). Fundamento de la
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) [Ebook] (p. 1). Revista AquaTIC. Retrieved 19
October 2021, from http://www.revistaaquatic.com/ojs/index.php/aquatic/article/view/139.
2. Iniciador o cebador | NHGRI. (s. f.). Genome.gov. Recuperado 20 de octubre de 2021, de
https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Iniciador-o-cebador
3. MASTER MIX PCR (pto final) – PB-L Productos Bio-lógicos. (s. f.). Reactivos. Recuperado
20 de octubre de 2021, de http://www.pb-l.com.ar/productos/ea04-master-mix-pcr/
4. Rodicio, M. D. R. (2004, 1 abril). Identificación bacteriana mediante secuenciación del ARNr
16S: fundamento, metodología y aplicaciones en microbiología clínica | Enfermedades
Infecciosas y Microbiología Clínica. ELSEVIER. Recuperado 20 de octubre de 2021, de
https://www.elsevier.es/es-revista-enfermedades-infecciosas-microbiologia-clinica-28-articulo
-identificacion-bacteriana-mediante-secuenciacion-del-13059055
5. Cotran, R. Y. (s. f.). Informe Laboratorio PCR - PRACTICA EXTRACCIÓN DE ADN
GENÓMICO Y REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA. StuDocu.
https://www.studocu.com/co/document/universidad-de-santander/fisiologia-del-ejercicio/infor
me-laboratorio-pcr/4045883
6. Revista Médica de la Universidad Veracruzana. (s. f.). National Human.
https://www.uv.mx/rm/num_anteriores/revmedica_vol3_num1/articulos/reaccion_cad_polime
rasa.html
7. Vásquez et al. Actualización en caracterización molecular de levaduras de interés industrial.
Recuperado de http://www.scielo.org.co/pdf/biote/v18n2/v18n2a17.pdf
8. Código de Barras de ADN – Pebol. (s. f.). PeBol. https://pebol.org/codigo-de-barras/
PCR: REACCIÓN EN CADENA POLIMERASA

9. Luigi, T. (s. f.). Reacción en cadena de la polimerasa para la identificación de Salmonella spp.
usando el gen invA. Scielo.
http://ve.scielo.org/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1316-71382015000300008
10. Moreno, N. (2010, 1 diciembre). SciELO - Saúde Pública - Aplicación de las pruebas de PCR
convencional simple y múltiple para la identificación de aislamientos de Leptospira spp. en
Colombia Aplicación de las pruebas de PCR convencional simple y múltiple para la
identificación de aislamientos de Leptospira spp. en Colombia. Scielo.
https://scielosp.org/article/rpmesp/2010.v27n4/548-556/
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