Una guía para HPLC y
LC-MS
Selección búfer
Las columnas de HPLC John Dolan
Su decisión tiene efectos duraderos.
Elegir sabiamente.
Las columnas de HPLC
Ultra columnas de HPLC inerte Base-Desactivado
Para rendimiento, selectividad y
reproducibilidad garantizada
AS actuacióngarantía
✓
Si ACE no superan su columna existente (de la fase equivalente, el tamaño de partícula y
dimensiones), enviar sus datos comparativos dentro de los 60 días y mantener la columna de la ACE
libre de cargas.
Utilizando tampones con HPLC y LC-MS
Tabla de contenido Página
¿Por qué pH de Control? 2
Implicaciones prácticas 4
El control de pH 4
¿Qué hay de CL-EM? 6
Sólo Interesado en pH bajo? 7
O pH alto? 7
¿Cuánto cuesta? 7
Problemas de solubilidad 10
Efectos de dilución 11
tampón de preparación de 12
precauciones 13
Resumen 15
referencias dieciséis
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Utilizando tampones con HPLC y LC-MS
Cuando las muestras contienen compuestos ionizables, el pH de la fase móvil puede ser una de las variables más
importantes en el control de la retención en una separación de fase inversa HPLC (RP-HPLC). Sin embargo, si no se
controla adecuadamente, el pH puede ser una fuente de muchos problemas. Como la mayoría de los compuestos
analizados por RP-HPLC contienen uno o más grupos funcionales ácidos o básicos, la mayoría de las fases móviles
requieren control del pH. Por esta razón, los tampones se utilizan ampliamente. Este folleto destaca algunos de los
aspectos importantes del pH de la fase móvil para el cromatógrafo de práctica.
¿Por qué pH de Control?
La Figura 1 ilustra la necesidad de control de pH cuando los compuestos ionizables están presentes. Cuando un ácido es
más de 2 unidades de pH por encima o por debajo de su pag K un, será
> 99% ionizada o no ionizada, respectivamente. Las bases son ionizados por debajo de su pag K un y no ionizados por
encima de su pag K a. La forma no ionizada será menos polar (más hidrófobo), y por lo tanto más fuertemente
retenido en un sistema de fase inversa. Por lo tanto, a pH bajo, los ácidos serán más retenidos (Fig. 1a), mientras
que bases serán más retenidos a pH alto (Fig. 1b).
Figura 1. Retención vs. pH para un ácido hipotético (a) y la base (b).
Si el pH de la fase móvil se encuentra cerca del pag K un, se puede ver que los pequeños cambios en el pH pueden
hacer grandes cambios en la retención - no lo que se desean para una robusta separación. Esto se ilustra en la Figura
2a, que muestra la sensibilidad extrema de algunos compuestos a cambios muy pequeños en el pH. Aquí los cambios
de resolución por un factor de dos para un cambio de sólo 0,1 unidades de pH - esto es la cantidad de error en el
ajuste del pH común en muchos laboratorios. La Figura 2b representa una gráfica de retención frente a pH de un
ácido, una base y un compuesto neutro. A pH 5, la retención es menos sensible a pH de lo que es a pH 3 (para el
ácido) o pH ≥ 6 para la base.
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Además de la inestabilidad de los tiempos de retención cuando el pH está cerca de la pag K un, separación de pico
relativa (selectividad) puede cambiar si los compuestos de estructura similar están presentes.
(un) (segundo)
Figura 2. El efecto de pequeños cambios en el pH de la fase móvil en la separación.
(A) analitos básicos: p-anisidina, m-toluidina, 4-cloroanilina, 3-aminobenzonitrilo (en orden de retención);
27:73 metanol / tampón de fosfato.
(B) ácido: ácido salicílico; Base: metilanfetamina; neutra: fenacetina.
Otro factor que se debe considerar al elegir el pH de la fase móvil es la estabilidad de la columna. Como regla general,
las columnas basadas en sílice deben ser operados a 2 <pH <8. A pH <2, se puede producir pérdida de fase unida
debido a la hidrólisis. Por encima de pH 8, la columna vertebral de sílice se convierte en cada vez más soluble. sílice
Superior pureza tiende a tolerar pH alto mejor que los productos de menor pureza. Una cuestión que complica aún más
es el potencial de ionización de grupos silanol no unida (-Si-OH) en la superficie de la partícula de sílice. Para mayores
de sílice, menos puro (a menudo referido como “tipo A” de sílice), la pag K un de estos grupos silanol está en el 4-5 región
de pH. Esto significa que a pH> 6, significativa ionización silanol puede ocurrir por estos materiales. Históricamente, esto
ha sido la principal causa de pico de asimetría para compuestos básicos a través de procesos de intercambio de
cationes. El más reciente, de alta pureza ( “Tipo-B”) de sílice tiene una pag K a> 7, tizón de modo pico debido a intercambio
de cationes con los sitios de silanol ionizados es mínima. Esta es una razón por sílices de alta pureza dan mucho mejor
forma de pico para las bases que sus homólogos mayores, como se ilustra de forma espectacular durante varios
componentes básicos en las separaciones mostradas en la Figura 3. Además de pico mejora la forma, el uso de alta
pureza de sílice conduce a una mejor reproducibilidad en comparación con bajo contenido en sílice pureza debido a la
reducción de estas interacciones silanol secundarios impredecibles.
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Figura 3. La eficacia de alta pureza de sílice en la reducción de tizón del silanol de bases.
Componentes: norefedrina, nortriptilina, tolueno (neutral), imipramina, amitriptilina. Condiciones: 250 x 4,6
mm, columnas 5? M; / Fosfato 80:20 metanol 25 mM (pH 6,0);
1,00 ml / min
Implicaciones prácticas
Las características de la columna y de las muestras en general, conducen a una recomendación para iniciar el
desarrollo del método con una fase móvil en el intervalo de pH 2-3. A este pH, la ionización de la mayoría de los ácidos
orgánicos se suprimirá, al igual que la ionización de ningún grupo silanol sobre la columna. Bases se ionizan en estas
condiciones, pero la pag K un de la mayoría de los compuestos básicos es> 7, de modo que funciona a una pH
suficientemente alto para suprimir la ionización será perjudicial para la mayoría de las columnas. Por lo tanto, todas las
demás cosas son iguales, lo mejor es empezar a cabo a un pH bajo. Si necesita operar la columna a un pH alto,
asegúrese de seleccionar una columna conocido por ser estable en la región de pH que elija.
Si la supresión de iones de bajo pH no proporciona resultados aceptables, el pH de la fase móvil se puede ajustar para
ayudar a obtener la separación deseable. Por lo general, es más fructífera para ajustar el contenido orgánico fase móvil
(% B-disolvente) para obtener la retención aceptable para los compuestos neutros y no ionizados, a continuación, para
ajustar el pH para ajustar con precisión la retención de los analitos iónicos.
El control de pH
Dado que la retención de los compuestos ionizables es muy sensible al pH fase móvil, es necesario para controlar
el pH de la fase móvil mediante la adición de un tampón. Un tampón mantiene el pH cuando se añade una pequeña
cantidad de ácido o base. Muchas sustancias diferentes se han utilizado para el almacenamiento en búfer en
HPLC; algunos de estos
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aditivos se enumeran en la Tabla 1. Un tampón es más eficaz cuando se utiliza dentro de ± 1 unidad de pH de su pag K un, pero
puede proporcionar de tamponamiento adecuada ± 2 unidades de pH a partir de la pag K a.
Tabla 1. pag K un Los valores de la fase móvil Aditivos comunes 1
pag K un ( 25 ° C) compuesto
0.3 ácido trifluoroacético 2
2.15 ácido fosfórico ( pag K 1)
3.13 ácido cítrico ( pag K 1)
3.75 ácido fórmico
4.76 ácido acético
4.76 ácido cítrico ( pag K 2)
4.86 ácido propiónico
6.35 ácido carbónico ( pag K 1)
6.40 ácido cítrico ( pag K 3)
7.20 ácido fosfórico ( pag K 2)
8.06 tris
9.23 ácido bórico
9.25 amoníaco
9.78 glicina ( pag K 2)
10.33 ácido carbónico ( pag K 2)
10,72 trietilamina
11.27 pirrolidina 3
12.33 ácido fosfórico (pK 3)
1 datos de [1]; 2 Índice de Merck; 3 CRC Handbook of Chemistry
and Physics
Los tampones más populares para HPLC con detección UV son fosfato y acetato. Fosfato y acetato son
tampones particularmente útiles porque se pueden usar a longitudes de onda por debajo de 220 nm. Como
puede verse en la Tabla 2, fosfato tiene tres pag K un valores que le dan tres rangos de tamponamiento: 1,1
<pH <3,1,
6,2 <pH <8,2, y 11,3 <pH <13,3 (permitiendo el almacenamiento en búfer de pag K un ± 1 unidades de pH). límites
prácticos de la estabilidad de la columna requieren que truncamos el rango inferior a
2,0 <pH <3,1 y eliminar la gama más alta. Observe que hay un hueco en la amortiguación entre pH 3,1 y pH 6,2
para el fosfato. Esto significa que, aunque es posible ajustar el pH de fosfato a 5,0, no hay capacidad de
amortiguación insignificante a este pH. Para llenar este vacío de amortiguación, se necesita otro búfer. Por
casualidad, acetato llena esta necesidad, así, con un intervalo de tamponamiento de 3,8 <pH <5,8. Con una
ligera extensión del intervalo de tamponamiento de ± 1 unidades de pH de la pag K un,
fosfato y acetato pueden cubrir toda la gama de pH de 2 <pH <8 usado normalmente para las columnas basadas en
sílice.
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A veces, durante el desarrollo del método, es posible que el deseo de tener el control total del pH sobre el
rango útil de la columna. En este caso, una mezcla de fosfato y tampón de acetato permitirá variación
continua de la fase móvil de 2 <pH <8. Una vez que encuentre el pH deseado, el búfer no es necesario
puede ser eliminado. Por ejemplo, si el pH de la fase móvil final es 4,3, acetato es todo lo que se necesita,
por lo fosfato no necesita ser utilizado en todos.
Algunos analistas gustaría usar el citrato de amortiguación, ya que tiene tres superposición
pag K un valores que permiten el almacenamiento en búfer sobre el 2,1 <pH <6,4 gama (Tabla 2). Sin embargo, citrato no
tiene un valor tan bajo UV-corte como acetato y fosfato, por lo que funciona a longitudes de onda inferiores a 220 nm no
es posible; Además, algunos analistas consideran que tienen más problemas con las válvulas de retención cuando se
usa citrato. Así tampón de citrato por lo general es una segunda elección a fosfato y acetato.
Tabla 2. comunes Buffers HPLC
buffer intervalo de pH CL-EM compatibles
fosfato ( pag K 1) 1.1 a 3.1 X
fosfato ( pag K 2) 6.2 a 8.2 X
fosfato ( pag K 3) 11,3-13,3 X
acetato 1 03.08 a 05.08 SÍ
citrato ( pag K 1) 02.01 a 04.01 X
citrato ( pag K 2) 03.07 a 05.07 X
citrato ( pag K 3) 4.4 a 6.4 X
ácido trifluoroacético (0,1%) 2.0 SÍ
ácido fosfórico (0,1%) 2.0 X
ácido fórmico (0,1%) 2.7 SÍ
formiato de amonio 2.7 a 4.7 SÍ
bicarbonato de amonio 06.06 a 08.06 SÍ
borato 8.3 -10.3 SÍ
1 adecuado para LC-MS como acetato de amonio
¿Qué hay de CL-EM?
Cuando un espectrómetro de masas se utiliza como el detector LC (LC-MS), la fase móvil debe ser volátil,
porque una de las funciones de la interfaz de LC-MS es vaporizar la fase móvil. Esto significa que el búfer
más popular para el trabajo LC-UV, fosfato, no se puede utilizar. acetato de amonio es suficientemente volátil
para el uso LC-MS, pero se quedan con la 2,0 <pH <3,8 y 5,8 <pH <8,0 gama para cubrir. La Tabla 2
enumera varios tampones adicionales que son suficientemente volátiles para uso LC-MS. formiato de amonio
(2,7 <pH <3,7) hace un trabajo bastante bueno de llenar
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la brecha en el extremo de bajo pH. bicarbonato de amonio (6,6 <pH <8,6) funciona para valores de pH más
altos. Estos no cubren por completo los rangos deseados tampón, pero para aplicaciones LC-MS que son los
que están disponibles para trabajar.
Sólo Interesado en pH bajo?
Si un bajo pH de la fase móvil es todo lo que es importante, 0,1% de ácido fosfórico v / v (Tabla 2) proporciona el
almacenamiento en búfer razonable a pH 2 para aplicaciones LC-UV. ácido trifluoroacético (TFA) también genera
un pH de la fase móvil de ≈ 2 a 0,1% v / v (Tabla 2), y, durante muchos años fue el aditivo de elección para LC-MS a
pH bajo. TFA también actúa como un reactivo de apareamiento iónico, y se utiliza ampliamente para proteínas y
péptidos separaciones. TFA, sin embargo, puede suprimir la ionización en la interfaz de LC-MS, provocando una
caída de la señal, por lo que ha caído en desuso en los últimos años. En su lugar, 0,1% de ácido fórmico (pH ≈ 2,7,
Tabla 2) es la primera elección para LC-MS a pH bajo. Con el uso de un ácido para-pH bajo, se supone que el pH
es más importante que la capacidad de tamponamiento - si se necesita cierto buffering, seleccionar un tampón de
la Tabla 2 que abarca el pH deseado.
O pH alto?
Como se mencionó anteriormente, la solubilidad de los aumentos de sílice como el pH de la fase móvil se
incrementa por encima de pH 8, de modo pH> 8 generalmente no se recomienda. Sin embargo, puede ser
necesario trabajar con fases móviles de mayor pH con el fin de obtener la separación deseada. En tales
casos, se debe seleccionar una columna diseñada para trabajar a un pH alto. Como regla general, de alta
pureza de sílice, “carga de carbono” de altura y rematado terminal a reducir la solubilidad de sílice. tampón
fosfato debe evitarse, ya que mejora la disolución de sílice a pH alto. En lugar utilizar tampones orgánicos,
tales como pirrolidina, que pueden ayudar extender vida de la columna a pH alto. Incluso con una
cuidadosa selección de las condiciones, se espera que acortar tiempos de vida de la columna a pH> 8. De
columnas de golf que utilizan polimérica, en lugar de sílice, las partículas no son susceptibles a la
disolución de sílice, por lo que pueden utilizarse a un pH alto,
¿Cuánto cuesta?
Una de las funciones de la memoria tampón es mantener el analito al pH deseado. Si se tiene en cuenta solo este aspecto
de tampón, se necesita muy poca memoria intermedia. Para el trabajo analítico, muchas muestras están en el g / ml a ng /
ml gama. Así que para las inyecciones de <100 l, la masa de la columna será no más de unos pocos cientos de
nanogramos. Se necesita muy poco tampón, incluso a 1 unidad de pH a partir de la pag K un de la memoria intermedia, para
proporcionar todo el búfer que se necesita para la muestra.
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El tampón también debe amortiguar la columna para que se mantenga a pH constante. Un volumen relativamente
grande de la fase móvil tamponada pasa a través de la columna, por lo que la fase estacionaria está constantemente
expuesto a amortiguar. Más nuevos, de alta pureza columnas de sílice tienen un menor número de grupos silanol
ácidos, por lo que necesitan menos de tampón de los mayores, columnas de sílice de menor pureza. Esta propiedad de
la columna se ilustra con los cromatogramas de la Figura 4. (En esta aplicación, el ácido trifluoroacético sirve para
mantener el pH bajo y también actúa como un reactivo de apareamiento iónico, por lo que los dos efectos no están
aislados unos de otros.) Nota en la columna izquierda de los cromatogramas que la forma del pico es comparable para
las tres columnas cuando
0,1% de TFA se añade a la fase móvil. Sin embargo, cuando la concentración de TFA se deja caer diez veces a 0,01%
como se muestra en los cromatogramas de la derecha de la figura 4, la correlación de la pureza de sílice y la forma del
pico es obvia. La forma de los picos se degrada ligeramente para la columna de sílice de alta pureza cuando se
compara a la de 0,1% de TFA, pero hay un cambio dramático en forma de pico para la moderada y columnas de sílice
de baja pureza. La única variable que ha cambiado entre los dos conjuntos de cromatogramas es la concentración de
TFA. Parece ser que la TFA actúa, al menos en parte, para amortiguar la columna para que se reduzcan al mínimo las
fuertes interacciones responsables de colas en los picos. Cuando búfer insuficiente está presente, forma de pico sufre
en todas las columnas. Aunque la mayoría de los nuevos métodos se desarrollan en alta pureza, de sílice tipo B, el
nivel de acidez silanol puede variar significativamente de producto de un fabricante a otro. Como un factor de
seguridad, es una buena idea usar más de la cantidad mínima de almacenamiento temporal requerido. Esto nos lleva a
recomendar aditivos de carácter ácido en el intervalo de aproximadamente 0,1% v / v o tampones de al menos 5-10
mM en la solución final.
Una tercera, y quizás lo más importante, la tarea de la memoria intermedia es para amortiguar la muestra a medida que
se inyecta, por lo que se alcanza rápidamente el pH de la fase móvil. Debería ser obvio que el trabajo de la memoria
intermedia de fase móvil es mucho más fácil si una inyección de pequeño volumen de la muestra se realiza en un
disolvente de inyección en el mismo pH que la fase móvil, en oposición a una gran inyección de la muestra en una
solución de inyección con un pH que difiere significativamente de la fase móvil. Uno puede superar la necesidad de una
alta concentración de tampón en la fase móvil mediante el ajuste del pH de la muestra antes de la inyección.
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Figura 4. Efecto del ácido trifluoroacético en forma de pico.
Alta Pureza sílice - ACE 300 Å
0,1% de TFA 0,01% de TFA
0 2 4 6 8 10 12 14 dieciséis18 20 22 24 26 28 30 0 2 4 6 8 10 12 14 dieciséis18 20 22 24 26 28 30
La pureza moderada sílice - Simetría 300 Å
0,1% de TFA 0,01% de TFA
0 2 4 6 8 10 12 14 dieciséis 18 20 22 24 26 28 30 0 2 4 6 8 10 12 14 dieciséis 18 20 22 24 26 28 30
Baja Pureza sílice - Vydac TP 300 Å
0,1% de TFA 0,01% de TFA
0 2 4 6 8 10 12 14 dieciséis18 20 22 24 26 28 30 0 2 4 6 8 10 12 14 dieciséis18 20 22 24 26 28 30
Tiempo (min) Tiempo (min)
Columna: 250x4.6mm, 5! M, C18 300 Å. Condiciones: A: 0,1% o 0,01% de TFA en H 2 O; SEGUNDO:
0,1% o 0,01% de TFA en ACN; 5-70% de B en 30 min; 1,00 ml / min, 280 nm. Componentes (en orden de retención):
ribonucleasa A, citocromo C, holo-transferrina, apomioglobina.
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Problemas de solubilidad
Hemos limitó a la necesidad de tener suficiente memoria intermedia actual para amortiguar la muestra, tanto durante la
inyección y durante la separación, así como amortiguar la columna. En el otro extremo de la escala, ¿cuánto es
demasiado? Un problema crítico evitar es la precipitación de la memoria intermedia en el sistema. Si el buffer se
precipita en la bomba de HPLC, que puede ser un montón de trabajo para limpiar, y las partes pueden tener que ser
reemplazado. Sin embargo, si la memoria intermedia se precipita dentro de la columna, la columna debe ser
descartado, porque es casi imposible de tampón de lavado precipitado de los poros en la fase estacionaria.
Como la mayoría de los analistas saben, acetonitrilo (ACN) es un disolvente mucho más pobre para
tampones y sales que el metanol (MeOH), y tetrahidrofurano (THF) es aún peor. Esto se ilustra en los datos
de la Tabla 3 para el buffer común soluble menos, fosfato de potasio, a pH 7,0 [2]. Al 80% orgánico, fosfato
es soluble a una concentración 15 mM en MeOH, pero sólo a 5 mM en ACN; es prácticamente insoluble (<5
mM) en 80% de THF. En fases móviles que contienen 50% orgánico, fosfato es soluble a> MeOH 50 mM o
ACN y THF 25 mM. Esto significa que para separaciones isocráticas que utilizan alta orgánica (% B) fases
móviles o gradiente se ejecuta ese fin en alto% de B, se debe tener cuidado para evitar condiciones en las
que puede ocurrir la precipitación de amortiguación.
Tabla 3. Solubilidad de fosfato de potasio, pH 7,0, en disolventes de HPLC comunes 1
%SEGUNDO MeOH ACN THF
50 2 > 50 mM > 50 mM 25 mM
60 > 50 45 15
70 35 20 10
80 15 5 <5
90 5 0 0
1 datos de [2]; 2> 50 mM en todos los disolventes a un menor% de B
Los datos mostrados en la Tabla 3 son para soluciones a granel; la situación puede empeorar aún más para la
mezcla en línea. Con cualquiera de los sistemas de HPLC-de mezcla de baja presión de alta presión de mezcla o,
los A y B disolventes entran en contacto directo entre sí en la fuerza completa cuando entran en el mezclador. Esto
puede crear problemas que no podría esperar otra cosa. Consideremos el caso en el que se desea una fase móvil
de 60% de ACN que contenía tampón 10 mM - esto es mucho menor que la concentración crítica de 45 mM durante
60% de ACN muestra en la Tabla 3. Si el A-depósito contenía 25 mM de tampón y el B Embalse contenían 100% de
ACN, una mezcla 40/60 de a / B debe dar la fase móvil deseado. Sin embargo, en el punto de los disolventes son
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, 100% de ACN contactos mixtos 25 mM de tampón y pueden ocurrir precipitación. Esto puede causar problemas, o el
precipitado se puede disolver de nuevo rápidamente, dependiendo de las características específicas de diseño del equipo.
La elección de las sales también puede hacer una diferencia significativa en la solubilidad. Como se muestra en
la Tabla 4, las sales de amonio de fosfato son mucho más solubles en ACN que son las sales de potasio, en
condiciones comparables. El acetato es mucho más soluble que el fosfato. En general, es mejor utilizar sales de
potasio en lugar de sales de sodio debido a las diferencias de solubilidad.
Tabla 4. La solubilidad de diversos tampones en acetonitrilo 1
%SEGUNDOamonio potasio amonio acetato de potasio amonio
fosfato fosfato fosfato fosfato
pH 5,0 pH 3,0 pH 3,0 pH 7,0 pH 7,0
60 2 > 50 mM > 50 mM > 50 mM 50 mM 45 mM
70 > 50 > 50 > 50 25 20
80 > 50 35 20 5 0
90 25 5 0 0 0
1 datos de [2]; 2> 50 mM en todos los disolventes a un menor% de B
Efectos de dilución
Hay varias maneras posibles para formular una fase móvil que comprende tampón y disolvente orgánico.
Para el trabajo isocrática, la fase móvil se puede mezclar manualmente de manera que la fase móvil se
bombea desde un único depósito. Alternativamente, el sistema de HPLC se puede usar para mezclar los
componentes. Un tampón concentrado se puede mezclar con un disolvente orgánico puro o un tampón
diluido puede ser mezclado con el tampón de disolvente que contiene orgánica a la misma concentración.
Para los métodos de elución en gradiente, sólo los últimos dos técnicas se pueden utilizar (por supuesto, en
cualquiera de los sistemas de isocráticas o de gradiente, el A- y / o B-disolventes puede ser una mezcla
acuosa / orgánica.) Cada técnica de mezcla tiene ventajas y desventajas. El mezclado manual es el método
menos probable que resulte en la precipitación de búfer en el sistema HPLC,
On-line de mezcla es más conveniente para el desarrollo del método isocrático y se requiere para la elución de
gradiente. solución tampón acuosa de mezcla con un disolvente orgánico puro es simple, pero tiene dos problemas
potenciales. En primer lugar, debido a que el tampón será diluido por el disolvente orgánico, la A-disolvente debe ser
a una concentración mayor de tampón que el requerido en la fase móvil y en segundo lugar con gradientes, existirá
una inversa en gradiente en la concentración de tampón. Cuanto mayor sea la concentración de tampón, más
probable es que la precipitación se producirá cuando el tampón
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y el disolvente orgánico inicialmente en contacto entre sí en el mezclador. En el ejemplo citado anteriormente, un
fosfato de potasio 10 mM, tampón de pH 7,0 en 60% de ACN sería soluble en la solución a granel, pero requeriría
fosfato 25 mM en el A-depósito. Cuando, se pueden producir 25 fosfato contactos mM 100% de ACN en el
mezclador precipitación.
Una forma alternativa de mezclar los disolventes en el ejemplo anterior sería poner fosfato 10 mM en el
A-depósito. Para el B-disolvente, mano-mix 70% de ACN con 30% de una solución tampón de fosfato 33 mM
para alcanzar 70% de ACN que contiene fosfato 10 mM (la mitad de la concentración crítica de la Tabla 3). Ahora
el A y B disolventes se pueden mezclar para lograr 60% de ACN con una concentración final de fosfato de 10
mM. Esta técnica evita el potencial de precipitación de memorias intermedias dentro de la HPLC y permite la
flexibilidad para mezclar en línea en cualquier fase móvil que contiene un 70% de ACN o menos. Tiene la ventaja
añadida para el trabajo gradiente que la concentración de tampón será constante en todo el gradiente, por lo que
la dilución de la memoria intermedia durante el gradiente no debe ser una preocupación.
tampón de preparación de
Hay cuatro técnicas comunes para preparar los tampones que se revisan brevemente aquí. recetas de
amortiguamiento son abundantes, por lo que no se han reproducido. Muchos textos de bioquímica y química
contienen tablas de tampones; una compilación práctico de recetas tampón para HPLC está contenida en el
apéndice de [3]. Una excelente herramienta en línea [4] solicita el pH del tampón de destino, la concentración y el
volumen y después se genera una receta.
La mejor manera de preparar buffers es pesar los componentes del tampón según la receta y se diluye con agua
hasta el volumen deseado. Al principio esto puede parecer como un procedimiento tedioso, pero es más preciso,
por lo general es más rápido que las técnicas pHadjustment y es fácil de reproducir el tiempo y de un laboratorio a
otro. Esta técnica proporciona un amortiguamiento de la concentración y el pH deseado. Es una buena idea para
comprobar el pH después de la formulación para garantizar no se hicieron errores.
Una técnica de preparación de tampón alternativa es hacer soluciones separadas de los componentes del
tampón ácido y básico (por ejemplo, ácido fosfórico y la sal de fosfato a 10 mM cada uno). Las dos soluciones se
mezclan y el pH se controla con un medidor de pH hasta que se alcanza el pH deseado. Esto da un tampón de la
concentración deseada y con un pH tan cerca como el medidor de pH puede leer (usualmente ± 0,1 unidades de
pH en el uso general).
Una variación en la mezcla de soluciones equimolares de ácido y la base es para compensar un componente a la
concentración deseada (por ejemplo, la sal de fosfato a 10 mM) y titular con ácido concentrado (por ejemplo ácido
fosfórico) hasta que el pH deseado es
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alcanzado. Este tampón será más concentrada que la mezcla equimolar, pero el pH objetivo debe ser correcta
(dentro de los límites del medidor de pH).
Finalmente, el incorrecto técnica de preparación de tampón debería citarse. Esto es para ajustar el pH después de
que se añadió disolvente orgánico. Aunque es posible obtener una lectura de pH con disolvente orgánico presente
[5-7], no puede compararse directamente con las mediciones de pH acuosas, por lo que el valor numérico del pH
no es muy significativa. Esta técnica también es más susceptible a otros factores (por ejemplo,% -Organic,
temperatura) que los otros métodos de preparación de tampón y por lo tanto debe evitarse.
Aunque, para la mayoría de los métodos, no importará si se prepara tampón en peso, de mezcla
equimolar, o titulación con ácido concentrado, algunos métodos serán sensibles a las diferencias
sutiles. Por esta razón, es importante incluir una declaración de la técnica de preparación de búfer en
la documentación de un método.
precauciones
Para obtener consistentemente resultados de alta calidad, algunas técnicas deben practicarse rutinariamente. En primer
lugar, utilizan los mejores reactivos disponibles - la mayoría de los componentes del tampón están disponibles en grado
HPLC. pureza Buffer es más importante para las separaciones de gradiente de elución que los isocráticas. Algunos
problemas relacionados con reactivo se hacen más de un problema ya que los límites de detección se bajan. Esto se
ilustra en la Figura 5 [8]. Una forma de comprobar para impurezas es ejecutar una de no inyección, gradiente en blanco.
En el caso de la figura 5a, la línea de base mostró varios picos de más de 10 mUA. Para un ensayo con picos de 0,8 a 1
AU en el rango de tamaño, tal ruido sería de poco interés, pero para esta aplicación, la muestra contenida picos de 5-10
mUA que requerían la cuantificación. gradientes blanco sucio, como en la Figura 5a, típicamente apuntan a problemas
debidos a agua sucia o reactivos. Sin embargo, en este caso, el problema se aisló con el método de la preparación de
tampón. Si el pH se comprobó mediante la inmersión de la sonda medidor de pH en la fase móvil a granel, los resultados
de la Figura 5a eran típicas. Un procedimiento alternativo - extraer una alícuota de la fase móvil, comprobando su pH, y
después de descartar la alícuota - cedió el gradiente en blanco se muestra en la Figura 5b. Se puede ver que la sonda de
pH fue la fuente primaria de los picos adicionales en la ejecución de la figura 5a. Para recorridos máximos de
sensibilidad, particularmente en longitudes de onda UV de <220 nm, es una buena idea para evitar el contacto con la
fase móvil a granel con la sonda de pH. Un procedimiento alternativo - extraer una alícuota de la fase móvil,
comprobando su pH, y después de descartar la alícuota - cedió el gradiente en blanco se muestra en la Figura 5b. Se
puede ver que la sonda de pH fue la fuente primaria de los picos adicionales en la ejecución de la figura 5a. Para
recorridos máximos de sensibilidad, particularmente en longitudes de onda UV de <220 nm, es una buena idea para
evitar el contacto con la fase móvil a granel con la sonda de pH. Un procedimiento alternativo - extraer una alícuota de la fase móvil, comproban
Otra buena práctica utilizando tampones es siempre un filtrado del tampón después de que ha sido
preparado. Aunque el tampón puede ser químicamente puro, polvo, partículas de un revestimiento
botella-cap tampón erosionada, o precipitación de
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sales pueden estar presentes en el momento en la memoria intermedia se formula. Es una buena idea para filtrar el
tampón a través de un filtro de porosidad 0,5 micras antes de su uso.
Figura 5. Efecto de la contaminación pH-sonda de tampón.
gradientes en blanco con (a) tampón preparado en contacto con la sonda de pH; (B) ningún contacto con la sonda.
Adaptado de [8].
Los tampones son una buena fuente de nutrición para los microorganismos; es importante para evitar las condiciones
que apoyan el crecimiento microbiano. Lavar el depósito en lugar de rellenarlo. Establecer fechas de vencimiento
razonables para descartar búfer sin usar. Aunque es posible que pueda conseguir la estabilidad ya, muchos
laboratorios especifican una semana fechas de expiración de diluido (por ejemplo, <50 mM) tampón para evitar
problemas con el crecimiento microbiano.
tampones volátiles utilizados para LC-MS (por ejemplo, bicarbonato de amonio) es más probable que el cambio de pH
con el tiempo, debido a la pérdida por evaporación. Es una buena idea para compensar tales tampones sobre una base
diaria.
Lo mejor es que nunca se apagará un sistema de HPLC durante un tiempo prolongado (por ejemplo, más de unas
pocas horas) sin lavarse el búfer. Dejando tampón en un sistema de HPLC no utilizada puede resultar en la
precipitación tampón o el crecimiento microbiano dentro de la bomba u otros componentes. Cambiar a fase móvil de
agua / orgánico (por ejemplo sustituir 50/50 de tampón / MeOH con 50/50 de agua / MeOH) y al ras 10-20 ml través
del sistema para eliminar el tampón antes de un color fuerte-disolvente para eliminar retenido fuertemente el material
de la columna. Con las columnas de fase inversa, lavado con
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100% de agua no es una forma efectiva de eliminar el tampón - fases estacionarias muchos se someterá a
deshumectación (a veces llamado colapso de fase) con 100% de agua, derrotar el proceso de lavado. Sin embargo
o fases “acuosas altos” tipo “AQ” pueden ser eliminados con 100% de agua sin dewetting preocupaciones.
Resumen
• Los tampones se usan en separaciones RP-HPLC para controlar la retención de los compuestos ionizables. Por
lo general, nos gustaría suprimir la ionización de analitos con el fin de maximizar la retención de la muestra. Esto
significa que el pH de la fase móvil debe (idealmente) ser de al menos 2 unidades de pH por debajo o por encima
de la muestra
pag K un, para ácidos o bases, respectivamente.
• Para el almacenamiento en búfer más eficaz, un tampón se debe utilizar dentro de ± 1 unidad de pH del tampón
de pag K a. Estas características de la muestra y el tampón significa que la elección del tampón debe hacerse con
cuidado, usando las tablas 1 y 2 para orientación.
• Para los ensayos de LC-UV, tampones de fosfato y acetato son las más populares; la combinación de
etilo-fosfato puede cubrir la gama de 2 <pH <8, que se extiende por la estabilidad de la mayoría de las columnas
RP-HPLC.
• Para las aplicaciones de LC-MS, el tampón debe ser volátil, por lo que la elección de los tampones es
más limitada. Varias combinaciones de formiato, acetato, amoníaco, y bicarbonato (Tablas 1 y 2) son los
más populares para el trabajo de LC-MS.
• Para muchos métodos LC-UV y LC-MS, un pH bajo es más importante que la presencia de un tampón
verdad, así que 0,1% fosfórico (UV) o ácido fórmico (MS) se puede utilizar para satisfacer este requisito. La
actividad silanol bajo de las columnas actuales de alta pureza, además de bajas concentraciones de
moléculas de analito significan que los tampones de 5-10 mM en la fase móvil final son satisfactorios para la
mayoría de aplicaciones.
• Si fusiona fase móvil mediante la colocación de tampón en el A-depósito y disolvente orgánico en la B-depósito,
es una buena idea para mantener la concentración del tampón de menos de ≈ 25 mM para evitar la precipitación
cuando la memoria intermedia y el disolvente orgánico se mezclan. Algunos sistemas de HPLC son más
eficaces que otros en evitar la precipitación durante la mezcla. Una buena prueba de potencial para la
precipitación es añadir tampón gota a gota a un tubo de ensayo de disolvente orgánico (y viceversa) - si se
observa precipitación, diluir la memoria intermedia antes de tratar de tampón y disolvente orgánico en línea
mezclar.
• Finalmente, tener cuidado de evitar contaminantes, filtrado del tampón después de la preparación, y no dejar
tampones en un sistema cuando no esté en uso.
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referencias
1. DD Perrin y B. Dempsey, Tampones para el control del pH y de iones metálicos, John
Wiley, Nueva York (1974).
2. AP Schellinger y PW Carr, LCGC 22 ( 2004) 544-548.
3. LR Snyder, JJ Kirkland, y JL Glajch, Método HPLC práctica
Desarrollo, 2ª ed., Wiley-Interscience, Nueva York (1997).
4. http://www.bi.umist.ac.uk/users/mjfrbn/buffers/Makebuf.asp
5. GW Tindall, LCGC 22 ( 2002) 1028-1032.
6. GW Tindall, LCGC 22 ( 2002) 1114-1118.
7. GW Tindall, LCGC 23 ( 2003) 28-32.
8. MD Nelson y JW Dolan, LCGC dieciséis ( 1998) 992-996.
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John Dolan es mejor conocido por su mensual Solución de problemas LC en la columna
LCGC y LCGC Europa. Además de más de 250 entregas de su columna, Dr. Dolan ha publicado más de 100
documentos relacionados con HPLC. Sus áreas de interés son el desarrollo del método, la caracterización de
la columna y la elución de gradiente. Ha trabajado en todos los aspectos de HPLC de diseño de instrumentos,
a la escritura de software, a la gestión de un laboratorio contratado y para enseñar técnicas de HPLC.
Actualmente John es un director de Recursos LC, una empresa dedicada a la formación de los cromatógrafos y
la disponibilidad de consulta para problemas cromatográficos. Él comparte algo de su experiencia con nosotros
en esta guía para el uso del tampón. Para más información sobre los cursos impartidos por John puede
encontrarse en el sitio web de Recursos LC: www.LCResources.com
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