SEMANA 9 PRÁCTICA 9 BIOQUÍMICA
P-9: Determinación de glucosa en la sangre. Enzimática y Hemoglobina glicosilada. Valores
normales y patológicos.
DETERMINACION DE GLUCOSA EN SANGRE, FACTOR DE CALIBRACION
I. Generalidades:
Los hidratos de carbono desempeñan en los organismos vivo diversas funciones. Los
animales los emplean de preferencia como combustible para producir energía; cuando se
encuentra en exceso se almacena como un polisacárido el glucógeno o los convierten en
grasa para ser utilizados en el momento oportuno.
Luego de pasar por proceso digestivo y de absorción los monosacáridos sobre todo
la glucosa pasa al torrente sanguíneo para luego ser utilizada en forma adecuada por el
organismo por lo tanto es necesario llevar un control de los niveles de glucosa en sangre
ya que probables desviaciones de los rangos normales indicarían alguna alteración en el
organismo.
En la presente practica se demostrará lo necesario de determinar glicemia y de
conocer como cuantificar el factor de calibración para dicha determinación. Métodos:
Existen muchos métodos para determinar glucosa en sangre o cualquier fluido biológico.
Entre ellos citamos a Folin - Wu , Somogy - Nelson y el método enzimático de la glucosa
oxidasa.
Los métodos de Folin - Wu y Somogy - Nelson, tienen el siguiente fundamento: La
glucosa por poseer grupo aldehído en su molécula goza de poder reductor en medio
alcalino y en caliente sobre los iones cobre transformándolo en cuproso color rojo ladrillo;
el cual en presencia de ácido fosfomolíbdico da lugar a la formación de óxidos inferiores
de molibdeno de color azul.
II. Procedimiento:
1. Extracción y mantenimiento de la muestra ( sangre).-
La sangre total extraída es mezclada con un anticoagulante (oxalatos de sodio y potasio:
citrato, heparina, etc.) dejar en un lugar fresco.
2. Precipitación de las proteínas. - Obtención del filtrado libre de proteínas.
Medir 1 ml. De sangre total, añadir 1 ml. de ácido sulfúrico 2/3 N.
Mezclar bien por inversión del tubo tapando con el dedo, después que ha tomado un
color negro completamente, adicionar 1 ml. de tungsteno de sodio al 10%. Agitar bien
tapando con el dedo la parte libre del tubo hasta sonido metálico. Finalmente filtrar a
través de papel de filtro.
3. Formación del complejo coloreado.
Medir 1ml. del filtrado libre de proteínas (FLP) añadir 1ml. de solución cúprica alcalina
(Mezclar) y llevar a baño de agua hirviendo por 10 minutos. Dejar enfriar y luego
agregar 1 mil. de solución de ácido fosfomolíbdico. Agitar de vez en cuando durante 2
a 3 minutos y por último adicionar 7 mil. de agua destilada. Mezclar por inversión
(tapando el tubo con el dedo) y después de 10 minutos de reposo leer en el
fotocolorímetro con filtro azul (420 nm).
Determinación del factor de calibración de glucosa en sangre.
Solución Stock: Se usa dextrosa de alta pureza para preparar una solución Stock
pesando exactamente (balanza eléctrica) 1 gramo disolver en agua bidestilada y aforar
a 100 ml.
Cada ml. de solución contiene 10 mg. de dextrosa, guardar en refrigeración o
congelación.
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Soluciones Estándares de Trabajo:
Puede usarse varios estándares, en esta práctica solo se va a usar dos estándares con la
denominación Standard I y Standard II , el Standard I contiene por 1 ml = 0.10 mg de
dextrosa y el Standard II por 1 ml = 0.20 mg.
Técnica: A partir del filtrado libre de proteínas se arma el siguiente sistema :
COMPONENTES / TUBOS I II III IV
Agua destilada 1 ml. --- --- ---
Filtrado libre de proteínas --- 1ml. --- ---
Standard I --- --- 1ml. ---
Standard II --- --- --- 1ml.
Solución cúprica alcalina 1ml. 1ml. 1ml. 1ml.
Mezclar bien c/u de los tubos y luego llevar a baño de agua hirviendo por 10 minutos.
Enfriar
Agregar 1ml. de solución de ácido fosfomolíbdico a c/tubo, mezclar bien y finalmente añadir
7 ml. de agua bidestilada. Dejar reposo a T°del laboratorio por 10 minutos. Leer con filtro
azul (420 mu) en el fotocolorímetro.
Cálculos:
Obtención del factor de calibración
0.10 mg/dl
Cociente St. I = -----------------------------
Lect. St I - Lect. Blanco
0.20 mg/dl
Cociente St. II = ---------------------------
Lect. St II - Lect. Blanco
▪ Sacar promedio de los cocientes St I y St II y multiplicar por 1000.
▪ El factor está referido a decilitros (dl) o a 100 ml.
mg. de glucosa por 100 ml. de sangre = Factor x (Lectura de muestra - lect. blanco)
MÉTODO ENZIMATICO PARA LA DETERMINACION DE GLUCOSA EN SUERO O
SANGRE.
https://www.youtube.com/watch?v=0NqqS67uIMw
Determinación de glucosa en sangre
I. Significancia Clínica.
La patología más común relacionada con el metabolismo de los hidratos de carbono
es la diabetes mellitus. El diagnóstico precoz y el control de los pacientes diabéticos, tienen
por objeto evitar la cetoacidosis y las complicaciones de los síntomas resultantes de la
hiperglicemia, mediante el tratamiento adecuado.
Dado que existen múltiples factores causales de hiper o hipoglicemia, debe considerarse en
cada caso la condición fisiológica y/o la patología en el paciente en cuestión.
Fundamento Del Método.
La glucosa es oxidada enzimáticamente por la glucosa oxidasa (GOD; D-glucosa oxígeno 1-
óxidorreductasa; a ácido glucónico y agua oxigenada); el agua oxigenada en presencia de
peroxidasa (POD; donador: hidrógeno-peróxido óxidorreductasa); produce la copulación
oxidativa del fenol con la 4-amino fenazona (4-AF) dando lugar a la formación del fenol con
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la 4-aminofenazona(4-AF) dando lugar a la formación de un cromógeno rojo-cereza con
absorbancia máxima a 505 nm. El esquema reaccional es el sgte. :
GOD
Glucosa + O2 + H2O -----------→ Ácido glucónico + H2O 2
POD
2 H2O2 + 4-AF + fenol------→ 4-(p-benzoquinona-monoimino)-fenazona + 4 H2O
II. Reactivos Provistos:
▪ Standard: sol. de glucosa 1 g/l.
▪ GOD/POD: sol. de glucosa oxidasa (1000 U/ml) y peroxidasa (120 U/ml)
▪ Reactivo 4-AF.: sol. de 4-aminofenazona 25 mM en Buffers Tris 0.92 M.
▪ Reactivo Fenol: sol. de fenol 55 mmol/L.
Reactivo de Trabajo: de acuerdo al volumen de trabajo, colocar en una probeta 500 partes
de agua destilada, 50 partes de Reactivo de 4-AF, 50 partes de Reactivo de Fenol y llevar a
1000 partes con agua destilada. Agregar 3 partes de GOD/POD previamente
homogenizadas. Mezclar por inversión, sin agitar. Rotular y fechar. Pueden prepararse
distintas cantidades respetando las proporciones antedichas. Es importante además,
respetar el orden de agregado de los reactivos y asegurar una perfecta homogenización de
los mismos, a fin de que el Reactivo Fenol no deteriore el Reactivo de Trabajo. Mantener en
refrigerador (2-10ºC) y en frasco color caramelo es estable un mes a partir de la fecha de su
preparación.
III: Procedimiento
Muestra:
a) Recolección: se debe obtener suero o plasma de la manera usual. También es
posible realizar la determinación en líquido cefalorraquídeo.
b) Aditivos: en caso de que la muestra a emplear sea plasma, se recomienda el uso de
Anticoagulante G de Wiener lab. para su obtención
c) Sustancias interferentes conocidas: los sueros o plasmas con hemólisis visible o
intensa deben ser desproteinizados. Las muestras de líquido cefalorraquídeo
hemorrágicas deben ser centrifugadas antes de procesar. No se observan
interferencias por: bilirrubina hasta 200 mg/l, ácido ascórbico hasta 75 mg/l, ácido
úrico hasta 200 mg/l, hemólisis ligera.
Estabilidad e instrucción de almacenamiento: los hematíes y los leucocitos son los
responsables de la destrucción enzimática de la glucosa sanguínea, siendo máxima
a 37ºC, razón por la cual debe de centrifugarse la sangre dentro de las dos horas
posteriores a la extracción, hasta obtener un sobrenadante límpido y transferir a
otro tuvo para su conservación
Método:
En tres tubos de fotocolorímetro marcados B (Blanco), S (Standard) y D
(Desconocido), colocar:
B S D
Suero o Patrón - 10 ul. -
Muestra - - 10 ul.
Reactivo de Trabajo 1,0 ml. 1,0 ml. 1,0 ml.
Incubar 10 minutos en baño de agua a 37 ° C. Luego leer en Espectrofotómetro a 505
nm. o fotocolorímetro con filtro verde (490 –530 nm) llevando a cero con el Blanco.
▪ El color de reacción final es estable 1 hora por lo que la absorbancia debe ser leída
dentro de ese lapso.
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CALCULOS: 1.0 g/l
Glucosa g/l = D x f.F= ------------------
S
VALORES NORMALES: Suero o plasma 0.70 – 1.10 g/l.
HEMOGLOBINA GLICOSILADA (HbA1c)
https://www.youtube.com/watch?v=FklioG2U6AQ
Examen de sangre para la diabetes tipo 1, 2 y prediabetes. Mide el nivel promedio de glucosa
o azúcar en la sangre durante los últimos tres meses, y supervisar la eficacia del tratamiento
instaurado mantiene bajo control la diabetes.
La glucosa circula libre por la sangre hasta que pasa al interior de las células, pero no toda se
encuentra libre, parte unida a las proteínas.
Los GR, poseen una proteína llamada Hb, que transporta el oxígeno a las células, parte de
ella está unida a la glucosa (unión glucosa-proteína, glicosilación): Hb Glicosilada (HbA1c).
Cuanto más elevado sea el nivel de azúcar en sangre, mayor el valor del porcentaje de HbA1c,
y por lo tanto menor será el control del nivel de azúcar en sangre, lo que supone un riesgo
mayor de complicaciones de la diabetes.
La Hemoglobina A1 es la Hb modificada por la adición de glucosa en el residuo N - terminal
de las cadenas de globinas α y/o β de la Hb A, la Rx es lenta y no enzimática, formada por
tres componentes: Hb A1a, Hb A1b y Hb A1c, siendo esta última el principal componente
(aproximadamente el 80 % de la Hb A1).
La HbA1c es una fracción definida como Hb irreversiblemente glicada en uno o ambos
extremos N-terminal-valina de las cadenas β
Los dos pasos principales en la formación de HbA1c son:
a) Formación de base de Schiff entre la Hb y la glucosa (enlace aldimina), es reversible, lábil
o pre-HbA1c. No tiene utilidad diagnóstica.
b) Reordenamiento molecular de Amadori para constituir una forma estable (enlace
cetoamina). Esta forma estable es la HbA1c, la concentración es directamente proporcional a
la c.c. media de glucosa durante un período de tiempo de 60-120 días, equivalente a la V1/2
de los GR, proporcionando una información objetiva y fiable acerca del control de la glucosa
a largo plazo en pacientes diabéticos.
Se puede emplear la prueba HbA1c sola o en combinación con otras pruebas de diabetes para
hacer un diagnóstico, también para ver lo bien que se está manejando, es diferente a los
controles de azúcar en la sangre que las personas con diabetes se hacen todos los días.
Resultados:
Se entrega en porcentajes, más alto sea el porcentaje, mayor es el nivel de azúcar en la sangre:
V.N: 4.5 a 6%
Persona con diabetes está bien controlada cuando este valor está por debajo del 7%.
Un nivel de HbA1c normal es menor al 5,7%
Prediabetes entre 5,7 a 6,4%. También conocida como Glucosa alterada en ayunas, es un
factor de riesgo para desarrollar diabetes tipo 2 en el futuro, pueden necesitar repetir las
pruebas c/año.
La diabetes tipo 2 se ubica por encima del 6,5%, deben someterse a la prueba HbA1c por lo
menos dos veces al año, la meta es un porcentaje inferior a 7
Por encima del 8 % significa que la diabetes no está bien controlada, mayor riesgo de
desarrollar complicaciones relacionadas, es posible que tenga que cambiar el plan de cuidado
de la diabetes.
Para la mayoría de los adultos que tienen diabetes, un nivel de HbA1c del 7 % o menos
representa un objetivo normal del tratamiento.
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Se logra con lo que se denomina "cambio de estilo de vida", que consiste en una dieta
adecuada y un régimen de actividad física periódica, además de la medicación indicada, y
llevar a cabo los controles médicos.
Utilidad
La prueba de HbA1c al indicar el nivel promedio de azúcar en sangre en los últimos dos o
tres meses, puede ayudar para:
• Identificar prediabetes: mayor riesgo de desarrollar diabetes en un futuro,
importante para prevenir evolución a diabetes.
• Diagnosticar la diabetes tipo 1 y tipo 2. Para confirmar el diagnóstico de diabetes,
de acuerdo a la evaluación clínica se realice un diagnóstico presuntivo de diabetes y
requiera confirmar su diagnóstico.
• Realizar el control de seguimiento para evaluar el tratamiento instaurado. Los
resultados de las pruebas iniciales de HbA1c también ayudan a establecer el nivel de
HbA1c basal.
• Se repite de manera regular para hacer un seguimiento del plan del tratamiento para
la diabetes.
Puede mostrar qué tan bien funciona el plan de tratamiento para la diabetes a la hora de
disminuir el nivel de glicemia a lo largo del tiempo.
Frecuencia
Dependerá del: tipo de diabetes, plan de tratamiento y control nivel de glicemia.
La prueba de HbA1c se puede recomendar en los siguientes casos:
• Una vez al año, si tiene prediabetes
• Dos veces por año, si tiene diabetes tipo 2, no utilizas insulina y nivel de glicemia se
mantiene dentro del rango objetivo
• Cuatro veces por año, si tiene diabetes tipo 1
• Cuatro veces por año, si tiene diabetes tipo 2, utiliza insulina para controlarla o cuesta
mantener nivel de glicemia dentro del rango objetivo
Al cambiar tratamiento y medicamentos, debe realizarse la prueba.
La prueba de HbA1c es un análisis de sangre, se toma una muestra por punción venosa. No
se necesita ayuno, pero como normalmente la solicitud médica va acompañada de otras
determinaciones que, si lo requieren, se solicita un ayuno de 8 hs. durante las cuales se puede
beber agua, luego de la extracción puede retomar las actividades diarias normalmente.
Complicaciones
Es una enfermedad silente, donde el paciente no tiene síntomas, puede llevar en promedio
siete años en diagnosticarse, mientras que los daños se van produciendo. De allí la
importancia de realizar un diagnóstico temprano, para instaurar el tratamiento adecuado y
controlado, evitando la hiperglicemia crónica y poder realizar una vida normal, sin las graves
complicaciones tardías de la diabetes.
La Hiperglicemia crónica (valores elevados de glicemia mantenidos en el tiempo), es la causa
de las complicaciones de esta patología: microvasculares y macrovasculares de la diabetes,
que lleva a la disfunción de varios órganos, la mayoría irreversibles.
• Complicaciones Microvasculares:
o Ojos: Retinopatía diabética, principal causa de ceguera.
o Riñón: Nefropatía diabética, lleva a Insuficiencia Renal Crónica, diálisis,
trasplante renal.
o Nervios Periféricos: Neuropatía diabética, polineuropatía diabética.
• Complicaciones Macrovasculares:
o Cerebro - Circulación cerebral - Accidente Cerebrovascular (ACV),
Accidente Isquémico Transitorio
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o Corazón - Circulación coronaria - Enfermedad Cardiovascular (ECV): Infarto
Agudo de Miocardio
o Miembros Inferiores - Vasos sanguíneos - Enfermedad Vascular Periférica
o Píe - Píe Diabético, ulceras: causa de amputaciones.
Estimación del promedio de glucosa diaria
Método Hb1Ac enzimatic
Fundamentos del método: método enzimático en el cual muestras de sangre entera lisadas
son sometidas a una digestión proteica por medio de una proteasa. Este proceso libera
aminoácidos, incluyendo valinas glicadas de las cadenas beta de hemoglobina. Las valinas
glicadas actúan como sustratos de la enzima fructosil valina oxidasa (FVO). Esta enzima cliva
específicamente valinas N - terminales y genera peróxido de hidrógeno. Este último a su vez,
es cuantificado en una reacción catalizada por la peroxidasa (POD) en presencia de un
cromógeno. No es necesaria una medida separada de la hemoglobina total (Hb). Método
válido para concentraciones de Hb total en el rango de 9 g/dl a 21 g/dl.
Ventajas: Método simple, preciso y económico. Excelente correlación con métodos
tradicionales. Calibración del método simple a 2 puntos. Excelente proceso de control de
calidad con pre - tratamiento de muestra. Resultados en %HbA1c, sin necesidad de medir
Hb total.
Características del método: Sistema tri-reactivo, líquido y listo para usar.
Método enzimático directo.
Muestra: sangre anticoagulada con EDTA.
Calibrador y controles propios.
Adaptaciones disponibles a distintos autoanalizadores. Expresión de resultados en %HbA1c
de acuerdo al sistema Diabetes Control and Complication Trial (DCCT) / National
Glicosylation Standardization Program (NGSP).
Reactivos:
Reactivo A1 : buffer de Goods 5 mM, pH 7,0, Tritón X-100 0,5% y proteasas 4 kU/ml. A2 .
Reactivo A2 : buffer de Goods 1 mM, pH 6,3. B.
Reactivo B: buffer Tris 15 mM, pH 8,0, FVO > 10 U/mL, POD 90 U/mL y cromógeno 0,8 mM.
Muestra
Sangre entera anticoagulada
Tipo de reacción punto final
Long. de onda primaria 700 nm
Long. de onda secundaria 800 nm
Temperatura 37º C
Volumen de muestra 25 ul
Volumen de Reactivo A1-2 160 uL
Incubación de Reactivo 1-2 300 seg.
Volumen de Reactivo B 70 ul
Incubación de Reactivo B 180’’
Calibración 2 puntos
Calibradores 1 y 2Reactivos:
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a) Recolección: obtener la muestra de la manera usual.
b) Aditivos: se recomienda el uso de heparina o EDTA (Anticoagulante W de Wiener lab)
como anticoagulante.
c) Sustancias interferentes conocidas: no se observan interferencias por bilirrubina
(conjugada y no conjugada) hasta 40 mg/dL, triglicéridos hasta 13 g/L, ácido ascórbico
hasta 50 mg/dL y factor reumatoideo hasta 500 U/mL. Deberán interpretarse con cuidado
los valores de HbA1c obtenidos en aquellas patologías o situaciones que alteran la vida
media de los eritrocitos, como anemias hemolíticas, ane- mias ferropénicas, transfusiones,
pérdidas de sangre, etc. Referirse a las bibliografías de Young para los efectos de las drogas
y las enfermedades en el presente método.
d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la muestra es estable 3 días a
temperatura ambiente (15-25ºC), 7 días refrigerada (2-10ºC) o 6 meses congelada (-20ºC).
Sólo puede ser descongelada una vez.
Cuestionario
Responder y explicar lo siguiente:
1. Digestión de los carbohidratos
2. Ingreso a sangre de los carbohidratos
3. Transportadores
4. Distribución extra hepática
5. Primera vía de utilización de Glucosa, enzimas
6. Metabolismo de hemoglobina glicosilada
7. Que es un estándar?
8. Que es un factor?
9. Que es un blanco?
10. Cuando es hipoglicemia y hiperglicemia
