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UNE-EN ISO 19036-2020 Incertidumbre Alimentos

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Norma Española

UNE-EN ISO 19036

Julio 2020

Microbiología de la cadena alimentaria

Estimación de la incertidumbre de la medición para
determinaciones cuantitativas
(ISO 19036:2019)

Esta norma ha sido elaborada por el comité técnico

CTN 34 Productos alimentarios, cuya secretaría
desempeña FIAB.

Asociación Española
de Normalización
Génova, 6 - 28004 Madrid
915 294 900
[email protected]
www.une.org

Microbiología de la cadena alimentaria

Estimación de la incertidumbre de la medición para determinaciones cuantitativas
(ISO 19036:2019)

Microbiology of the food chain. Estimation of measurement uncertainty for quantitative

determinations (ISO 19036:2019).

Microbiologie de la chaîne alimentaire. Estimation de l'incertitude de mesure pour les déterminations

quantitatives (ISO 19036:2019).

Esta norma es la versión oficial, en español, de la Norma Europea EN ISO 19036:2019, que
a su vez adopta la Norma Internacional ISO 19036:2019.

Las observaciones a este documento han de dirigirse a:

Asociación Española de Normalización

Génova, 6
28004 MADRID-España
Tel.: 915 294 900
[email protected]
www.une.org

© UNE 2020
Prohibida la reproducción sin el consentimiento de UNE.
Todos los derechos de propiedad intelectual de la presente norma son titularidad de UNE.

Este documento ha sido adquirido por UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER a través de la suscripción a AENORmás.
Para uso en red interna se requiere de autorización previa de AENOR.
NORMA EUROPEA
EUROPEAN STANDARD
EN ISO 19036
NORME EUROPÉENNE
EUROPÄISCHE NORM Noviembre 2019

ICS 07.100.30

Versión en español

Microbiología de la cadena alimentaria

Estimación de la incertidumbre de la medición para determinaciones cuantitativas
(ISO 19036:2019)

Microbiology of the food chain. Microbiologie de la chaîne alimentaire. Mikrobiologie der Lebensmittelkette.
Estimation of measurement uncertainty Estimation de l'incertitude de mesure Feststellung von Messunsicherheiten
for quantitative determinations pour les déterminations quantitatives bei quantitativen Bestimmungen
(ISO 19036:2019). (ISO 19036:2019). (ISO 19036:2019).

Esta norma europea ha sido aprobada por CEN el 2019-09-21.

Los miembros de CEN están sometidos al Reglamento Interior de CEN/CENELEC que define las
condiciones dentro de las cuales debe adoptarse, sin modificación, la norma europea como norma
nacional. Las correspondientes listas actualizadas y las referencias bibliográficas relativas a estas
normas nacionales pueden obtenerse en el Centro de Gestión de CEN/CENELEC, o a través de sus
miembros.

Esta norma europea existe en tres versiones oficiales (alemán, francés e inglés). Una versión en otra
lengua realizada bajo la responsabilidad de un miembro de CEN en su idioma nacional, y notificada al
Centro de Gestión de CEN/CENELEC, tiene el mismo rango que aquéllas.

Los miembros de CEN son los organismos nacionales de normalización de los países siguientes:
Alemania, Austria, Bélgica, Bulgaria, Chipre, Croacia, Dinamarca, Eslovaquia, Eslovenia, España, Estonia,
Finlandia, Francia, Grecia, Hungría, Irlanda, Islandia, Italia, Letonia, Lituania, Luxemburgo, Malta,
Noruega, Países Bajos, Polonia, Portugal, Reino Unido, República Checa, República de Macedonia del
Norte, Rumanía, Serbia, Suecia, Suiza y Turquía.

COMITÉ EUROPEO DE NORMALIZACIÓN

European Committee for Standardization
Comité Européen de Normalisation
Europäisches Komitee für Normung
CENTRO DE GESTIÓN: Rue de la Science, 23, B-1040 Brussels, Belgium

© 2019 CEN. Derechos de reproducción reservados a los Miembros de CEN.

Índice

Prólogo europeo ........................................................................................................................... 6

Declaración ....................................................................................................................................6

Prólogo ............................................................................................................................................ 7

0 Introducción .................................................................................................................. 9

1 Objeto y campo de aplicación................................................................................. 10

2 Normas para consulta .............................................................................................. 11

3 Términos, definiciones y símbolos ....................................................................... 11

3.1 Términos y definiciones .......................................................................................... 11
3.2 Símbolos....................................................................................................................... 14

4 Consideraciones generales ..................................................................................... 15

5 Incertidumbre técnica ............................................................................................. 16

5.1 Identificación de las fuentes principales de incertidumbre.......................... 16
5.1.1 Aspectos generales.................................................................................................... 16
5.1.2 Incertidumbre de la toma de muestras ............................................................... 17
5.1.3 Sesgo ............................................................................................................................. 17
5.1.4 Factores críticos ......................................................................................................... 18
5.2 Estimación de la incertidumbre técnica ............................................................. 18
5.2.1 Aspectos generales.................................................................................................... 18
5.2.2 Desviación típica de la reproducibilidad procedente de experimentos
intralaboratorio, sIR ................................................................................................... 18
5.2.3 Desviación típica de la reproducibilidad procedente de estudios
interlaboratorios ....................................................................................................... 25

6 Incertidumbre de la matriz .................................................................................... 26

6.1 Aspectos generales.................................................................................................... 26
6.2 Situación de una muestra de laboratorio (o de ensayo) homogénea ......... 27
6.3 Múltiples porciones de ensayo a partir de las muestras de
laboratorio .................................................................................................................. 28
6.4 Características conocidas de la matriz ................................................................ 29

7 Incertidumbre de la distribución.......................................................................... 30
7.1 Aspectos generales.................................................................................................... 30
7.2 Técnica de recuento de colonias. Incertidumbre de Poisson ........................ 30
7.3 Técnica de recuento de colonias. Incertidumbre de la confirmación ......... 31
7.4 Incertidumbre del número más probable .......................................................... 33

8 Incertidumbre combinada y expandida .............................................................. 33

8.1 Incertidumbre típica combinada .......................................................................... 33
8.1.1 Consideraciones generales ..................................................................................... 33
8.1.2 Incertidumbre típica combinada basada en las incertidumbres
técnicas, de la matriz y de la distribución por separado ................................ 33
8.1.3 Incertidumbre típica combinada basada exclusivamente en la
desviación típica de la reproducibilidad ............................................................ 34

8.2 Incertidumbre expandida ....................................................................................... 34

8.3 Ejemplos desarrollados ........................................................................................... 35
8.3.1 Ejemplo 1. Componentes de Poisson, de la matriz y técnicos de la
incertidumbre ............................................................................................................ 35
8.3.2 Ejemplo 2. Componente de Poisson despreciable ............................................ 35
8.3.3 Ejemplo 3. Componente de Poisson, de la matriz y de confirmación .......... 36
8.3.4 Ejemplo 4. Componentes del número más probable, de la matriz y
técnico .......................................................................................................................... 36

9 Expresión de la incertidumbre de la medición en los informes de

ensayo ........................................................................................................................... 37
9.1 Aspectos generales.................................................................................................... 37
9.2 Resultados inferiores al límite de cuantificación ............................................. 38
9.2.1 Aspectos generales.................................................................................................... 38
9.2.2 Ejemplo......................................................................................................................... 39

Anexo A (Informativo) Cálculo de las desviaciones típicas con dos o más de

dos porciones de ensayo (desviación típica de la
reproducibilidad intralaboratorio y desviación
típica de la incertidumbre de la matriz) ............................. 41

Anexo B (Informativo) Efecto de la matriz e incertidumbre de la matriz ............. 46

Anexo C (Informativo) Variabilidad intrínseca (incertidumbre típica) de

las estimaciones del número más probable ...................... 48

Anexo D (Informativo) Corrección de las desviaciones típicas

experimentales en base a componentes de
incertidumbre no deseados ................................................... 50

Bibliografía .................................................................................................................................. 54

Prólogo europeo

El texto de la Norma EN ISO 19036:2019 ha sido elaborado por el Comité Técnico ISO/TC 34 Productos
alimenticios en colaboración con el Comité Técnico CEN/TC 463 Microbiología de la cadena alimentaria,
cuya Secretaría desempeña AFNOR.

Esta norma europea debe recibir el rango de norma nacional mediante la publicación de un texto
idéntico a ella o mediante ratificación antes de finales de mayo de 2020, y todas las normas nacionales
técnicamente divergentes deben anularse antes de finales de mayo de 2020.

Se llama la atención sobre la posibilidad de que algunos de los elementos de este documento estén
sujetos a derechos de patente. CEN no es responsable de la identificación de dichos derechos de patente.

De acuerdo con el Reglamento Interior de CEN/CENELEC, están obligados a adoptar esta norma europea
los organismos de normalización de los siguientes países: Alemania, Austria, Bélgica, Bulgaria, Chipre,
Croacia, Dinamarca, Eslovaquia, Eslovenia, España, Estonia, Finlandia, Francia, Grecia, Hungría, Irlanda,
Islandia, Italia, Letonia, Lituania, Luxemburgo, Malta, Noruega, Países Bajos, Polonia, Portugal, Reino
Unido, República Checa, República de Macedonia del Norte, Rumanía, Serbia, Suecia, Suiza y Turquía.

Declaración

El texto de la Norma ISO 19036:2019 ha sido aprobado por CEN como Norma EN ISO 19036:2019 sin
ninguna modificación.

Prólogo

ISO (Organización Internacional de Normalización) es una federación mundial de organismos

nacionales de normalización (organismos miembros de ISO). El trabajo de elaboración de las Normas
Internacionales se lleva a cabo normalmente a través de los comités técnicos de ISO. Cada organismo
miembro interesado en una materia para la cual se haya establecido un comité técnico, tiene el derecho
de estar representado en dicho comité. Las organizaciones internacionales, gubernamentales y no
gubernamentales, vinculadas con ISO, también participan en el trabajo. ISO colabora estrechamente con
la Comisión Electrotécnica Internacional (IEC) en todos los temas de normalización electrotécnica.

En la Parte 1 de las Directivas ISO/IEC se describen los procedimientos utilizados para desarrollar este
documento y aquellos previstos para su mantenimiento posterior. En particular debería tomarse nota
de los diferentes criterios de aprobación necesarios para los distintos tipos de documentos ISO. Este
documento ha sido redactado de acuerdo con las reglas editoriales de la Parte 2 de las Directivas ISO/IEC
(véase www.iso.org/directives).

Se llama la atención sobre la posibilidad de que algunos de los elementos de este documento puedan
estar sujetos a derechos de patente. ISO no asume la responsabilidad por la identificación de alguno o
todos los derechos de patente. Los detalles sobre cualquier derecho de patente identificado durante el
desarrollo de este documento se indicarán en la Introducción y/o en la lista ISO de declaraciones de
patente recibidas (véase www.iso.org/patents).

Cualquier nombre comercial utilizado en este documento es información que se proporciona para
comodidad del usuario y no constituye una recomendación.

Para una explicación de la naturaleza voluntaria de las normas, el significado de los términos específicos
de ISO y las expresiones relacionadas con la evaluación de la conformidad, así como la información
acerca de la adhesión de ISO a los principios de la Organización Mundial del Comercio (OMC) respecto a
los Obstáculos Técnicos al Comercio (OTC), véase www.iso.org/iso/foreword.html.

Este documento ha sido elaborado por el Comité Técnico ISO/TC 34, Productos alimenticios, Subcomité
SC 9, Microbiología.

Esta primera edición anula y sustituye a la Especificación Técnica ISO/TS 19036:2006, que ha sido
revisada técnicamente. También incorpora la modificación de la Especificación Técnica
ISO/TS 19036:2006/A1:2009. Los principales cambios respecto a la edición anterior son los siguientes:

– se han realizado unas disposiciones sobre la estimación de la incertidumbre técnica, así como de
otras fuentes de incertidumbre relevantes asociadas a los ensayos microbiológicos cuantitativos,
relacionadas con:

– la incertidumbre asociada a la matriz (es decir, la incertidumbre ocasionada por la dispersión de

los microorganismos dentro de la matriz ensayada),

– la incertidumbre de Poisson relacionada con las técnicas de recuento de colonias,

– la incertidumbre de la confirmación, asociada a los ensayos utilizados para confirmar la identidad

de organismos específicos después de un recuento de organismos presuntivos,

– la incertidumbre asociada a las estimaciones del número más probable (NMP),

– se ha descrito el diseño experimental para la estimación de la desviación típica de la reproducibilidad

intralaboratorio descrita en este documento, asociada a la incertidumbre técnica, ahora es igual al
diseño descrito en la Norma ISO 16140-3 para la verificación de los métodos cuantitativos;

– se han añadido ejemplos desarrollados para mostrar las formas en las que se deberían calcular y
expresar las estimaciones de incertidumbre;

– se han añadido anexos para proporcionar los detalles de algunos de los procedimientos importantes
o alternativos, y de los problemas asociados a la estimación de la incertidumbre.

Cualquier comentario o pregunta sobre este documento deberían dirigirse al organismo nacional de
normalización del usuario. En www.iso.org/members.html se puede encontrar un listado completo de
estos organismos.

0 Introducción
El término “incertidumbre de la medición” (MU; del inglés Measurement Uncertainty) se utiliza para
indicar la falta de exactitud (veracidad y precisión) que se puede asociar con los resultados de un
análisis. En el contexto de la microbiología cuantitativa, proporciona una indicación del grado de
confianza que se puede depositar en una estimación del número de microorganismos presentes en un
alimento o en otros materiales.

La Guía ISO/IEC 98-3 (también conocida como “GUM”) es un documento de referencia ampliamente
adoptado. El enfoque principal de la Guía ISO/IEC 98-3 es construir un modelo de medición matemático
o computacional que describa cuantitativamente la relación entre la magnitud medida (el mensurando)
y cualquier magnitud de la que dependa (las magnitudes de entrada). El modelo de medición se utiliza
posteriormente para deducir la incertidumbre del mensurando a partir de las incertidumbres de las
magnitudes de entrada.

La Guía ISO/IEC 98-3 reconoce que podría no ser factible establecer una relación matemática completa
entre el mensurando y las magnitudes de entrada inviduales y que, en esos casos, el efecto de varias
magnitudes de entrada puede evaluarse de forma conjunta. La Norma ISO/IEC 17025 también reconoce
que la naturaleza de los métodos de ensayo puede impedir un cálculo riguroso de la incertidumbre de
la medición.

En el caso de los análisis microbiológicos de muestras procedentes de la cadena alimentaria, no resulta

factible construir un modelo cuantitativo de medición global, ya que no es posible cuantificar con
exactitud la participación de cada magnitud de entrada, donde:

– el analito es un microorganismo vivo, cuyo estado fisiológico puede ser muy variable;

– la diana analítica abarca diferentes cepas, diferentes especies o diferentes géneros;

– muchas magnitudes de entrada resultan muy difíciles, si no imposibles, de cuantificar (por ejemplo,
el estado fisiológico);

– en muchas magnitudes de entrada (por ejemplo, la temperatura o la actividad del agua) su efecto
sobre el mensurando no se puede describir cuantitativamente con la precisión adecuada.

Por las razones indicadas anteriormente, este documento utiliza principalmente una estrategia desde
arriba-hacia-abajo o global sobre la MU, en la cual la participación de la mayoría de las magnitudes de
entrada se estima en forma de desviación típica de la reproducibilidad del resultado final del proceso de
medición, calculada a partir de los resultados experimentales mediante réplicas de análisis idénticos
realizados como parte del proceso de medición. Dichas magnitudes reflejan la variabilidad experimental
que resulta en una incertidumbre técnica. Por lo general, en la microbiología cuantitativa de la cadena
alimentaria no se suele disponer de valores de cantidades de referencia o de valores asignados, de forma
que no se puede estimar con confianza el sesgo (que expresa de forma cuantitativa la falta de veracidad)
y no se incluye en la incertidumbre estimada mediante el uso de este documento.

Pese a que la reproducibilidad proporciona una estimación general de la incertidumbre asociada con el
método de medición, podría no reflejar las características asociadas con la incertidumbre asociada a la
matriz, que procede de la distribución de los microorganismos en la matriz alimentaria.

Además, las determinaciones microbiológicas suelen basarse en el recuento o la detección de números

bastante reducidos de organismos que se distribuyen de una manera más o menos aleatoria, lo cual
ocasiona una variabilidad intrínseca entre las réplicas y su correspondiente incertidumbre asociada a la
distribución. En el caso de las técnicas de recuento de colonias, se determina la incertidumbre de
Poisson, a la cual puede añadirse, en ciertos casos, una incertidumbre asociada a los ensayos de confir-
mación realizados para identificar organismos aislados. También se requiere añadir un componente
adicional de incertidumbre en las determinaciones del número más probable (NMP). Los componentes
de la incertidumbre de la distribución más relevantes se calculan a partir de los datos experimentales
individuales utilizando una estimación basada en la teoría estadística.

Estos tres tipos diferentes de incertidumbre (incertidumbre técnica, de la matriz y de la distribución) se

combinan utilizando los principios de la Guía ISO/IEC 98-3. Este enfoque es similar al que sigue la Norma
ISO 29201 en el ámbito de la microbiología del agua.

La incertidumbre técnica suele ser la mayor de los tres tipos y se estima utilizando una desviación típica
de la reproducibilidad, la cual incluye inevitablemente alguna contribución de los otros dos tipos. La
estimación preferible de la incertidumbre técnica se basa en la reproducibilidad intralaboratorio, en el
mismo sentido que en la Norma ISO 16140-3. Si es coherente con los protocolos del laboratorio y con
los requisitos del cliente, puede emitirse un valor general de incertidumbre basado solamente en la
desviación típica de la reproducibilidad.

1 Objeto y campo de aplicación

Este documento describe los requisitos y da directrices para la estimación y la expresión de la
incertidumbre de la medición (MU) asociada a los resultados cuantitativos en el ámbito de la micro-
biología de la cadena alimentaria.

Resulta aplicable para el análisis cuantitativo de:

– productos destinados al consumo humano o la alimentación animal;

– muestras ambientales recogidas del área de producción y manipulación de los alimentos;

– muestras procedentes de la etapa de producción primaria.

Normalmente, los análisis cuantitativos se realizan por recuento de microorganismos utilizando una
técnica de recuento de colonias. Este documento también resulta aplicable de forma general para otros
análisis cuantitativos, incluyendo:

– las técnicas basadas en el número más probable (NMP);

– los métodos instrumentales como la impediometría, las técnicas basadas en adenosín trifosfato
(ATP) y la citometría de flujo;

– los métodos de biología molecular como los basados en la reacción en cadena de la polimerasa de
tipo cuantitativo (qPCR).

La incertidumbre estimada mediante este documento no incluye efectos sistemáticos (sesgos).

2 Normas para consulta

No hay normas para consulta en este documento.

3 Términos, definiciones y símbolos

3.1 Términos y definiciones

Para los fines de este documento, se aplican los términos y definiciones siguientes

ISO e IEC mantienen bases de datos terminológicas para su utilización en normalización en las siguientes
direcciones:

– Plataforma de búsqueda en línea de ISO: disponible en http://www.iso.org/obp

– Electropedia de IEC: disponible en http://www.electropedia.org/

3.1.1 muestra:
<general> Uno o más artículos (o una proporción de material) seleccionados de alguna forma de una
población (o de una cantidad grande de material) cuyo objetivo es proporcionar una información
representativa de la población y, posiblemente, servir de base para la toma de decisiones sobre la
población o sobre el proceso que la ha producido.

[FUENTE: Apartado 3.2.2 de la Especificación Técnica ISO/TS 17728:2015, modificado – Se ha eliminado

la Nota 1]

3.1.2 muestra de laboratorio:

Muestra (3.1.1)preparada para su envío al laboratorio y destinada a su inspección o análisis.

[FUENTE: Apartado 3.1 de la Norma ISO 6887-1:2017]

3.1.3 muestra de ensayo:

Muestra (3.1.1) preparada a partir de la muestra de laboratorio (3.1.2) conforme al procedimiento
descrito en el método de análisis y de la cual se recogen las porciones de ensayo (3.1.4).

NOTA 1 En los exámenes microbiológicos es poco frecuente que la preparación de la muestra de laboratorio se realice antes
de recoger la porción de ensayo.

[FUENTE: Apartado 3.4 de la Norma ISO 6887-1:2017]

3.1.4 porción de ensayo:

Muestra (3.1.1) representativa medida (masa o volumen) que se recoge de la muestra de laboratorio
(3.1.2) que se utiliza para preparar la suspensión inicial.

NOTA 1 En algunos casos, se necesita preparar la muestra de laboratorio antes de recoger la porción de ensayo, aunque es
poco frecuente en los exámenes microbiológicos.

[FUENTE: Apartado 3.5 de la Norma ISO 6887-1:2017]

3.1.5 mensurando:
Magnitud particular sometida a medición.

[FUENTE: Apartado B.2.9 de la Guía ISO/IEC 98-3:2008, modificado – se han eliminado el ejemplo y la
Nota 1]

3.1.6 veracidad; veracidad de medida:

Grado de concordancia entre la media de un número infinito de valores medidos repetidos y un valor de
referencia.

NOTA 1 La veracidad de medida no es una cantidad y no puede expresarse numéricamente, aunque la Norma ISO 5725 (todas
sus partes) especifica formas de expresar dicho grado de concordancia.

NOTA 2 La veracidad de medida está inversamente relacionada con el error sistemático, pero no está relacionada con el error
aleatorio.

NOTA 3 No debería utilizarse el término “exactitud de medida” en lugar de “veracidad de medida” y viceversa.

[FUENTE: Apartado 2.14 de la Guía ISO/IEC 99:2007, modificado – el término recomendado se ha

modificado de “veracidad de medida” a “veracidad”]

3.1.7 sesgo; sesgo de la medida:

Valor estimado de un error sistemático.

[FUENTE: Apartado 2.18 de la Guía ISO/IEC 99:2007, modificado – el término recomendado se ha

modificado de “sesgo de la medida” a “sesgo”]

3.1.8 reproducibilidad intralaboratorio; precisión intermedia:

Grado de concordancia entre los resultados de ensayos obtenidos con el mismo método, con idénticos o
similares materiales de ensayo, en el mismo laboratorio, con diferentes operadores, usando equipa-
miento distinto.

[FUENTE: Apartado 3.6 de la Norma ISO 8199:2018]

3.1.9 incertidumbre de la medición, MU:

Parámetro asociado al resultado de una medida que caracteriza la dispersión de los valores que podrían
ser razonablemente atribuidos al mensurando (3.1.5).

NOTA 1 El parámetro puede ser, por ejemplo, una desviación típica (o múltiplo de ella) o la semi amplitud de un intervalo con
un nivel de confianza determinado.

NOTA 2 La incertidumbre de la medición comprende, en general, varios componentes. Algunas pueden evaluarse a partir de
la distribución estadística de los resultados de series de mediciones, y pueden caracterizarse por sus desviaciones
típicas experimentales. Las otras componentes, que también pueden caracterizarse por desviaciones típicas, se
evalúan asumiendo distribuciones de probabilidad, basadas en la experiencia o en otras informaciones.

NOTA 3 Se entiende que el resultado de la medición es la mejor estimación del valor del mensurando y que todas las compo-
nentes de la incertidumbre, comprendidos los que provienen de efectos sistemáticos, tales como las componentes
asociadas a las correcciones y a los patrones de referencia, contribuyen a la dispersión.

[FUENTE: Apartado 2.2.3 de la Guía ISO/IEC 98-3:2008, modificado – el término recomendado se ha

modificado de “medida de la incertidumbre” a “incertidumbre de la medición”]

3.1.10 incertidumbre típica, u:

Incertidumbre del resultado de una medición, expresada en forma de desviación típica.

[FUENTE: Apartado 2.3.1 de la Guía ISO/IEC 98-3:2008, modificado – se ha añadido el símbolo]

3.1.11 incertidumbre típica combinada, uc(y):

Incertidumbre típica (3.1.10) del resultado de una medición, cuando el resultado se obtiene a partir de
los valores de otras magnitudes, igual a la raíz cuadrada positiva de una suma de términos, siendo estos
las varianzas o covarianzas de esas otras magnitudes, ponderadas en función de la variación del
resultado de medida con la variación de dichas magnitudes.

[FUENTE: Apartado 2.3.4 de la Guía ISO/IEC 98-3:2008, modificado – se ha añadido el símbolo]

3.1.12 incertidumbre expandida, U:

Magnitud que define un intervalo entorno al resultado de una medición, y en el que se espera encontrar
una fracción importante de la distribución de valores que podrían ser atribuidos razonablemente al
mensurando (3.1.5).

NOTA 1 La fracción puede entenderse como la probabilidad o el nivel de confianza del intervalo.

NOTA 2 Para asociar un nivel específico de confianza a un intervalo definido por la incertidumbre expandida, se requieren
hipótesis implícitas o explícitas sobre la distribución de la probabilidad representada por el resultado de la medida y
su incertidumbre típica combinada (3.1.11). El nivel de confianza que puede atribuirse a este intervalo posee la misma
validez que las hipótesis realizadas.

NOTA 3 La incertidumbre expandida U se calcula a partir de la incertidumbre típica uc(y) y un factor de cobertura k (3.1.13)
de la siguiente forma:

U = k  uc(y)

[FUENTE: Apartado 2.3.5 de la Guía ISO/IEC 98-3:2008, modificado – se ha añadido el símbolo y se ha

sustituido la Nota 3]

3.1.13 factor de cobertura, k:

Factor numérico utilizado como multiplicador de la incertidumbre típica combinada (3.1.11), para
obtener la incertidumbre expandida (3.1.12).

[FUENTE: Apartado 2.3.6 de la Guía ISO/IEC 98-3:2008, modificado – se ha añadido el símbolo y se ha

modificado el texto de la definición]

3.1.14 incertidumbre técnica:

Incertidumbre que resulta de la variabilidad experimental asociada a las etapas técnicas del procedi-
miento analítico.

NOTA 1 La incertidumbre técnica incluye la variabilidad asociada a la toma, mezcla y dilución de la porción de ensayo (3.1.4)
toma de la muestra de laboratorio (3.1.2) para preparar la suspensión inicial y sus diluciones adicionales. También
incluye los efectos de la variabilidad en los medios y en las incubaciones.

NOTA 2 Adaptado del apartado 3.4.2 de la Norma ISO 29201:2012.

3.1.15 incertidumbre de la matriz:

Incertidumbre que resulta del grado en el que la porción de ensayo (3.1.4) no es verdaderamente
representativa de la muestra de laboratorio (3.1.2).

3.1.16 incertidumbre de la distribución:

Incertidumbre que resulta de la variabilidad intrínseca asociada a la distribución de los microorga-
nismos en la muestra (3.1.1), la suspensión inicial y las diluciones adicionales.

NOTA 1 En las suspensiones microbiológicas, la variabilidad intrínseca suele seguir un modelo de distribución de Poisson.
Cuando se realiza una confirmación parcial o se utiliza el principio del NMP, la distribución resultante puede apartarse
de una distribución de Poisson.

NOTA 2 Adaptado del apartado 3.4.3 de la Norma ISO 29201:2012.

3.2 Símbolos
Para los objetivos de este documento, se aplican los siguientes símbolos.

C en los métodos de recuento de colonias, número total de colonias contadas utilizadas

para calcular los resultados de la medición

np, nc en los métodos de recuento de colonias con confirmación parcial, número de colonias
presuntivas analizadas, y número de colonias confirmadas, respectivamente

sR desviación típica de la reproducibilidad

sIR desviación típica de la reproducibilidad intralaboratorio

sIR:corr desviación típica de la reproducibilidad intralaboratorio, corregida por eliminación de

componentes de la distribución y de la matriz

sr desviación típica de la repetibilidad

sr:corr desviación típica de la repetibilidad, corregida por eliminación de componentes de la

distribución

Sno_deseado suma de los cuadrados de los componentes no deseados

u incertidumbre típica

udistrib incertidumbre típica de la distribución

utécn incertidumbre típica técnica

uconf incertidumbre típica de la confirmación

umatriz incertidumbre típica de la matriz

uNMP incertidumbre típica del número más probable

uno_deseado incertidumbre típica del componente no deseado

uPoisson incertidumbre típica de la distribución de Poisson

uc(y) incertidumbre típica combinada (de la estimación del resultado)

k factor de cobertura

U incertidumbre expandida (de la estimación del resultado) = k  uc(y)

4 Consideraciones generales
La MU asociada con el valor de cualquier medición incluye múltiples componentes.

Como se indica en el objeto y campo de aplicación (véase el capítulo 1), la incertidumbre estimada con
este documento no incluye las contribuciones de los efectos sistemáticos (sesgos). En la microbiología
cuantitativa de la cadena alimentaria, no se suele disponer de valores de cantidades de referencia o
valores asignados, de forma que el sesgo no se puede estimar con confianza.

Este documento considera tres tipos diferentes de componentes de la incertidumbre:

– la incertidumbre técnica;

– la incertidumbre de la matriz;

– la incertidumbre de la distribución.

La incertidumbre técnica procede de la variabilidad experimental y se estima, utilizando una estrategia

global, a partir de una desviación típica de la reproducibilidad del resultado final del proceso de medi-
ción (véase el capítulo 5). Esta estrategia global supone que la estimación de la incertidumbre técnica
procede del resultado final del ensayo en lugar del cálculo basado en la estimación de las incertidumbres
de cada etapa individual del ensayo.

La incertidumbre de la matriz procede de que la mezcla de la muestra de laboratorio no es perfecta, lo

cual resulta en una baja reproducibilidad de los niveles de microorganismos entre porciones de ensayo;
puede ser grande en el caso de las matrices sólidas y en especial en los productos alimenticios com-
puestos. La estimación de la incertidumbre de la matriz se realiza para cada tipo de matriz (véase el
capítulo 6).

Incluso en el caso de los materiales homogéneos, la distribución aleatoria de los microorganismos

ocasiona la incertidumbre de la distribución (véase el capítulo 7), de la cual se consideran en este
documento tres tipos posibles. La relevancia de cada uno depende del método utilizado:

– para las técnicas de recuento de colonias:

– la incertidumbre de Poisson (véase 7.2);

– la incertidumbre de la confirmación (véase 7.3);

– para las técnicas de NMP: la incertidumbre del NMP (véase 7.4).

La incertidumbre de cada una de las fuentes de incertidumbre de la distribución se estima matemá-

ticamente.

Este documento presenta dos opciones para estimar la incertidumbre combinada de una medición
obtenida.

a) Los componentes de la incertidumbre técnica, de la matriz y de la distribución para un valor

obtenido se pueden estimar por separado unas de la otras (véanse los capítulos 5, 6 y 7), después
de lo cual los tres componentes se combinan (véase 8.1.2).

b) Puede emitirse un valor general de incertidumbre basado exclusivamente en la desviación típica de

una reproducibilidad, si es coherente con los protocolos del laboratorio y los requisitos del cliente
(véase 8.1.3). En realidad, la incertidumbre técnica suele ser el componente mayoritario de los tres
componentes de incertidumbre.

5 Incertidumbre técnica

5.1 Identificación de las fuentes principales de incertidumbre

5.1.1 Aspectos generales

Puede resultar útil considerar las fuentes de incertidumbre técnica asociadas habitualmente con las
etapas principales de un método microbiológico. Las fuentes más típicas en las técnicas de recuento de
colonias o de NMP son:

– la toma de una porción de ensayo a partir de la muestra de laboratorio (o de ensayo);

– la preparación de la suspensión inicial;

– la dilución seriada;

– la inoculación;

– la incubación;

– el recuento de colonias en una técnica de recuento de colonias y/o de detección del crecimiento
(como en la técnica de NMP);

– la confirmación (si corresponde).

La figura 1 muestra las principales fuentes de incertidumbre asociadas a la microbiología de la cadena

alimentaria consideradas en este documento.

Leyenda
Procedimientos secuenciales
Factores que afectan a la estimación de la incertidumbre

Factores que no se consideran en este documento

Figura 1 – Principales fuentes de incertidumbre asociadas a la microbiología de la cadena

alimentaria consideradas en este documento

5.1.2 Incertidumbre de la toma de muestras

La incertidumbre de la toma de muestras, es decir, el error asociado con la recogida de la muestra de
laboratorio a partir de un lote sometido a examen puede contribuir de forma significativa al error
global[18], pero no forma parte de la incertidumbre asociada a la propia medición y no queda
contemplada por este documento.

La incertidumbre de la matriz, que procede de la incapacidad de la porción de ensayo de representar

perfectamente a una muestra de ensayo o una muestra de laboratorio heterogénea está contemplada en
el capítulo 6. El grado de esta falta de capacidad puede depender del tamaño de la porción de ensayo
tomada para su examen (véase la Norma ISO 6887-1).

5.1.3 Sesgo
Como se indica en los capítulos 1 y 4, la MU estimada por este documento no incluye las contribuciones
procedentes de los efectos sistemáticos que conforman el sesgo.

5.1.4 Factores críticos

Algunos ejemplos de factores técnicos críticos que pueden influir sobre la incertidumbre y necesitan
controlarse incluyen: la procedencia y el tipo de los medios de cultivo y/o de otros reactivos (como los
utilizados para la confirmación), la dilución, los procedimientos de inoculación e incubación, las técnicas
de recuento (manuales o automáticas), los cambios de analista o de grupo de analistas, etc.

5.2 Estimación de la incertidumbre técnica

5.2.1 Aspectos generales

La incertidumbre técnica se estima a partir de la desviación típica de la reproducibilidad, sR, asociada al
resultado final del proceso de medición. De esta forma, la incertidumbre técnica es una característica
del método y la incertidumbre técnica estimada para un método no puede aplicarse sobre otros
métodos.

Debería realizarse una estimación continua de la MU para asegurar que la incertidumbre sigue vigente
y que los resultados del ensayo están bajo control. Debe realizarse una reevaluación de la estimación de
la MU siempre que se realice un cambio en cualquier factor (crítico) (véanse 5.1.1 y 5.1.4) que con
probabilidad invluye de forma significativa sobre los resultados obtenidos con dicho método.

En este documento aparecen tres posibilidades distintas de estimación de la desviación típica de la

reproducibilidad. Se basan en la repetición de mediciones realizadas sobre un material teóricamente
idéntico. El orden de preferencia es el siguiente:

– opción 1: reproducibilidad intralaboratorio, es decir, la reproducibilidad estimada dentro de un

mismo laboratorio (véase 5.2.2);

– opción 2: reproducibilidad procedente de los resultados de un estudio interlaboratorios de vali-

dación del método (véase 5.2.3.1);

– opción 3: reproducibilidad procedente de los resultados de un ensayo de aptitud (EA) interlabo-

ratorios (EA) (véase 5.2.3.2).

5.2.2 Desviación típica de la reproducibilidad procedente de experimentos intralaboratorio, sIR

5.2.2.1 Aspectos generales

La opción 1, de la reproducibilidad intralaboratorio, es la opción preferida para deducir la MU técnica
ya que permite al laboratorio asociar el valor de MU con el resultado que emite, en concordancia con la
definición de MU.

El protocolo experimental descrito en este capítulo debería tener en cuenta el mayor número posible
las fuentes de incertidumbre identificadas en él (véase 5.1).

5.2.2.2 Protocolo experimental

5.2.2.2.1 Aspectos generales

El protocolo para analizar exactamente dos porciones de ensayo de todas las muestras de laboratorio
se muestra en la figura 2, y los cálculos correspondientes se recogen en el apartado 5.2.2.3. En los demás
casos (es decir, más de dos porciones de ensayo de alguna o de todas las muestras de laboratorio), el
protocolo y los cálculos se recogen en el anexo A.

En cada método de ensayo se realiza el protocolo experimental de la figura 2 con un mínimo de diez
muestras de laboratorio y se repite hasta disponer como mínimo de dos resultados aceptables de cada
muestra de laboratorio. El apartado 5.2.2.3.1 aporta indicaciones sobre los valores aceptables. En
función de las circunstancias, se pueden necesitar más de diez muestras de laboratorio y/o más de dos
porciones de ensayo de cada muestra de laboratorio.

Los datos procedentes de distintas muestras de laboratorio se recogen a lo largo de un período de

tiempo como parte de una actividad especial o como parte de la rutina del sistema de gestión de la
calidad del laboratorio. En este último caso, se debería verificar que se siguen los principios del diseño
experimental descritos en este capítulo.

Figura 2 – Protocolo experimental para la estimación de la reproducibilidad intralaboratorio.

Dos determinaciones en todas las muestras de laboratorio

5.2.2.2.2 Selección de las muestras de laboratorio

La estimación de la reproducibilidad intra-laboratorio está diseñada para excluir las contribuciones de
la heterogeneidad en la muestra de laboratorio, de forma que no es necesario repetir esta estimación
para distintas matrices y esta estimación se puede realizar sobre una sola matriz.

Los cálculos (véase 5.2.2.3) utilizan los datos transformados en sus logaritmos para normalizar la
varianza de la reproducibilidad intralaboratorio, de forma que no es necesario repetir el protocolo
experimental para distintos niveles de contaminación. Sin embargo, siempre que sea posible, las mues-
tras de laboratorio deberían escogerse de forma que cubran la variación natural esperada en cuanto a
niveles de contaminación.

5.2.2.2.3 Muestras procedentes de ensayos de interlaboratorios

Si un laboratorio participa en EA interlaboratorios, los resultados de los análisis de dicho laboratorio se
pueden utilizar para contribuir a la estimación de la reproducibilidad intralaboratorio de la incerti-
dumbre, siempre que:

a) las muestras del EA sean representativas de las muestras de rutina analizadas por el laboratorio
(tipo de matriz, tamaño de la porción de ensayo);

b) el laboratorio realice la estimación de dos o más porciones de ensayo bajo diferentes condiciones
de medición, como se señala en el apartado 5.2.2.2.6.

No obstante, si la estimación de la reproducibilidad intralaboratorio procedente de las muestras del EA

difiere mucho de las estimaciones internas con muestras reales del mismo tipo, estas diferencias deben
identificarse y registrarse, dado que pueden reflejar diferencias en la matriz y en el inóculo microbio-
lógico utilizado en las muestras del EA.

5.2.2.2.4 Preparación de la muestra de laboratorio

Para minimizar las contribuciones a la incertidumbre de la matriz, la muestra de laboratorio, o la
muestra para análisis cuando la muestra de laboratorio sea demasiado grande para poderse homoge-
neizar, debería hacerse lo más homogénea posible. Las muestras de laboratorio que presenten las
siguientes características deberían mezclarse bien antes de tomar las porciones de ensayo:

– muestras en polvo y líquidos no viscosos (por ejemplo, leche, leche de coco, leche deshidratada);

– muestras sólidas picadas/cortadas finamente o suspensiones/emulsiones (por ejemplo, carne pi-

cada, carne separada mecánicamente, carne de salchichas, carne triturada, nata batida, helados
lácteos, nata de leche de soja).

Antes de tomar las porciones de ensayo, los demás tipos de muestras de laboratorio o de muestras de
ensayo deberían mezclarse utilizando un procedimiento de homogenización adecuado. Consúltense las
posibilidades adecuadas para cada tipo de material de la muestra en la Norma ISO 6887 (todas sus
partes).

5.2.2.2.5 Porciones de ensayo

Se recogen como mínimo dos porciones de ensayo a partir de cada muestra de laboratorio (o de ensayo)
para que se puedan realizar réplicas de las mediciones.

5.2.2.2.6 Suspensión inicial, contaminación artificial (en caso necesario) y condiciones de análisis
Si se requiere contaminación artificial, se realiza sobre la suspensión inicial. Los procedimientos
detallados sobre la preparación de alimentos inoculados de manera artificial se describen en la Norma
ISO 16140-3.

Se realizan los análisis sobre cada porción de ensayo como en los ensayos de rutina (por ejemplo,
preparación de una serie de diluciones decimales, inoculación de una o de dos placas por cada nivel de
dilución).

Las condiciones de medición A y B de las dos porciones de ensayo (véase la figura 2, o el anexo A si se
examinan más de dos porciones de ensayo) deberían diferenciarse en tantos aspectos como sea posible.
Idealmente, se incluyen tantas variaciones en todas las fuentes relevantes de incertidumbre técnica
(véase 5.1) como las que podrían encontrarse entre un día y otro dentro del laboratorio. Típicamente
incluirán, sin limitarse a ellas, los lotes de medios de cultivo, reactivos y filtros de membrana, mezcla-
dores de vórtex u otros agitadores, pH-metro, incubadores, tiempo de análisis, etc. Si es posible, las dos
porciones de ensayo se deberían analizar por parte de dos analistas distintos como mínimo. Dado que
la contaminación de las muestras de alimentos raramente es estable en la microbiología de la cadena
alimentaria, las repeticiones de las mediciones deberían realizarse el mismo día y dentro de un corto
período de tiempo. Solamente se pueden realizar las repeticiones en días distintos si se puede demostrar
que los niveles de contaminación son estables.

El patrón de cambios no debería ser el mismo para todas las muestras de laboratorio (o de ensayo). Por
ejemplo, si la muestra 1 se analiza por parte del analista A utilizando el lote de medio B el día 1, la
muestra 2 debería modificar este patrón, por ejemplo, la muestra 2 se analiza por parte del analista A
utilizando el lote de medio A el día 1 o el día 2. El objetivo es maximizar la variación entre las repeticiones
de las mediciones, pero manteniendo al mismo tiempo una representación realista de las operaciones
del laboratorio.

5.2.2.3 Cálculos

5.2.2.3.1 Resultados aceptables

En el caso de las técnicas de recuento de colonias, hay que confirmar que puede utilizarse un número
suficientemente grande de colonias contadas para los cálculos. Deberían excluirse los resultados de
recuentos basados en menos de 30 colonias contadas, así como los recuentos por encima del número
máximo por placa (en la mayor parte de los casos, 300 ufc/placa o inferior, según marque la norma
específica).

NOTA 1 El límite de 30 colonias hace referencia a la suma del número total de colonias contadas en todas las placas conser-
vadas, ΣC, para cada resultado individual.

NOTA 2 El límite de 30 colonias es específico de este protocolo experimental para estimar la desviación típica de la
reproducibilidad intralaboratorio (es decir, de experimentos cuyo objetivo específico es evaluar la incertidumbre) y
no utilizar esta desviación típica para evaluar la MU en muestras nuevas (véase el capítulo 8).

En los métodos que incluyen confirmación parcial, debería excluirse cualquier resultado en el que
menos de la mitad de las colonias analizadas se hayan confirmado; es decir, se recomienda excluir los
resultados en los que nc  np/2 (consúltense los símbolos en el apartado 7.3).

En los métodos basados en el NMP, en los que el resultado de una sola medición proviene de un conjunto
de resultados de ensayos positivos o negativos, los resultados de mediciones basados en menos de cinco
resultados positivos deberían excluirse de los cálculos de la reproducibilidad intralaboratorio.

NOTA 3 El límite de cinco resultados positivos hace referencia a la suma de resultados positivos a lo largo de todas las
diluciones analizadas que conforman un único resultado de medición. Este límite no depende del número de
resultados de ensayo negativos ni del número total de resultados del ensayo.

5.2.2.3.2 Desviación típica de la reproducibilidad intralaboratorio

Siguiendo las prácticas normales en la microbiología de la cadena alimentaria, el resultado de cada
porción de ensayo en ufc/g o ufc/ml se transforma en su valor en unidades log10 ufc/g o ufc/ml antes de
realizar los cálculos.

Este apartado describe el procedimiento de cálculo para analizar exactamente dos valores de todas las
muestras de laboratorio. Consultar el anexo A para el procedimiento de cálculo que se utiliza cuando
hay más de dos valores de cada muestra de laboratorio. El anexo A también indica un cálculo alternativo
para el caso de dos valores de todas las muestras de laboratorio.

Con las n (como mínimo 10) muestras de laboratorio utilizadas para una implementación determinada
del protocolo (véase 5.2.2.2), los resultados (y1A e y1B) de cada una de las porciones de ensayo se utilizan
para calcular la desviación típica de la reproducibilidad intralaboratorio, sIR, como indica la fórmula (1):

n
1
 ( y iA − y iB )
2
s IR = (1)
2n
i =1

donde

i es el identificador de la muestra, i = 1 a n (n  10);

y1A, y1B son los datos transformados en sus valores logarítmicos, log 10 ufc/g o ufc/ml procedentes de
las condiciones A y B, respectivamente.

En la tabla 1 se incluye un ejemplo de cálculo manual. Los cálculos se realizaron con Excel®1) a partir de
los valores indicados de factores de dilución (d) y colonias contadas (C). Los valores derivados se han
redondeado para poderse representar, pero se ha mantenido su valor sin redondear en los cálculos.

1) Excel es el nombre comercial de un producto suministrado por Microsoft. Se incluye esta información por su utilidad para
los usuarios de este documento sin que constituya una recomendación por parte de ISO hacia el producto mencionado.
Pueden utilizarse productos equivalentes siempre que pueda demostrarse que proporcionan los mismos resultados.

Tabla 1 – Cálculo de la desviación típica de la reproducibilidad intralaboratorio. Ejemplo del

recuento de flora mesófila aeróbica en una mezcla de carne de pollo realizando una réplica
para cada una de las dos diluciones analizadas
Media ponderada del
Porción Total de resultado del recuento Cuadrado de
Muestra de Factores de dilución (d) log10 ufc/g Diferencia
de colonias de colonias en ufc/g o la diferencia
laboratorio Colonias contadas (C) o ufc/ml log10 ufc
ensayo contadas ufc/ml (consúltese la (y1A - y1B)2
Norma ISO 7218)
i j d1 C1 d2 C2 ΣCij xij yij = log10(xij) yiA – yiB (yiA – yiB)2

1 A 3 102 4 8 110 1,0  105 5,000 0

0,242 1 0,058 6
1 B 3 59 4 4 63 5,7  104 4,757 9

2 A 5 61 6 6 67 6,1  106 6,784 7

⎼0,043 2 0,001 9
2 B 5 66 6 8 74 6,7  106 6,827 8

3 A 4 168 5 18 186 1,7  106 6,228 1

0,301 0 0,090 6
3 B 4 86 5 7 93 8,5  105 5,927 1

4 A 5 266 6 25 291 2,6  107 7,422 5

0,270 8 0,073 3
4 B 5 140 6 16 156 1,4  107 7,151 7

5 A 6 45 7 5 50 4,5  107 7,657 6

0,540 6 0,292 3
5 B 5 129 6 15 144 1,3  107 7,117 0
6 A 4 129 5 12 141 1,3 × 106 6,107 8
0,045 4 0,002 1
6 B 4 117 5 10 127 1,2 × 106 6,062 4
7 A 2 92 3 8 100 9,1 × 103 3,958 6
⎼0,158 4 0,025 1
7 B 2 131 3 13 144 1,3 × 104 4,117 0
8 A 3 139 4 13 152 1,4 × 105 5,140 5
⎼0,016 8 0,000 3
8 B 3 143 4 15 158 1,4 × 105 5,157 3
9 A 1 49 2 5 54 4,9 × 102 2,691 0
⎼0,419 9 0,176 3
9 B 1 129 2 13 142 1,3 × 103 3,110 9
10 A 4 142 5 13 155 1,41 × 106 6,148 9
0,787 2 0,619 7
10 B 3 227 4 26 253 2,30 × 105 5,361 7
sum = 1,340 1
1,340 1/(2 × 10) = 0,067 0
sIR = √0,067 = 0,258 9

d1
C 3 63 3 4
1B
xij son los recuentos de colonias calculados con las porciones de ensayo, es decir x 1 B = 10 = 10 = 10  57, 3 = 5, 73  10 .
1, 1 1, 1

El anexo A describe los cálculos para el caso general en el que haya más de dos valores de cada muestra
de laboratorio y también enseña cómo se pueden realizar los cálculos mediante el análisis de la varianza
(ANOVA) en el caso general de que haya dos y más valores de cada muestra de laboratorio.

NOTA La desviación típica de la reproducibilidad incluye inevitablemente los componentes de la matriz y de la distribución
relevantes para los datos de reproducibilidad. Si la incertidumbre del resultado de un ensayo se calcula combinando
esta desviación típica de la reproducibilidad con los componentes de la matriz y de la distribución relevantes para el
resultado del ensayo, se producirá una sobreestimación de la incertidumbre. Los laboratorios pueden escoger evitar
dicha sobreestimación, a costa de unos cálculos más complicados, restando de la desviación típica de la reproducibilidad
los componentes de incertidumbre de la matriz y de la distribución relevantes. Esta estrategia alternativa opcional se
describe en el anexo D, obteniéndose una desviación típica corregida, sIR:corr.

5.2.3 Desviación típica de la reproducibilidad procedente de estudios interlaboratorios

5.2.3.1 Estudios interlaboratorios de validación del método

5.2.3.1.1 Aspectos generales

Cuando el método utilizado por un laboratorio se ha sometido a un estudio de validación interlabo-
ratorios, el laboratorio puede utilizar la desviación típica de la reproducibilidad del método como una
estimación de su MU técnica, siempre que se cumpla la siguiente condición: las estimaciones de la repe-
tibilidad y la reproducibilidad de la precisión obtenidas con las mediciones realizadas dentro del labo-
ratorio no deben ser superiores a los valores correspondientes obtenidos en el estudio interlaboratorio.

El procedimiento utilizado para comprobar que se cumple esta premisa y para obtener una estimación
de la incertidumbre combinada con posibles factores adicionales no considerados en el estudio
interlaboratorios se describe en detalle en la Norma ISO 21748.

5.2.3.1.2 Uso en microbiología de los alimentos

Las limitaciones al uso de los estudios interlaboratorios de validación de métodos para estimar la
incertidumbre técnica se resumen a continuación.

– No se dispone de parámetros de reproducibilidad procedentes de los estudios interlaboratorios de

validación del método para todos los métodos.

– El grado en el que la toma de la porción de ensayo y la preparación de la suspensión inicial incluyen

efectos de la matriz dependerá del diseño experimental del estudio interlaboratorio de validación del
método.

– Los valores de precisión procedentes de un estudio interlaboratorio de validación del método se

habrán obtenido bajo unas condiciones limitadas y definidas con precisión. Las combinaciones de
matriz, cepa del microorganismo de ensayo, nivel de contaminación, tratamientos de estrés, etc. se
utilizan para conseguir unas muestras homogéneas y normalizadas para los estudios interlabo-
ratorios en presencia o ausencia de una microflora basal definida. Por consiguiente, la variación
natural de contaminación de las muestras que se puede encontrar en la práctica es reducida, lo que
ocasiona una infraestimación de la incertidumbre. De esta forma, incluso si se dispone de datos de
reproducibilidad, las pruebas artificiales pueden ser difíciles de generalizar a los análisis de rutina
realizados por el laboratorio.

– Es poco probable que se disponga de detalles adecuados para corregir la desviación típica de la repro-
ducibilidad interlaboratorios en base a componentes de la incertidumbre no deseados, conforme al
anexo D.

Por estas razones, el uso de la desviación típica de la reproducibilidad procedente de un estudio interla-
boratorios del método es solo una segunda opción, después de la desviación típica de la reproducibilidad
procedente de experimentos intralaboratorios (véase 5.2.2).

5.2.3.2 Ensayos de aptitud interlaboratorios

Solamente se puede utilizar la estimación de la reproducibilidad obtenida por los participantes de un
EA para estimar la incertidumbre en la siguiente situación:

– Cuando se ha utilizado el mismo método por parte de todos por los participantes de un EA, un parti-
cipante cuyos resultados se han considerado satisfactorios por parte del organizador del EA puede
estimar la incertidumbre técnica como la desviación típica de todos los resultados considerados
satisfactorios por parte del organizador del EA.
– Como en el caso del apartado 5.2.3.1, el grado en el que la toma de la porción de ensayo y la preparación
de la suspensión inicial incluyen efectos de la matriz dependerá del diseño experimental del EA.
– Como en el caso del apartado 5.2.3.1, los valores de reproducibilidad procedentes de un EA se habrán
obtenido bajo unas condiciones limitadas y definidas con precisión. Las combinaciones de matriz, cepa
del microorganismo de ensayo, nivel de contaminación, tratamientos de estrés, etc. se utilizan para
conseguir unas muestras homogéneas y normalizadas para el EA en presencia o ausencia de una
microflora basal definida. Por consiguiente, la variación natural de contaminación de las muestras que
se puede encontrar en la práctica es reducida, lo que ocasiona una infraestimación de la incertidumbre.
– Como en el caso del apartado 5.2.3.1, es poco probable que se disponga de detalles adecuados para
corregir la desviación típica de la reproducibilidad en base a componentes de la incertidumbre no
deseados, conforme al anexo D.

De esta forma, las pruebas artificiales pueden ser difíciles de generalizar a los análisis de rutina realiza-
dos por el laboratorio.

Dadas estas limitaciones, el uso de la desviación típica de la reproducibilidad procedente de un EA

interlaboratorios es solo una tercera opción, después de la desviación típica de la reproducibilidad
procedente de experimentos intralaboratorios (véase 5.2.2) y de la desviación típica de la reproduci-
bilidad procedente de un estudio interlaboratorio del método (véase 5.2.3.1).

Cuando se sigue esta opción, debe prestarse atención para asegurar que la desviación típica que se
utiliza es la de los resultados de los participantes del EA, como se describió anteriormente. Este valor
normalmente es diferente de la desviación típica de la evaluación de la capacitación utilizada para
calcular los índices-z (un parámetro estadístico de funcionamiento definido en la Norma ISO 13528).

Sin embargo, tal como se describe en el apartado 5.2.2.2.3, los resultados obtenidos dentro de un labora-
torio mediante el análisis de un mínimo de dos porciones de ensayo con una muestra de un EA interlabora-
torios puede incluirse dentro de la evaluación de la reproducibilidad intralaboratorio de dicho laboratorio.

6 Incertidumbre de la matriz

6.1 Aspectos generales

El resultado de un ensayo se puede ver afectado tanto por la composición de la matriz como por la
distribución microbiológica. En este documento, el término “incertidumbre de la matriz” hace referencia
exclusivamente a los efectos de la distribución microbiológica en una matriz determinada, es decir, la
variación entre los resultados obtenidos con distintas porciones de ensayo tomadas de la misma
muestra de laboratorio. Refleja el grado en el cual las porciones de ensayo individuales no son represen-
tativas de la muestra de laboratorio en su conjunto. La incertidumbre de la matriz es diferente de la
incertidumbre de la toma de muestras (véase 5.1.2), que no se aborda en este documento. Se considera
que la incertidumbre de la matriz es independiente del método analítico utilizado. Esto quiere decir que
la incertidumbre de la matriz estimada para una matriz puede utilizarse como la contribución a la
incertidumbre de la matriz para todos los ensayos cuantitativos realizados sobre dicha matriz. Esta
consideración también se aplica a la distribución de los diferentes tipos de microorganismos en la
muestra y a la historia de la muestra (por ejemplo, si la muestra se ha contaminado tras la producción).

Si el material es efectivamente homogéneo, como los líquidos bien mezclados (leche, agua, bebidas),
cabe esperar que la incertidumbre de la matriz sea pequeña. No obstante, se reconoce [17] que la
contaminación microbiológica natural de ciertos productos alimenticios (especialmente los productos
sólidos, procesados o fermentados, etc.) puede ser muy heterogénea, lo cual puede contribuir a un
componente de incertidumbre elevado. Esto es especialmente cierto para productos formados por
múltiples componentes compuestos por partes diferenciadas como las pizzas o las comidas cocinadas
listas para consumir. También puede ocurrir con otros alimentos incluidos los alimentos en polvo (por
ejemplo, leche en polvo deshidratada), los quesos y las verduras recién cortadas. En dichos materiales
heterogéneos la incertidumbre se puede reducir recogiendo una porción de ensayo de mayor tamaño
(véase la Norma ISO 6887-1).

Si es probable que la composición del material afecte sustancialmente al funcionamiento del método,
debería considerarse restringir la aplicación del valor de la reproducibilidad intralaboratorio solamente
para los materiales similares; por ejemplo, el recuento directo de organismos dañados de forma subletal
en alimentos procesados o en muestras relacionadas con la higiene ambiental; véase también la Norma
ISO 6887-1.

Consúltense detalles adicionales en el anexo B.

En los apartados 6.2 a 6.4 se describen tres estrategias para estimar la incertidumbre de la matriz:

– el uso de un valor fijo (véase 6.2): para muestras de laboratorio (o de ensayo) homogéneas bien
mezcladas, cabe esperar que la incertidumbre de la matriz sea pequeña y puede utilizarse un valor
fijo (mínimo);

– el examen de múltiples porciones de ensayo procedentes de muestras de laboratorio (o de ensayo)

en las cuales se pueda determinar la varianza dentro de la serie de muestras (véase 6.3);

– las características más relevantes de la matriz y del método son bien conocidas y la incertidumbre de
la matriz se puede estimar a partir del conocimiento previo (véase 6.4).

6.2 Situación de una muestra de laboratorio (o de ensayo) homogénea

La experiencia indica que los productos líquidos (fluidos claros, no viscosos) se consideran homogéneos
y presentan por lo tanto una incertidumbre asociada a la matriz relativamente baja; típicamente,
umatriz = 0,1 log10 ufc/g o ufc/ml, procedente de los experimentos recogidos en la referencia [14] de la
bibliografía (disponible para descarga gratuita en http://standards.iso.org/iso/19036). No obstante, en
algunos casos, la incertidumbre de la matriz de dichos materiales puede ser superior.

Siempre que la muestra de laboratorio completa puede hacerse homogénea antes de tomar la porción
de ensayo, la incertidumbre de la matriz puede considerarse como un valor fijo de umatriz = 0,1 unidades
log10[14]. La homogeneización puede incluir tratamientos que empleen, por ejemplo, un molinillo de
cuchillas, un sistema de palas peristálticas o un sistema de ultrasonidos (por ejemplo, un Pulsifier® 2)).
En las Normas ISO 6887-1 e ISO 7218 se ofrecen consejos sobre las técnicas de homogeneización.

2) Pulsifier es el nombre comercial de un producto suministrado por Microgen. Se incluye esta información por su utilidad
para los usuarios de este documento sin que constituya una recomendación por parte de ISO hacia el producto mencionado.
Pueden utilizarse productos equivalentes siempre que pueda demostrarse que proporcionan los mismos resultados.

6.3 Múltiples porciones de ensayo a partir de las muestras de laboratorio

La incertidumbre de la matriz se puede estimar como la desviación típica de la repetibilidad intrala-
boratorio, analizando múltiples porciones de ensayo en condiciones de repetibilidad a partir de una o
más muestras de laboratorio, utilizando el diseño experimental de la figura 3.

Figura 3 – Diseño experimental para estimar la incertidumbre de la matriz a partir

de un mínimo de dos porciones de ensayo de cada muestra de laboratorio. Diseño
para cada muestra de laboratorio

Esta estimación supone inevitablemente una sobreestimación de la incertidumbre de la matriz ya que

incluye algunos componentes de la incertidumbre técnica, debido a la variación experimental producida
en las repeticiones de los análisis. Para minimizar esta sobreestimación, las repeticiones de los análisis
procedentes de una misma muestra de laboratorio se realizan bajo las condiciones más similares
posibles, es decir, bajo “condiciones de repetibilidad”. Las condiciones pueden cambiar entre distintas
muestras de laboratorio.

Se utilizan muestras contaminadas de forma natural, ya que es poco probable que la contaminación
artificial refleje la incertidumbre real de la matriz. Dado que la incertidumbre de la matriz se considera
independiente del mensurando y del método de ensayo utilizado, deberían escogerse mensurandos en
los que sea probable encontrar muestras contaminadas de forma natural. La aplicación de ensayos de
recuento de microrganismos aeróbicos mesófilos totales, Enterobacteriaceae o microorganismos termó-
filos formadores de esporas pueden ser todos ellos una buena elección.

Todas las porciones de ensayo pueden proceder de una sola muestra de laboratorio. Esto puede ser
especialmente apropiado cuando se analiza una matriz nueva, es decir, una matriz de un tipo distinto a
las evaluadas anteriormente. Consúltese el apartado 6.4 sobre las directrices al considerar matrices del
mismo tipo.

Alternativamente, las porciones de ensayo pueden proceder de múltiples muestras de laboratorio, que
pueden analizarse a lo largo de un determinado período de tiempo para conseguir una estimación de la
incertidumbre de la matriz de aplicación más general.

En todos los casos, deben recogerse como mínimo dos porciones de ensayo de cada muestra de labora-
torio y el número total de porciones de ensayo debe ser como mínimo de diez unidades más que el
número de muestras de laboratorio. Por ejemplo:

– se toman 2 porciones de ensayo de cada una de 10 muestras de laboratorio; o

– se toman 11 porciones de ensayo de 1 muestra de laboratorio.

Consúltese la descripción de resultados aceptables en el apartado 5.2.2.3.1. De forma resumida:

– técnicas de recuento de colonias: como mínimo 30 colonias contadas;

– métodos que incluyen confirmación parcial: confirmación de la mitad de las colonias como mínimo;

– métodos basados en NMP: cinco resultados positivos como mínimo.

Dichas restricciones pueden afectar a la selección del mensurando y al método de ensayo mencionado
anteriormente.

Se calcula la desviación típica de la repetibilidad conforme al anexo A. Para una muestra de laboratorio
individual, es equivalente a la desviación típica del log 10 de los datos. Para múltiples muestras de
laboratorio, es equivalente a un ANOVA de una sola vía por muestra realizado con los log 10 de los datos.

NOTA La desviación típica de la repetibilidad incluye inevitablemente los componentes técnicos y de la distribución relevantes
para la repetibilidad de los datos. Si la incertidumbre del resultado de un ensayo se calcula combinando esta desviación
típica de la repetibilidad con los componentes técnica, de la matriz y de la distribución relevantes para el resultado del
ensayo, se producirá una sobreestimación de la incertidumbre. Los laboratorios pueden escoger evitar dicha
sobreestimación, a costa de unos cálculos más complicados, restando de la desviación típica de la repetibilidad los
componentes de incertidumbre de la distribución relevantes. Esta estrategia alternativa opcional se describe en el
anexo D, obteniéndose una desviación típica corregida, sr:corr.

6.4 Características conocidas de la matriz

Los laboratorios pueden ser capaces de juzgar, a partir de su conocimiento previo, qué grado de incerti-
dumbre de la matriz cabe esperar en una muestra de laboratorio determinada. Dicho conocimiento
puede basarse en análisis previos realizados sobre múltiples porciones de ensayo (véase 6.3)
procedentes de muestras de laboratorio de las que se espera que presenten la misma incertidumbre de
la matriz (homogeneidad de la matriz).

El laboratorio puede considerar la Norma ISO 16140-3 para evaluar si se puede esperar que las
muestras de laboratorio presenten una incertidumbre de matriz similar. En la Norma ISO 16140-3:-
anexo A3) se ofrecen ejemplos de artículos de distintos tipos y categorías.

3) En preparación. Estado en el momento de la publicación: ISO/DIS 16140-3:2018.

Los valores de la incertidumbre de la matriz obtenidos en un laboratorio pueden utilizarse por parte de
otro laboratorio cuando se utilizan muestras de laboratorio en las que se espera que la incertidumbre
de la matriz sea similar.

7 Incertidumbre de la distribución

7.1 Aspectos generales

Incluso en el caso de los materiales homogéneos, existen componentes mínimos irreducibles de incerti-
dumbre que proceden de la distribución aleatoria de los microorganismos en el material de ensayo, que
habitualmente siguen un modelo de distribución de Poisson (véase 7.2). La incertidumbre de la confir-
mación de ciertos métodos basados en una técnica de recuento de colonias (véase 7.3) y la incerti-
dumbre asociada al número más probable (véase 7.4) también se basan en una suposición similar de
que la mezcla es perfecta.

En este documento, las incertidumbres que proceden de dicha distribución de partículas completa-
mente aleatoria se denominan incertidumbres de la distribución. En función de las características del
método analítico, dichas incertidumbres de la distribución se calculan a partir de los valores que
conforman cada resultado individual, de acuerdo con los apartados 7.2 a 7.4.

7.2 Técnica de recuento de colonias. Incertidumbre de Poisson

En los métodos basados en una técnica de recuento de colonias existe una contribución mínima de
incertidumbre de la distribución que depende del número total de colonias contadas utilizadas en el
cálculo de los resultados, ΣC (véase la Norma ISO 7218).

La tabla 2 recoge los valores de la incertidumbre típica de Poisson, uPoisson, en unidades log10, para valores
de recuento (ΣC) comprendidos entre 1 y 40.

Si ΣC = 0, es decir, no se ha contado ninguna colonia, uPoisson = 0,434.

Tabla 2 – Valores de uPoisson para valores de ΣC comprendidos entre 1 y 40

ΣC uPoisson ΣC uPoisson ΣC uPoisson ΣC uPoisson

1 0,434 11 0,131 21 0,095 31 0,078
2 0,307 12 0,125 22 0,093 32 0,077
3 0,251 13 0,120 23 0,091 33 0,076
4 0,217 14 0,116 24 0,089 34 0,074
5 0,194 15 0,112 25 0,087 35 0,073
6 0,177 16 0,109 26 0,085 36 0,072
7 0,164 17 0,105 27 0,084 37 0,071
8 0,154 18 0,102 28 0,082 38 0,070
9 0,145 19 0,100 29 0,081 39 0,070
10 0,137 20 0,097 30 0,079 40 0,069

Para valores distintos de ΣC, uPoisson se puede calcular utilizando la fórmula (2):

uPoisson =
( ) = 0, 4343
1 / ln 10
(2)
C C

0, 434 3 0, 434 3
De esta forma, si, por ejemplo, ΣC = 100, uPoisson = = = 0, 043 43 .
100 10

Para valores superiores de ΣC, el componente de la incertidumbre de Poisson se puede considerar

despreciable si otros componentes de la incertidumbre son grandes (véase 8.1.2).

7.3 Técnica de recuento de colonias. Incertidumbre de la confirmación

Algunos métodos basados en la técnica de recuento de colonias proporcionan números de organismos
presuntivos. Se usan entonces ensayos de confirmación para corregir los recuentos de organismos
presuntivos mediante la estimación de la proporción de un número seleccionado de colonias que han
sido confirmadas como los organismos objeto de estudio mediante el uso de ensayos adecuados. Es
razonable considerar que las colonias se distribuyen de manera uniforme y se utiliza una distribución
binomial para calcular la correspondiente incertidumbre de la distribución específica de un resultado
individual.

Suponiendo que se analizan np colonias presuntivas, de las cuales se confirma un número nc, se utiliza el
número relativo de aciertos nc/np como factor de multiplicación para convertir el recuento de organis-
mos presuntivos en recuento de organismos confirmados. Este cálculo tiene el efecto de añadir un factor
de corrección, log10 nc/np al valor del log10 ufc/g o ufc/ml basado en el número de organismos presun-
tivos. La tabla 3 recoge los valores de uconf, en unidades log10, para valores seleccionados de np y nc.

Tabla 3 – Valores de la incertidumbre de la confirmación (uconf) en unidades log10

para una selección de valores de número de colonias analizadas (np) y número
de colonias confirmadas (nc)

Número de colonias Número de colonias analizadas (np)

confirmadas (nc)
5 10 15 20
1 0,355 4 0,430 2 0,460 5 0,476 9
2 0,202 3 0,262 7 0,286 8 0,299 9
3 0,134 9 0,194 6 0,217 7 0,230 0
4 0,088 8 0,154 1 0,177 6 0,190 0
5 0,045 4 0,125 4 0,150 1 0,162 8
6 0,102 7 0,129 3 0,142 7
7 0,083 4 0,112 6 0,126 8
8 0,065 7 0,098 6 0,113 6
9 0,047 8 0,086 2 0,102 4
10 0,026 1 0,075 0 0,092 6
11 0,064 6 0,083 8
12 0,054 4 0,075 7
13 0,044 1 0,068 3
14 0,032 9 0,061 1
15 0,018 3 0,054 3
16 0,047 5
17 0,040 6
18 0,033 3
19 0,025 1
20 0,014 1

Para valores distintos, uconf se pueden calcular utilizando la fórmula (3), procedente de la fórmula (E.4)
de la Norma ISO 29201:2012:

uconf =
1 (nc + 0, 5) (np − nc + 0, 5) np2
(3)
2, 303
(np + 1) (np + 2) nc2
2

Si nc = 0, el valor de uconf se calcula como si fuera nc = 1.

7.4 Incertidumbre del número más probable

La técnica del número más probable (NMP) calcula los valores más probables a partir de múltiples
resultados de detección o ausencia de detección. Esta técnica incluye el uso de técnicas automatizadas
de microtitulación en placa, donde un elevado número de tubos pueden considerarse como positivos o
negativos. En la técnica de NMP, la incertidumbre mínima de la distribución es superior a la simple de
Poisson y depende de los resultados en detalle. En el anexo C se ofrecen procedimientos para estimar la
correspondiente incertidumbre típica, uNMP, en unidades log10.

Algunos ensayos de NMP requieren la confirmación de la presencia del organismo objeto de estudio en
todos los positivos presuntivos. En esta situación, se calcula el NMP y su incertidumbre a partir del
número de resultados positivos confirmados.

8 Incertidumbre combinada y expandida

8.1 Incertidumbre típica combinada

8.1.1 Consideraciones generales

La incertidumbre típica combinada puede basarse en una de las dos siguientes opciones:

a) una combinación (véase 8.1.2) de las siguientes estimaciones obtenidas por separado:

1) incertidumbre típica técnica;

2) incertidumbre típica de la matriz;

3) incertidumbres típicas de la distribución.

b) si es coherente con los protocolos del laboratorio y los requisitos del cliente, exclusivamente la
desviación típica de la reproducibilidad (véase 8.1.3).

8.1.2 Incertidumbre típica combinada basada en las incertidumbres técnicas, de la matriz y

de la distribución por separado
La incertidumbre típica técnica, utécn, se estima conforme al capítulo 5 en forma de desviación típica de
una reproducibilidad, que se puede corregir en base a las incertidumbres típicas de la matriz y de la
distribución como procedimiento alternativo opcional, conforme al anexo D:

– utécn = sR; o

– utécn = sR:corr.

La incertidumbre típica de la matriz, umatriz, se estima conforme al capítulo 6. Si la estimación de la

incertidumbre de la matriz se realiza conforme al apartado 6.3 a partir de múltiples porciones de ensayo
de las muestras de laboratorio, la incertidumbre típica de la matriz se estima en forma de desviación
típica de la repetibilidad, que se puede corregir en base a las incertidumbres típicas de la distribución
como procedimiento alternativo opcional, conforme al anexo D:

– umatriz = sr; o

– umatriz = sr:corr.

Todas las incertidumbres típicas de la distribución relevantes (uPoisson, uconf, uNMP) se calculan a partir de
los datos que conforman el resultado obtenido, de acuerdo con el capítulo 7.

A continuación, se calcula la incertidumbre típica combinada como la raíz cuadrada de la suma de los
cuadrados de las incertidumbres típicas relevantes de la distribución, de la matriz y técnica. Obsérvese
que no todos los términos se incluirán en un método determinado, por ejemplo, un método no incluirá
a la vez el recuento de colonias (uPoisson) y NMP (uNMP).

EJEMPLO 1 Métodos instrumentales como el del ATP en los que no se realizan recuentos de células ni colonias:

( )
uc y = 2
u tecn 2
+ umatriz

EJEMPLO 2 Métodos de recuento de colonias sin confirmación parcial: uc y = ( ) 2

u tecn 2
+ umatriz 2
+ uPoisson

EJEMPLO 3 Métodos de recuento de colonias con confirmación parcial:

( )
uc y = 2
u tecn 2
+ umatriz 2
+ uPoisson 2
+ uconf

EJEMPLO 4 Métodos de NMP: uc y = ( ) 2

u tecn 2
+ umatriz 2
+ uNPM

NOTA Por lo general, se acepta que el efecto de un componente es despreciable si su incertidumbre típica no es superior a un
quinto de la magnitud del componente más grande de incertidumbre típica [14],[16]. Si los componentes de incertidumbre
de la matriz y de la distribución son despreciables en comparación con la incertidumbre técnica, como se muestra en
los ejemplos del apartado 8.3, se pueden ignorar. En el caso extremo en el que todos los componentes de incertidumbre
de la matriz y de la distribución son despreciables en comparación con la incertidumbre técnica, los ejemplos anteriores
se reducen a uc(y) = utécn.

8.1.3 Incertidumbre típica combinada basada exclusivamente en la desviación típica de la

reproducibilidad
La desviación típica de la reproducibilidad se calcula mediante uno de los tres métodos indicados en el
apartado 5.2.

Si es coherente con los protocolos del laboratorio y los requisitos del cliente, la incertidumbre típica
combinada puede estimarse en forma de desviación típica de la reproducibilidad exclusivamente, sin la
corrección descrita en el anexo D, como se muestra en la fórmula (4):

uc(y) = sR (4)

8.2 Incertidumbre expandida

Se utiliza la fórmula (5) para calcular la incertidumbre expandida U a partir de la incertidumbre típica
combinada uc(y) (véase 8.1) utilizando el factor de cobertura k escogido, que en este documento es de
un valor de 2 (que corresponde aproximadamente a un nivel de confianza del 95%):

U = 2uc(y) (5)

8.3 Ejemplos desarrollados

8.3.1 Ejemplo 1. Componentes de Poisson, de la matriz y técnicos de la incertidumbre

Supongamos que un método validado que utiliza inóculos de 1,0 ml sobre dos diluciones sucesivas con
una sola placa para cada dilución presenta una incertidumbre técnica estimada previamente conforme
al capítulo 5, de utécn = 0,15 log10 ufc/g.

Además, supongamos que el método, aplicado sobre una muestra de laboratorio homogénea, ha ofrecido
los siguientes resultados: 102 colonias a una dilución de 10 -3 y 8 colonias a una dilución de 10-4.

Entonces, el recuento medio de colonias ponderado es de

(102 + 8)  103 = 1, 0  105 ufc/g, por lo cual
1, 1
el log10 del recuento de colonias es de 5,0 log10 ufc/g.

La incertidumbre típica de la distribución uPoisson viene determinada por el número total de colonias
ΣC = 110; por consiguiente,

0, 434 3 0, 434 3
uPoisson = = = 0, 041 4 log10 ufc/g [véase la fórmula (2)].
110 10, 49

La relación uPoisson/utécn = 0,041 4/0,15 = 0,276, que es superior a 0,20 y por lo tanto uPoisson no se puede
considerar despreciable (véase la nota del 8.1.2).

Para una matriz homogénea, la incertidumbre típica de la matriz umatriz = 0,1 log10 ufc/g (véase 6.2).

– La incertidumbre típica combinada (véase el apartado 8.1.2).es:

( )
uc y = 0, 152 + 0, 102 + 0, 041 42 = 0, 034 21 = 0, 185

– Este valor se multiplica por el factor de cobertura (k) de 2 obteniéndose un valor de U = 0,37 log10 ufc/g
(con dos cifras significativas).

Por lo tanto, el recuento de colonias y su incertidumbre expandida es de 5,0 ± 0,37 log10 ufc/g.

8.3.2 Ejemplo 2. Componente de Poisson despreciable

Similar al ejemplo 1, salvo que la incertidumbre típica técnica utécn, es de 0,25 log10 ufc/g.

Dado que la relación uPoisson/utécn = 0,041 4/0,25 = 0,166, que es inferior a 0,2, uPoisson se puede ignorar
(véase la nota del 8.1.2).

No existen otros componentes de distribución, pero sigue existiendo la incertidumbre de la matriz, de

forma que la incertidumbre típica combinada (véase 8.1.2) es:

( )
uc y = 0, 252 + 0, 102 = 0, 072 5 = 0, 269

Este valor se multiplica por el factor de cobertura (k) de 2 obteniéndose un valor de U = 0,54 log10 ufc/g
(con dos cifras significativas).

8.3.3 Ejemplo 3. Componente de Poisson, de la matriz y de confirmación

Similar al ejemplo 1, salvo que los resultados mostrados corresponden a colonias típicas contadas creci-
das en un medio diferente, que necesitan confirmarse.

uPoisson = 0,041 4 y uPoisson/utécn = 0,041 4/0,15 = 0,276, que es superior a 0,2, y por lo tanto uPoisson no se
puede ignorar (véase la nota del 8.1.2).

Confirmación: se analizaron cinco colonias típicas, cuatro de las cuales se confirmaron como positivas
del organismo objeto de estudio. Esto permite obtener unos resultados revisados como los que se
muestran en la tabla 4.

Tabla 4 – Ejemplo de cálculos de los componentes de Poisson, de la matriz y de la confirmación

Presuntivos Confirmados
ΣC 110
resultado; x; ufc/g 100 000 100 000  4/5 = 80 000
y; log10 ufc/g 5,0 4,903

Según el apartado 7.3: para np = 5 y nc = 4, uconf = 0,0888. uconf/utécn = 0,0888/0,15 = 0,592, que es superior
a 0,2, y por lo tanto uconf no se puede ignorar (véase la nota del 8.1.2).

No existen otros componentes de distribución, de forma que la incertidumbre típica combinada (véase
8.1.2) es:

( )
uc y = 0, 152 + 0, 102 + 0, 041 42 + 0, 088 82 = 0, 042 1 = 0, 205

Este valor se multiplica por el factor de cobertura (k) de 2 obteniéndose un valor de U = 0,41 log10 ufc/g
(con dos cifras significativas).

NOTA El resultado del recuento confirmado es de 4,90 ± 0,41 log 10 ufc/g mientras que el de colonias presuntivas (véase el
ejemplo 1) era de 5,0 ± 0,37 log10 ufc/g.

8.3.4 Ejemplo 4. Componentes del número más probable, de la matriz y técnico

Un laboratorio estimó el nivel presuntivo de un organismo (por ejemplo, bacterias coliformes) en una
muestra líquida utilizando un procedimiento de determinación del NMP de 5 tubos/3 diluciones en el
cual se determinó que la incertidumbre típica técnica, utécn, calculada como la desviación típica de la
reproducibilidad, sIR, obtenida mediante un estudio interlaboratorios de validación del método, era de
0,49 log10 NMP/ml, basándose en el ensayo de 20 réplicas de una muestra.

Para una muestra de laboratorio líquida homogénea, la estimación del NMP se basó en la inoculación de
cinco tubos con 1,0 ml de una dilución de la muestra a tres niveles de dilución: 10-2, 10-3 y 10-4, respecti-
vamente, resultando en un total de 15 tubos. Tras la incubación, el número de cultivos positivos para
cada dilución fue, respectivamente, de 4, 2 y 1.

Utilizando la hoja de cálculo de la referencia [19] de la bibliografía se obtuvieron los siguientes valores:
NMP = 260/ml; log10 NMP = 2,42; uNMP = desviación típica = 0,19 log10 NPM.

La relación uNPM/utécn = 0,19/0,49 = 0,39 > 0,20 y por lo tanto uNMP no se puede ignorar (véase la nota del
8.1.2).

Para un líquido homogéneo, la incertidumbre típica de la matriz se puede considerar umatriz = 0,1 log10
(véase 6.2). La relación umatriz/utécn = 0,10/0,49 = 0,204  0,20 y por lo tanto la incertidumbre típica de
la matriz no se puede ignorar (véase la nota del 8.1.2).

Dichos componentes se combinan (véase 8.1.2) para calcular la incertidumbre típica combinada:

( )
uc y = 0, 492 + 0, 12 + 0, 192 = 0, 286 = 0, 535 (con tres cifras decimales).

Este valor se multiplica por el factor de cobertura (k) de 2 obteniéndose un valor de U = 1,1 log10 ufc/g
(con dos cifras significativas).

Por lo tanto, la estimación del NMP supone un nivel de contaminación presuntiva de 2,4 ± 1,1 log10 NMP/ml.

NOTA 1 La estimación de la incertidumbre típica combinada habría sido la misma para una estimación de log10 NMP de 0,42
o incluso de 6,42.

NOTA 2 Algunos ensayos de NMP requieren de la confirmación de la presencia del organismo objeto de estudio. En ese caso,
el cálculo del NMP y de su incertidumbre se determinan a partir del número de resultados positivos confirmados.

9 Expresión de la incertidumbre de la medición en los informes de ensayo

9.1 Aspectos generales

La MU debería expresarse en las mismas unidades que los resultados del ensayo.

Como se indica en el apartado 8.1.1, la MU emitida se puede basar en una de las siguientes dos opciones:

– la desviación típica de la reproducibilidad y las estimaciones por separado de la incertidumbre de la

matriz y de las incertidumbres de la distribución relevantes; o

– la desviación típica de la reproducibilidad exclusivamente.

Cuando se requiere incluir una estimación de la MU en el informe del ensayo, se incluye en el informe
una declaración explícita de que la MU señalada es la incertidumbre expandida, junto con una decla-
ración del nivel de confianza y una indicación que la MU se ha estimado conforme a este documento. Por
ejemplo:

Si la MU se basa exclusivamente en la desviación típica de la reproducibilidad, este punto debe reflejarse

claramente en el informe del ensayo. Por ejemplo:

– “La incertidumbre de la medición expandida indicada se ha estimado conforme a la Norma ISO 19036
y se basa en la incertidumbre típica multiplicada por un factor de cobertura de k = 2, proporcionando
un nivel de confianza de aproximadamente el 95%. Se ha considerado que la incertidumbre típica
combinada es igual a la desviación típica de la reproducibilidad intralaboratorio”.

El número de cifras significativas de la MU emitida debería reflejar siempre la capacidad práctica de

medición. A la vista del proceso de estimación de las incertidumbres, raramente se justifica expresar la
MU con más de dos cifras significativas. Por consiguiente, se recomienda que la incertidumbre expan-
dida se redondee a dos cifras significativas utilizando las reglas normales de redondeo de acuerdo con
la Norma ISO 7218. El valor numérico del resultado de la medición recogido en el informe del ensayo
debería redondearse normalmente hasta la última cifra significativa del valor de la incertidumbre
expandida asignada al resultado de la medición. El redondeo debería realizarse siempre al final del
proceso para evitar el efecto de errores de redondeo acumulativos; consúltese la Guía ISO/IEC 98-3.

Una vez se ha calculado la MU expandida, como se explica en el apartado 8.2, puede expresarse en el
informe de ensayo junto con el resultado del ensayo, como un intervalo en escala log 10 o como valores
en números naturales (ufc/g o ufc/ml), como ilustran los siguientes ejemplos alternativos:

a) log10 del resultado con ± U: y ± U log10 ufc/g o ufc/ml;

por ejemplo, 5,00 ± 0,31 log10 ufc/g;

b) log10 del resultado con límites: y log10 ufc/g o ufc/ml [y – U; y + U];

por ejemplo, 5,00 log10 ufc/g [4,69; 5,31];

c) resultado en números naturales con límites: x ufc/g o ufc/ml [10y – U; 10y + U];

por ejemplo, 1,0  105 ufc/g [4,9  104; 2,0  105].

9.2 Resultados inferiores al límite de cuantificación

9.2.1 Aspectos generales

Pueden producirse resultados por debajo del límite de cuantificación (LC), por ejemplo:

– en un método de recuento de colonias, cuando el número de colonias contadas es de cero, ΣC =0;

– en un método de recuento de colonias con confirmación parcial, cuando el número de colonias confir-
madas es de cero, nc = 0;

– en un método de NMP, cuando no hay resultados de detección, xi = 0 para todos los valores de i.

Aunque dichos resultados podrían interpretarse como cero, suelen expresarse como “ xLC” donde xLC es
el LC en ufc/g o ufc/ml.

Las secciones correspondientes (véanse 7.2, 7.3 y el anexo C) incluyen cálculos de la incertidumbre
típica de la distribución en dichas circunstancias, de forma que la incertidumbre típica combinada y la
incertidumbre expandida, uc(y) y U, pueden calcularse en unidades log10 conforme al capítulo 8.

Sin embargo, el resultado es consistente con un valor del mensurando de cero ufc/g o ufc/ml. Cuando el
resultado se expresa en forma de número natural con límites, que es la opción c) del apartado 9.1, el
límite superior se calcula como si el resultado fuera igual al valor del LC y el límite inferior se considera
cero.

Sin embargo, el log de cero es un valor indefinido, por lo cual cuando el resultado se expresa en forma
de log10 con límites, el límite inferior se expresa como “inferior a”;  (log10 xLC) – U.

9.2.2 Ejemplo
El apartado 8.3.1 es un ejemplo de un método de recuento de colonias con utécn = 0,15 log10 ufc/g y
umatriz = 0,1 log10 ufc/g.

Si el resultado de una muestra de laboratorio es de cero colonias contadas en la dilución 10 -1 y en la

dilución 10-2, entonces ΣC = 0 y el apartado 7.2 resulta en una uPoisson de 0,434 log10 ufc/g.

La incertidumbre típica combinada y la incertidumbre expandida se pueden calcular conforme a los

apartados 8.1 y 8.2:

( )
uc y = 0, 152 + 0, 102 + 0, 4342 = 0, 220 9 = 0, 470 log10 ufc/g

U = 2  0,470 = 0,940 log10 ufc/g

El límite de cuantificación (xLC) corresponde a un recuento de una sola colonia, ΣC = 1;

d1 C 1
x LC = 10 = 101 = 9, 091 ufc/g
1, 1 1, 1

yLC = log10 (9,091) = 0,959 log10 ufc/g

Los límites de los intervalos de incertidumbre para los resultados iguales al LC son:

yLC + U = 0,959 + 0,940 = 1,899 log10 ufc/g

yLC - U = 0,959 – 0,940 = 0,019 log10 ufc/g

10yLC+U = 101,899 = 79,16 ufc/g

10yLC–U = 100,019 = 1,044 ufc/g

Obsérvese que yLC – U puede ser negativo, pero 10yLC–U es siempre positivo.

Redondeando adecuadamente, el resultado junto con su incertidumbre se puede expresar como:

a) log10 del resultado con ± U:  yLC ± U log10 ufc/g;

por ejemplo,  0,96 ± 0,94 log10 ufc/g;

b) log10 del resultado con límites:  yLC log10 ufc/g [ yLC – U; yLC + U];

por ejemplo,  0,96 log10 ufc/g [ 0,02; 1,90];

c) número natural del resultado con límites:  xLC ufc/g [0;10yLC+U];

por ejemplo,  9,1 ufc/g [0,0; 79,2].

Anexo A (Informativo)

Cálculo de las desviaciones típicas con dos o más de dos porciones de

ensayo (desviación típica de la reproducibilidad intralaboratorio y
desviación típica de la incertidumbre de la matriz)

Los apartados 5.2.2.2 y 5.2.2.3 describen el protocolo experimental y los cálculos utilizados para estimar
la desviación típica de la reproducibilidad a partir de experimentos desarrollados dentro de un mismo
laboratorio cuando se emplean exactamente dos porciones de ensayo de todas las muestras de
laboratorio. Como se representa en la figura A.1, el protocolo experimental se puede extender para más
de dos porciones de ensayo de cada muestra y/o para números variables de porciones de ensayo en las
diferentes muestras.

Figura A.1 – Protocolo experimental para la estimación de la reproducibilidad intralaboratorio.

Dos o más porciones de ensayo de cada muestra de laboratorio

Este protocolo es muy similar al utilizado para evaluar la desviación típica de la repetibilidad a partir de
múltiples porciones de ensayo de las muestras de laboratorio (véase 6.3) y los cálculos son idénticos.

La desviación típica se calcula de la siguiente manera. En cada caso, se dispone de n muestras de

laboratorio con pi (i = 1, 2, …, n) porciones de ensayo de cada muestra i, lo que resulta en un valor de
xij ufc/g o ufc/ml para la porción de ensayo j de la muestra i. La desviación típica, sIR o sr, se calcula
mediante la fórmula (A.1):

n pi

 ( y ij − y i )
2

s IR o s r = i =1 j =1 (A.1)
n

 ( p i − 1)
i =1

donde

i es el identificador de la muestra de laboratorio (i = 1, 2, …, n);

j es el identificador de la porción de ensayo dentro de la muestra i (j = 1, 2, …, pi);

yij = log10 xij.

yi =  y ij
j =1
pi

Para una sola muestra, n = 1, lo cual puede ocurrir cuando se evalúa la incertidumbre de la matriz, que
corresponde simplemente a la desviación típica de los datos convertidos en sus valores log 10.

En la tabla A.1 se muestra un cálculo manual realizado sobre una serie de datos similar al de la tabla 1.
Los cálculos se realizaron con Excel®1) a partir de los valores indicados de factores de dilución (d) y
colonias contadas (C). Los valores calculados se han redondeado para su representación.

Tabla A.1 – Cálculos manuales de desviación típica con resultados analíticos procedentes de múltiples muestras

Media ponderada del Cuadrado de las

Total de Recuento
Muestra de Porción de Factores de dilución (d) resultado de recuento de log10 ufc/g diferencias Grados de
colonias medio
laboratorio ensayo Colonias contadas (C) colonias en ufc/g o ufc/ml o ufc/ml respecto a la libertad
contadas log10
(Norma ISO 7218) media
i j d1 C1 d2 C2 ΣCij xij yij = log10 xij ni – 1
1 A 3 102 4 8 110 1,00  105 5,000 0 0,002 70
1 B 3 59 4 4 63 5,73  104 4,757 9 5,052 0 0,086 44 2
1 C 3 248 4 27 275 2,50  105 5,397 9 0,119 70
2 A 5 61 6 6 67 6,09  106 6,784 7 0,000 47
6,806 3 1
2 B 5 66 6 8 74 6,73  106 6,827 8 0,000 47
3 A 4 168 5 18 186 1,69  106 6,228 1 0,011 88
3 B 4 86 5 7 93 8,45  105 5,927 1 0,036 88
6,119 1 3
3 C 4 95 5 12 107 9,73  105 5,988 0 0,017 20
3 D 4 216 5 21 237 2,15  106 6,333 4 0,045 89
4 A 5 266 6 25 291 2,65  107 7,422 5 0,018 33
7,287 1 1
4 B 5 140 6 16 156 1,42  107 7,151 7 0,018 33
5 A 6 45 7 5 50 4,55  107 7,657 6 0,073 06
7,387 3 1
5 B 5 129 6 15 144 1,31  107 7,117 0 0,073 06
6 A 4 129 5 12 141 1,28  106 6,107 8 0,000 52
6,085 1 1
6 B 4 117 5 10 127 1,15  106 6,062 4 0,000 52
7 A 2 92 3 8 100 9,09  103 3,958 6 0,015 48
7 B 2 131 3 13 144 1,31  104 4,117 0 4,083 0 0,001 15 2
7 C 2 149 3 15 164 1,49  104 4,173 5 0,008 18

Media ponderada del Cuadrado de las

Como alternativa al cálculo manual, la desviación típica se puede calcular de forma práctica utilizando
cualquier herramienta capaz de realizar ANOVA de una vía, donde la desviación típica requerida es la
raíz cuadrada de la media cuadrática dentro de cada grupo. Por ejemplo, la función de ANOVA para un
solo factor de Excel®1) aplicada sobre los datos previos de yij da el siguiente resultado, donde la media
cuadrática dentro de cada grupo es de 0,061 59, y, por lo tanto:

s IR = 0, 061 59 = 0, 248 17

Véase la tabla A.2.

NOTA La estrategia de ANOVA también puede utilizarse para los casos en los que se dispone exactamente de dos valores de
cada muestra de laboratorio.

Tabla A.2 – Cálculos de la desviación típica de la reproducibilidad intralaboratorio con

resultados analíticos procedentes de múltiples muestras, utilizando una herramienta capaz de
análisis de la varianza de una vía

Anova: Un solo factor

RESUMEN
Grupos Recuento Suma Promedio Varianza
Fila 1 3 15,155 89 5,051 963 0,104 423
Fila 2 2 13,612 52 6,806 261 0,000 931
Fila 3 4 24,476 56 6,119 139 0,037 283
Fila 4 2 14,574 23 7,287 116 0,036 658
Fila 5 2 14,774 55 7,387 274 0,146 128
Fila 6 2 12,170 24 6,085 119 0,001 031
Fila 7 3 12,249 03 4,083 009 0,012 404
Fila 8 2 10,297 72 5,148 858 0,000 141
Fila 9 4 11,924 72 2,981 18 0,048 398
Fila 10 2 11,510 67 5,755 333 0,309 851

ANOVA
Fuente de variación SC gl MC F Valor P F crít
Entre grupos 51,327 08 9 5,703 009 92,596 53 4,36102E-12 2,537 667
Dentro de los grupos 0,985 438 16 0,061 59

Total 52,312 52 25
Leyenda
SC: suma de los cuadrados; gl; grados de libertad; MC: media cuadrática; F: variable de distribución-F; Valor P: nivel de
significado estadístico; F-crít: valor crítico de la variable de distribución-F.

Anexo B (Informativo)

Efecto de la matriz e incertidumbre de la matriz

Las células de bacterias o levaduras presentes en una matriz líquida (por ejemplo, leche, agua) general-
mente siguen una distribución aleatoria (de Poisson) [véase el caso A de la figura (B.1)], aunque tanto
las células individuales como pequeños grupos de células pueden formar colonias cuando se siembran
en las placas de agar. Los alimentos sólidos como el queso contienen células y grupos de microorga-
nismos distribuidos dentro de las partículas y entre las partículas que conforman el producto, pero
generalmente no se distribuyen de forma aleatoria y con mucha frecuencia aparecen con una distri-
bución de contagio [véase el caso B de la figura (B.1)].

Los alimentos sólidos como la carne y las verduras suelen estar contaminados de forma aleatoria en la
superficie, pero no en los tejidos más internos. El crecimiento de algunas células resulta en una distri-
bución global por la superficie de células individuales y de microcolonias que suele ser de tipo conta-
gioso [véase el caso B de la figura (B.1)].

Si se mezclan trozos de un ingrediente sólido (por ejemplo, carne) con otros ingredientes (por ejemplo,
verduras o salsas) para formar un producto alimenticio compuesto, las bacterias de la superficie de
todos los ingredientes sólidos se distribuyen a lo largo de todo el producto de múltiples componentes,
pero las bacterias no se distribuyen de manera aleatoria a lo largo del producto alimenticio final. Los
números de bacterias que aparecen en la matriz alimentaria reflejan los niveles relativos de contami-
nación de cada uno de los ingredientes y el grado en el que las microcolonias se disocian durante el
proceso de fabricación. Los niveles de contaminación presentes en distintas porciones de ensayo del
producto alimenticio recogidas para su análisis no son consistentes. Los niveles de bacterias específicas
reflejan tanto la calidad como la cantidad relativa de los ingredientes, así como el grado en el que el
proceso de fabricación ha distribuido dichas bacterias a lo largo del conjunto del producto. Una situación
similar se produce si la leche deshidratada y otros productos en polvo se contaminan por organismos
específicos solamente en una pequeña proporción del conjunto del producto [véase la figura (B.2)].

Incluso aunque la muestra de laboratorio se haya homogeneizado antes del análisis, se producen
variaciones en los niveles de contaminación entre distintas porciones de ensayo, especialmente en el
caso de las matrices alimentarias sólidas. En este documento dicha variación se denomina “incerti-
dumbre de la matriz”.

Consúltese la referencia [17] de la bibliografía para más información sobre la distribución de los
microorganismos en los alimentos.

a) Caso A: distribución aleatoria b) Caso B: distribución de contagio que

muestras agrupaciones y micro-colonias

NOTA Fuente: Norma ISO 21784, con modificaciones.

Figura B.1 – Representación hipotética de la distribución de microorganismos

sobre una superficie

NOTA Los cuadrados negros indican las muestras en las que se ha detectado el organismo objeto de estudio.

Figura B.2 – Distribución hipotética de un microorganismo específico presente a

nivel bajo en 100 muestras de un alimento en polvo o de un alimento complejo
(como estofado de verduras y carne)

Anexo C (Informativo)

Variabilidad intrínseca (incertidumbre típica) de las estimaciones del

número más probable

La técnica del número más probable (NMP) se describe en la Norma ISO 7218. En esta técnica, se
inoculan por separado varios inóculos de cada porción de ensayo en distintas alícuotas de un medio de
cultivo. El resultado de cada alícuota es cualitativo, es decir, el resultado es positivo o negativo. Pueden
tener que examinarse varias alícuotas a varias diluciones para obtener una estimación del número de
microorganismos presentes. El NMP se calcula mediante procedimientos estadísticos.

La variabilidad intrínseca del valor del NMP es superior que la que se asocia a la distribución de Poisson
debido al elemento adicional de probabilidad binomial asociada con la naturaleza positiva o negativa de
los datos. Los procedimientos estadísticos utilizados para determinar el NMP también proporcionan el
error típico en unidades log10 NMP/g o NMP/ml. La incertidumbre típica, uNMP, es igual al error típico.

Para determinar el error típico, la Norma ISO 7218 recomienda utilizar la hoja de cálculo Excel® 1)
disponible en http://standards.iso.org/iso/7218, que expresa la incertidumbre típica requerida, uNMP,
como “SD log10 NMP”.

Si un NMP se estima a través de valores medios que no proporcionan un error típico, la incertidumbre
(uUMP) se puede calcular a partir del valor del NMP y de las condiciones experimentales utilizadas para
obtener el resultado utilizando la fórmula (C.1) que se tomado de la referencia [19] de la bibliografía:

1
( )
ln 10
uNMP = k xi  ( − mi   )
mi2exp (C.1)
 
i =1 (1 − exp ( − m   ) )
2
i

donde
uNMP es la incertidumbre típica, en unidades log 10 NMP/g o NMP/ml;
 es el valor del NMP/g o NMP/ml, no en unidades log10;
k es el número de diluciones;
mi es la cantidad de muestra (g o ml) presente en cada alícuota de la dilución i;
xi es el número de resultados positivos encontrados en la dilución i.

Si no hay ningún resultado positivo, es decir, si Σxi = 0, uNMP se calcula como si hubiera un resultado
positivo en la dilución más concentrada, es decir, del valor más alto de mi.

Por ejemplo, si se han utilizado cinco alícuotas de cada una de las cantidades: 1 g, 0,1 g y 0,01 g, y si los
números de resultados positivos han sido respectivamente 4, 0 y 1, entonces el NMP() = 1,7 NMP/g.
De esta forma, la incertidumbre típica se puede calcular como se muestra en la tabla C.1.

Tabla C.1

Cantidad por muestra/ensayo Número de resultados positivos/ensayo Factor de cálculo

(
x i  m i2 exp − m i   )
mi g xi
( )
2
1 − exp − m   
 i 
1 4 1,093 9
0,1 0 0,000 0
0,01 1 0,346 0
Σ 1,439 9

1
uNPM =
( )=
ln 10 0, 434 3
=
0, 434 3
= 0, 212 9 en forma de log10 NMP
  1, 7 1, 439 9 2, 039 9

Si se hubieran encontrado cero resultados positivos, la incertidumbre típica (pero no el resultado) se

habría calculado como si una de las cinco alícuotas de mi = 1 g hubiera sido positiva, lo cual habría pro-
porcionado un resultado de 0,20 NMP/g con una incertidumbre típica de 0,44 log10 NMP/g.

Por consiguiente, si se usa el diseño de NMP de 5  3 en el que se utilizan cinco alícuotas con cada canti-
dad de 1 g, 0,1 g y 0,01 g, el resultado correspondiente a cero positivos es de 0,0 NMP/g con una incerti-
dumbre típica de 0,44 log10 NMP/g.

Anexo D (Informativo)

Corrección de las desviaciones típicas experimentales en base a

componentes de incertidumbre no deseados

Los apartados 5.2.2 y 6.3 estiman la incertidumbre técnica y la incertidumbre de la matriz a partir de las
desviaciones típicas de la reproducibilidad y la repetibilidad experimentales, respectivamente. Dichas
desviaciones típicas incluyen otros componentes de incertidumbre asociados con los datos experi-
mentales, ocasionando una sobreestimación de las incertidumbres técnica y de la matriz.

El diseño experimental reduce los componentes no deseados:

– apartado 5.2.2: la estimación de utécn reduce umatriz haciendo homogénea la muestra de laboratorio y
reduce udistrib mediante la restricción de los resultados aceptables;

– apartado 6.3: la estimación de umatriz reduce utécn trabajando bajo condiciones de repetibilidad y
reduce udistrib mediante la restricción de los resultados aceptables.

No obstante, las desviaciones típicas sIR y sr son sobreestimaciones de las incertidumbres típicas rele-
vantes utécn y umatriz.

Si la MU de un resultado emitido se basa exclusivamente en la desviación típica de la reproducibilidad

(véase 8.1.3), sIR supone probablemente una infraestimación de la incertidumbre típica combinada. Es
probable que las incertidumbres de la matriz y de la distribución de los datos de reproducibilidad sean
inferiores que las del resultado emitido.

Sin embargo, si la MU de un resultado emitido incluye por separado la estimación de las incertidumbres
de la matriz y de la distribución del resultado emitido (véase el apartado 8.1.2), la sobreestimación de
utécn y umatriz ocasionan una sobreestimación de la incertidumbre típica combinada. Para reducir dicha
sobreestimación, los componentes no deseados de las series de datos de reproducibilidad y repeti-
bilidad pueden restarse de las desviaciones típicas obteniéndose las desviaciones típicas corregidas.
Véanse las fórmulas (D.1) y (D.2):

s IR:corr = 2
s IR (
2
− umatriz 2
+ udistrib ) (D.1)

donde umatriz y udistrib corresponden a los datos de reproducibilidad.

s r:corr = s r2 − udistrib
2 (D.2)

donde udistrib corresponde a los datos de repetibilidad.

Como opción alternativa al procedimiento descrito en los apartados 5.2.2 y 6.3 (ausencia de corrección
de las desviaciones típicas), el procedimiento con el que corregir una desviación típica respecto a los
componentes no deseados es el siguiente:

– Se calculan los valores de los componentes no deseados para cada resultado de la serie de datos que
contribuye a la desviación típica:

– tanto para sIR como para sr, esto incluirá todos los componentes relevantes de la distribución:
uPoisson, uconf, uNMP, consúltense los apartados 7.2, 7.3 y 7.4, según corresponda;

– en el caso de sIR, también incluirá la incertidumbre de la matriz, smatriz, que frecuentemente se

considerará 0,1 debido a que las muestras de laboratorio se han homogeneizado, consúltense los
apartados 5.2.2.2.4 y 6.2.

– Se elevan al cuadrado todos los valores y se suman, obteniéndose la suma de los cuadrados de los
componentes no deseados, Sno_deseado.

– Se divide entre el número de resultados, N, obteniéndose el cuadrado de la incertidumbre típica

2
combinada de los componentes no deseados, uno_deseado .

– Se resta este valor del cuadrado de la desviación típica, obteniéndose el cuadrado de la desviación
2 2 2 2
típica corregida, s IR:corr = s IR − uno_deseado , o s r:corr = s r2 − uno_deseado
2
.

2
– Se calcula la raíz cuadrada, obteniéndose la desviación típica corregida, s IR:corr = s IR:corr o
2
s r:corr = s r:corr .

La tabla D.1 muestra los cálculos para los datos del ejemplo de la tabla 1. El único componente de la
distribución relevante en este ejemplo es el de Poisson (véase 7.3). La incertidumbre de la distribución
correspondiente a la confirmación (véase 7.4) es cero, pero se muestra en la representación.

Tabla D.1 – Cálculos de la desviación típica de la reproducibilidad corregida; ejemplo de la tabla 1

Porción Total de Incertidum-

Muestra de Factores de dilución (d) Incertidumbre de la
de colonias bre de la
laboratorio Colonias contadas (C) distribución
ensayo contadas matriz
2 2 2
I j d1 C1 d2 C2 ΣCij uPoisson u Poisson u conf u matriz

1 A 3 102 4 8 110 0,041 41 0,001 71 0,01

1 B 3 59 4 4 63 0,054 72 0,002 99 0,01
2 A 5 61 6 6 67 0,053 06 0,002 82 0,01
2 B 5 66 6 8 74 0,050 49 0,002 55 0,01
3 A 4 168 5 18 186 0,031 84 0,001 01 0,01
3 B 4 86 5 7 93 0,045 03 0,002 03 0,01
4 A 5 266 6 25 291 0,025 46 0,000 65 0,01
4 B 5 140 6 16 156 0,034 77 0,001 21 0,01
5 A 6 45 7 5 50 0,061 42 0,003 77 0,01
5 B 5 129 6 15 144 0,036 19 0,001 31 0,01
0
6 A 4 129 5 12 141 0,036 57 0,001 34 0,01
6 B 4 117 5 10 127 0,038 54 0,001 49 0,01
7 A 2 92 3 8 100 0,043 43 0,001 89 0,01
7 B 2 131 3 13 144 0,036 19 0,001 31 0,01
8 A 3 139 4 13 152 0,035 23 0,001 24 0,01
8 B 3 143 4 15 158 0,034 55 0,001 19 0,01
9 A 1 49 2 5 54 0,059 10 0,003 49 0,01
9 B 1 129 2 13 142 0,036 45 0,001 33 0,01
10 A 4 142 5 13 155 0,034 88 0,001 22 0,01
10 B 3 227 4 26 253 0,027 30 0,000 75 0,01
Sno_deseado 0,235 29
N = número de porciones de ensayo 20
2
uno_deseado = S no_deseado /N 0,011 76

2
s IR (procedente de la tabla 1) 0,067 00

2 2 2
s IR:corr = s IR − u no_deseado 0,055 24

2 0,235 03
s IR:corr = s IR:corr

NOTA 1 El divisor, N, es igual al número de resultados que contribuyen a la desviación típica, que corresponde al número de
porciones de ensayo. Este valor puede ser inferior al número de valores de la suma de los cuadrados, Sno_deseado.

NOTA 2 El cálculo y la resta de Sno_deseado es similar, aunque haya distintos números de resultados por cada muestra.

2 2
Teóricamente, s IR o s r2 no deberían ser nunca inferiores a uno_deseado , lo cual produciría un valor ne-
2 2
gativo de s IR:corr o de s r:corr , respectivamente. Sin embargo, esto puede producirse cuando sIR o sr se
2 2
basan en un conjunto reducido de datos. Si el valor calculado de s IR o de s r2 es inferior a uno_deseado ,
esto indica que la incertidumbre típica correspondiente, utécn o umatriz, es pequeña en comparación con
las incertidumbres típicas no deseadas y pueden considerarse cero. Si ocurre este hecho tan poco habi-
tual, deberían investigarse cuidadosamente sus causas.

Bibliografía

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[2] ISO 6887 (todas las partes), Microbiology of the food chain. Preparation of test samples, initial
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[6] ISO 16140-2, Microbiology of the food chain. Method validation. Part 2: Protocol for the validation
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[10] ISO 21748, Guidance for the use of repeatability, reproducibility and trueness estimates in
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[15] Analytical Methods Committee. Estimating sampling uncertainty. how many duplicate samples
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4) En preparación. Fase en el momento de publicación:

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[17] JARVIS B. Chapter 4: The Distribution of Microorganisms in Foods in Relation to Sampling. In:
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[19] JARVIS B., WILRICH C., WILRICH P.-Th. Reconsideration of the derivation of Most Probable Numbers,
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[20] United Kingdom Accreditation Service. UKAS Publication ref: LAB 12, The Expression of
Uncertainty in Testing, Edition 2 August 2016 available from:
https://www.ukas.com/download/publications/publications-relating-to-laboratory-
accreditation/LAB%2012%20-%20Edition%202%20-%20August%202016.pdf (accessed
22 November 2018).

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