Biotecnología Vegetal
Grado de Biotecnología-Curso 3º
Curso Académico 2022-2023
Práctica 2. Germinación in vitro de semillas y cultivo de
embriones aislados de cebada
1. Introducción
Las semillas constituyen, dentro del ciclo de vida de las plantas, la unidad de dispersión
y el medio de perpetuación de la especie y a la vez son importantes como fuente
alimenticia para el hombre. Un embrión es el rudimento de la planta adulta, en estado
de vida latente o durmiente, que se desarrolla tras la doble fecundación en las
angiospermas. Desde el punto de vista agronómico, se considera que una semilla ha
germinado cuando a partir de ella se origina una planta capaz de alcanzar la fase
reproductora; es decir, capaz de producir nuevas semillas (1; 2). La International Seed
Testing Association (ISTA), considera el proceso de germinación de una semilla como el
establecimiento de un estado metabólicamente activo, manifestado fisiológicamente
por la división celular y por la diferenciación (3). La primera expresión de este proceso
es la emergencia de la radícula (4).
Existen dos tipos de cultivo de embriones: I) cultivo de embriones inmaduros, que se
utiliza sobre todo para impedir el aborto embrionario, muy frecuente en híbridos
interespecíficos, rescatando el embrión en las primeras fases del desarrollo (globular o
corazón) y II) cultivo de embriones maduros, para eliminar la inhibición de la
germinación de algunas semillas debido a la dormición, para acortar los ciclos de mejora
provocando la germinación inmediata y para la propagación vegetativa de gramíneas y
coníferas.
Para el cultivo in vitro de semillas y embriones vamos a utilizar el medio de cultivo
simple. En ambos casos, el medio contiene compuestos inorgánicos (macro- y
micronutrientes), una fuente de carbono (azúcar; usualmente sacarosa), en algunos
casos vitaminas y hormonas. El medio inorgánico más empleado es la mezcla de sales
diseñada por Murashige y Skoog (MS) (5). También es fundamental el control del resto
de condiciones ambientales: temperatura, intensidad luminosa, fotoperiodo, aireación
y humedad relativa.
2. Objetivos de la práctica
El objetivo de la práctica es la esterilización e inoculación de las semillas para calcular el
porcentaje de germinación y obtener plántulas axénicas. Además, reconoceremos las
distintas partes de las semillas de cebada, de cuales llevaremos a cabo el aislamiento de
los embriones y su inoculación en el medio de cultivo.
3. Material
Semillas de tomate Mecheros de alcohol
Semillas de cebada Colador
Tubos con medio de cultivo MG (10) Placas Petri estériles
Tubos de medio de cultivo MEmb (4) Papel de filtro estéril
Gradilla Pinzas
Serie de agua estéril Bisturí
Lejía Aguja hipodérmica
Triton X-100 Lupa binocular
Agua destilada Etanol
Vaso de precipitado
4. Procedimiento
4.1. Esterilización de las semillas
Para la esterilización de las semillas se seguirán los siguientes pasos:
a. Las semillas se introducen directamente en una solución esterilizante de
hipoclorito sódico al 10% (50% de lejía comercial: 25 mL en 25 mL de agua estéril)
con unas gotas de Tritón X-100, durante 30 minutos.
b. Ayudándonos de un colador estéril, eliminamos la solución desinfectante y se
pasan las semillas de tomate a agua estéril durante 5 minutos.
c. Tras los 5 minutos, quitamos el primer agua de aclarado y pasamos las semillas de
tomate a agua estéril durante 10 minutos.
d. Por último, se elimina el segundo agua de aclarado con ayuda del colador estéril y
se pasan las semillas de tomate a una nueva agua destilada estéril. Mantener
durante al menos 15 minutos.
4.2. Inoculación de las semillas en el medio MG
Una vez que las semillas se han esterilizado se introducen en los tubos de ensayo con
medio de germinación. Se trabajará muy cerca de la llama del mechero Bunsen. Hay
que limpiarse bien las manos con jabón y posteriormente se deben enjuagar con etanol
70%:
a. Flamear la boca del tubo de ensayo y las pinzas.
b. Con las pinzas coger las semillas y se introducen en el medio de cultivo (2 semillas
de tomate por tubo).
c. Volver a flamear la boca del tubo y cerrar.
d. Proceder así hasta completar el lote de semillas.
Las gradillas se colocarán en la cámara de crecimiento en condiciones controladas
durante 3 días en oscuridad, para homogenizar la germinación, y posteriormente se
destaparán para su crecimiento en condiciones de fotoperiodo de día largo.
4.3. Aislamiento e inoculación de embriones de cebada
El aislamiento de embriones se debe realizar con mucho cuidado para evitar dañarlo.
a. Depositar las semillas sobre la placa Petri estéril y bajo la lupa binocular.
b. Con ayuda de las pinzas sujetamos la semilla de cebada estéril y utilizando el
bisturí y la aguja hipodérmica, quitar la cubierta dorsal (barba) del grano de
cebada, hasta dejar el embrión al descubierto. Retirarlo con cuidado.
c. Los embriones aislados se colocarán sobre el medio MEmb, en el que habremos
hecho una pequeña incisión con las pinzas. Colocamos un embrión por tubo de
ensayo.
d. Los tubos se colocarán en la cámara de crecimiento en condiciones de fotoperiodo
de día largo y a una temperatura constante de 24C.
Semillas de cebada. Detalle del embrión.
5. Resultados
1. Calcular los porcentajes de germinación de las semillas de tomate. Describir las
plántulas y su morfología.
2. Anotar el número de embriones que ha germinado y la forma de crecimiento de los
mismos.
3. Si una semilla contiene un embrión, ¿por qué el medio de cultivo es diferente para
generar una planta adulta cuando partimos de una semilla o un embrión?
¿Deberíamos utilizar el mismo medio de cultivo?, ¿cuál? Razona tu respuesta
4. ¿Qué interés puede tener el aislamiento de los embriones?
5. ¿Qué diferencias existen entre los embriones somáticos y los embriones cigóticos?
6. Bibliografía
1. Duran-Altisent, J.M. & F. Pérez-García, 1984. Aspectos fisiológicos de la germinación de las
semillas. E.T.S.I.A. Universidad Politécnica de Madrid, 245 pp.
2. Pérez-García, F. & Duran J.M. (1989). Germinación de especies endémicas de las regiones
mediterránea occidental y macaronésica. Invest. Agr.: Prod. Prot. Veg.vol 4(1): 25-33.
3. ISTA Working Sheets on Tetrazolium Testing, Volume I, 1st Edition, 2003
4. Adam, G.; Durán-Altisent, J.M.; Rodríguez, I. (2008) Ensayos de germinación y análisis de
viabilidad y vigor en semillas. Agricultura, 912:836-842
5. Murashige, T. and Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with
tobacco tissue cultures. Physiol. Plant, 15: 473-497.
