Universidad Nacional de Ingeniería
Facultad de Ingeniería Química y Textil
Aislamiento
Aislamiento dede levaduras
levaduras
Saccharomyces
Saccharomyces sppspp aa
partir
partir de
de bayas
bayas de
de uva
uva para
para
su
su aplicación
aplicación en
en procesos
procesos
de
de fermentación
fermentación de de cerveza
cerveza
Integrantes:
1. Giron Hilario Yadira Flor
2. Herrera Santivañez Soraya Jazmin
3. Huayanay Su Yaritza Karina
4. Poma Misahuaman Allison Yasbel
5. Vargas Espinoza María Jesús
Docente:
Ing. Tuesta Chavez Tarsila
Curso:
Química de los alimentos
Grupo 6
INTRODUCCIÓN
Nuevos aromas
Variedades de
cerveza
Nuevos sabores
Mayor calidad
Levaduras
sensorial
Pueden ser aisladas de Con las frutas se elabora un
diferentes medios. mosto y se deja en fermentación.
Principalmente de Comienzan a desarrollarse unos
plantas y frutos Levaduras tipo pocos microorganismos con alta
Saccharomyces tolerancia al etanol
Siccha, R. (2021). Aislamiento de levaduras Saccharomyces spp a partir de bayas de uva para su aplicación en procesos de fermentación de cerveza. [Tesis de pregrado, Universidad
Nacional Mayor de San Marcos, Facultad de Química e Ingeniería Química, Escuela Profesional de Ingeniería Agroindustrial]. Repositorio institucional Cybertesis UNMSM.
MARCO TEÓRICO
Marco teórico ascosporógenas Levaduras Saccharomyces spp.
Levaduras basidiosporógenas
S. bayanus
S. cariocanus
Son microorganismos levaduras imperfectas Se puede
S. cerevisiae
eucariotas unicelulares encontrar
S. kudriavzevii
pertenecientes al reino
S. mikatae
fungi. S. paradoxus
Dentro de las levaduras ascosporógenas se
encuentran las del género Saccharomyces. Tienen varias propiedades que los hacen sobresalientes para uso
La especie Saccharomyces cerevisiae fue el primer industrial:
microorganismo eucariótico cuyo genoma fue
secuenciado. Rápido crecimiento
Buena capacidad para producir etanol
La elaboración de las primeras
bebidas alcohólicas como el Tolerancia para varias tensiones ambientales, como la alta
vino y la cerveza dieron inicio a concentración de etanol y los bajos niveles de oxígeno.
la selección de las levaduras.
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Nacional Mayor de San Marcos, Facultad de Química e Ingeniería Química, Escuela Profesional de Ingeniería Agroindustrial]. Repositorio institucional Cybertesis UNMSM.
Figura 1.
Nichos de aislamiento de levaduras
Las levaduras están presentes en todos los hábitats
naturales como el suelo, plantas, la atmósfera, frutas,
ambientes marinos, etc.
Las levaduras del género Saccharomyces aumentan en
cantidad cuando otros microorganismos inician el
proceso de fermentación de los frutos.
A partir de una fuente de fermentación espontánea
rica en azúcares, se puede aislar una diversidad de
levaduras.
La cerveza es una bebida alcohólica que ya elaboraban las primeras civilizaciones, el registro más
antiguo de cerveza data alrededor de 6000 años A.C. ubicada en la antigua babilonia.
Tecnología
cervecera
La cerveza se clasifica teniendo en cuenta las características de sus componentes como el tipo de
malta, el tipo de lúpulo y el tipo de levadura utilizada. También por su grado alcohólico: sin alcohol,
grado medio, grado alto.
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Nacional Mayor de San Marcos, Facultad de Química e Ingeniería Química, Escuela Profesional de Ingeniería Agroindustrial]. Repositorio institucional Cybertesis UNMSM.
Elaboración de cerveza Parámetros de
fermentación de la cerveza
Figura 2.
Elaboración cerveza artesanal
Temperatura de fermentación
Contenido de extracto seco del
mosto
Densidad celular
pH
Tipos de Fermentación alta
fermentación Fermentación baja
Nota. La figura muestra las etapas para la elaboración de la cerveza: Malteado de la cebada, maceración,
fermentación, filtración.
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METODOLOGÍA
Recolección y acondicionamiento de la muestra
El acondicionamiento se realiza de la
Muestra de 1 kg siguiente manera:
de uvas negras
de mesa Trituración mecánica
El mosto se dejó
fermentar a temperatura
ambiente por 10 días
Se tapa con un tapón de algodón
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Aislamiento de colonias
El aislamiento de levaduras se llevó a cabo utilizando Se prepara 30 ml Se vierte en tres Se deja enfriar
medio de cultivo sólido de la siguiente composición: de medio tubos de ensayo hasta 45 °C
Tabla 1.
Composición del medio de cultivo sólido. Se esteriliza
Medio de cultivo Composición (g/L) a 121 °C por
Se licua
15 minutos
Extracto de malta 15.0
Peptona bacteriológica 5.0
Se vierten en placas Petri, Se agrega 100 µL de mosto
Fosfato de amonio 1.0 se incuban a 25°C por 48 hr fermentado en el 1° tubo
Se observó el crecimiento
Glucosa 20.0
de colonias, las cuales
Agar 18.0 sirvieron para continuar
Nota. La tabla muestra la composición del medio con el aislamiento de Diluciones
de cultivo sólido empleado para el aislamiento
de las colonias. (Siccha, 2021)
levaduras Saccharomyces. sucesivas
100µL 100µL
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Evaluación de tolerancia al metabisulfito de sodio
Se prepara 30 ml Se vierte en tres Se dejan reposar
Para su evaluación, se utilizó medio de
de medio tubos de ensayo por 8hr
cultivo líquido de la siguiente composición:
Tabla 2.
Composición del medio de cultivo líquido. Se esteriliza
Medio de cultivo Composición (g/L) a 121 °C por
15 minutos
Extracto de malta 15.0
Peptona bacteriológica 5.0
Se inoculan en los Se toman asadas de colonias
Fosfato de amonio 1.0 Producción de burbujas tubos de ensayo de las placas Petri obtenidas
(indicativo de la
Glucosa 20.0
actividad fermentativa
Metabisulfito de sodio 0.6
de levaduras
Saccharomyces).
Nota. La tabla muestra la composición del medio Se incuba
de cultivo líquido utilizado para la evaluación de por 2 días
tolerancia al metabisulfito de sodio de las Con asa de siembra
colonias aisladas. (Siccha, 2021)
a 25 °C
estéril en cámara de
flujo laminar
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Evaluación de la tolerancia al etanol
Para su evaluación, se utilizó medio de Se agrega etanol hasta
Se prepara 30 ml Se vierte en tres
cultivo de la siguiente composición:
de medio tubos de ensayo concentración de 15% v/v
Tabla 3.
Composición del medio de cultivo.
Se esteriliza
Medio de cultivo Composición (g/L)
a 121 °C por
Extracto de malta 15.0
15 minutos
Peptona bacteriológica 5.0
Se inocula cada tubo con 100 µL
Fosfato de amonio 1.0
Producción de CO2 y del caldo fermentado sulfitado
turbidez (indicativo de la
Glucosa 20.0 actividad de levaduras Se incuba a
Nota. La tabla muestra la composición del medio Saccharomyces). 25 °C por
de cultivo utilizado para la evaluación de
tolerancia al etanol de las levaduras
48hr
sobrevivientes. (Siccha, 2021)
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Aislamiento de levaduras Saccharomyces
Se prepara el Se vierte en Se toma 100
Las levaduras sobrevivientes fueron cultivadas µL del
en un medio sólido de la siguiente composición: medio placas Petri
medio
Tabla 4. fermentado
Composición del medio de cultivo sólido. Se esteriliza a obtenido
Medio de cultivo Composición (g/L)
121 °C por 15
minutos
Extracto de malta 15.0 Se añade a un tubo de ensayo
Crecimiento de con 10ml de agua estéril
Peptona bacteriológica 5.0 Se inocula en las
colonias separadas placas Petri Diluciones
Fosfato de amonio 1.0 y definidas
sucesivas
Se incuba
Glucosa 20.0
a 25 °C
Se inocula en por 48hr
Agar 18.0 tubos con agar Se tomó
Nota. La tabla muestra la composición del medio incubados a 25 °C 50µL
de cultivo sólido empleado para el aislamiento por 48hr
de las levaduras Saccharomyces. (Siccha, 2021) 100µL 100µL
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Evaluación microscópica y selección de colonias
Cada colonia de levaduras Saccharomyces fue sembrada en
placas Petri conteniendo medio sólido de la siguiente composición:
Tabla 5. Se observan las
Composición del medio de cultivo sólido. colonias a través de
Medio de cultivo Composición (g/L) un microscopio óptico
Extracto de malta 15.0
Peptona bacteriológica 5.0
Fosfato de amonio 1.0
Son mantenidos
Glucosa 20.0
en refrigeración a Se seleccionan
C1 C2
ocho colonias al
Agar 18.0 7°C y renovados azar C3 C4
Nota. La tabla muestra la composición del medio cada tres meses. C5 C6
de cultivo contenido en las placas Petri para la C7 C8
siembra de las colonias. (Siccha, 2021)
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Mayor de San Marcos, Facultad de Química e Ingeniería Química, Escuela Profesional de Ingeniería Agroindustrial]. Repositorio institucional Cybertesis UNMSM.
Evaluación de la capacidad fermentativa de azúcares
Figura 3
Las levaduras seleccionadas (ocho en Evaluación de la capacidad fermentativa de azúcares
total) fueron evaluadas en su capacidad
de fermentar diferentes azúcares:
glucosa, fructosa, maltosa, lactosa y
sacarosa.
La actividad fermentativa se evidenció
mediante la producción de CO22
acumulado dentro de las campanas
Durham cada 12 horas. Todos los
ensayos se realizaron por triplicado. Nota: La figura representa como se hizo la evaluación de la capacidad
fermentativa (Siccha, 2021)
Evaluación de la capacidad fermentativa y selección de levadura
La capacidad fermentativa de las levaduras aisladas se evaluó mediante ensayos de fermentación a diferentes
concentraciones de etanol.
Figura 4
Evaluación de la capacidad fermentativa y selección de azúcares
Nota: La figura representa como se hizo la evaluación de la capacidad fermentativa y selección de azúcares (Siccha, 2021)
Los ensayos se realizaron por triplicado y la intensidad de fermentación se reportó como el promedio de las tres
observaciones. Se seleccionó la cepa que presentó las mejores características en términos de velocidad de fermentación y
poder fermentativo a altas concentraciones de etanol.
Evaluación bioquímica
Para determinar el género y especie de la cepa de levadura seleccionada se realizó una identificación
bioquímica más completa mediante la utilización de un kit API (test de asimilación de nutriente).
Figura 5
Evaluación bioquímica
Nota: La figura representa como se determinó el género y especie de la cepa (Siccha, 2021)
La identificación se realizó usando el API software (BioMérieux, manual API ID 32C).
Fermentación de mosto de malta en matraces
Propagación de la levadura Fermentación de mosto de malta
La cepa de levadura fue propagada en mosto de malta de 8°Brix. En los experimentos de fermentación, se empleó mosto de malta
Figura 6
concentrado (85°Brix) el cual fue diluido con agua destilada.
Las variables que se estudiaron:
Propagación de la levadura en la fermentació de mosto de malta Concentración de extracto seco (ES) del mosto (14 y 20°P)
Temperatura (T°) de fermentación (12 y 18°C)
Concentración de inoculo (CI) (1x10-6 y 1x10-8 células/mL)
Productividad y rendimiento de etanol.
fermentaciones se realizaron a condiciones estáticas y se pH
monitorearon °Brix
Nota: La figura representa la propagación de la levadura (EBC, 1962)
determinación del etanol
Las células se suspendieron en 5 mL de mosto fresco y se procedió
a determinar la concentración de células viables utilizando una
cámara de Neubauer y la metodología de tinción con azul de
azúcar residual oxidación química ácido dinitrosalicílico
metileno.
Fermentación de cerveza en biorreactor
Los ensayos de fermentación se realizaron en un biorreactor airlift (5L).
Figura 7
Fermentación de la cerveza en un biorreactor.
Evaluación del sabor y aroma con jueces no
entrenados entre 20 y 25 años.
SABOR AROMA
Los jueces se seleccionaron en base
considerando que no sean bebedores
frecuentes o abstemios.
Nota: La figura representa como se fermenta la cerva (Siccha, 2021)
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
Aislamiento de colonias
Durante la incubación se observaron el crecimiento de colonias, las cuales sirvieron para
continuar con el aislamiento de levaduras Saccharomyces.
Fermentación de azucares
Tabla 6.
Capacidad de fermentación de azúcares por las levaduras seleccionadas.
Fermentación de azucares
Tabla 7.
Formación de turbidez por las levaduras en fermentaciones con diferentes azúcares.
Capacidad fermentativa en presencia de etanol
Tabla 8.
Capacidad fermentativa de levaduras a diferentes concentraciones de etanol.
Capacidad fermentativa en presencia de etanol
Tabla 9
Formación de turbidez por levaduras cultivadas a diferentes concentraciones de etanol.
Evaluación bioquímica
Tabla 10.
Identificación bioquímica de la levadura seleccionada mediante el KIT API ID 32C.
Proximidad al perfil
Proximidad relativa al
Codigo Taxon significativo mas típico del taxon
taxón indicado (%ID)
(T)
Saccharomyces
C8 96 0,89
cervisiae
Fermentación de mosto de malta en matraces
Tabla 11.
Matriz experimental del diseño factorial completo 23 con tres repeticiones y cuatro puntos centrales.
Se muestra los resultados en producción de etanol, productividad de etanol y rendimiento.
Producción de etanol
Tabla 12.
Análisis de varianza para la producción de etanol.
PRODUCTIVIDAD DEL ETANOL
Tabla 13.
Análisis de varianza para la productividad del etanol.
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Nacional Mayor de San Marcos, Facultad de Química e Ingeniería Química, Escuela Profesional de Ingeniería Agroindustrial]. Repositorio institucional Cybertesis UNMSM.
RENDIMIENTO DEL ETANOL
Tabla 14.
Análisis de varianza para la productividad de etanol.
OPTIMIZACIÓN EN FUNCIÓN DE LAS
VARIABLES DEPENDIENTES
Tabla 15.
Resultados de la optimización en función de las variables
de estudio.
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Nacional Mayor de San Marcos, Facultad de Química e Ingeniería Química, Escuela Profesional de Ingeniería Agroindustrial]. Repositorio institucional Cybertesis UNMSM.
FERMENTACIÓN DE CERVEZA
EN BIORREACTOR Figura 8.
Cinética de fermentación de cerveza utilizando la levadura aislada Saccharomyces
cerevisiae
BIORREACTOR
15°C
Flujo de aire de 0.075 vvm
Concentración de inoculación
de 5.0 x107 cel/mL
17 °Plato
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Nacional Mayor de San Marcos, Facultad de Química e Ingeniería Química, Escuela Profesional de Ingeniería Agroindustrial]. Repositorio institucional Cybertesis UNMSM.
Evaluación sensorial de la cerveza
JURADOS
5 varones
5 mujeres
Tabla 16.
Resultados de la evaluación sensorial de la cerveza.
22 a 26 años
ESCALA HEDÓNICA DE 5 PUNTOS
0 = me disgusta mucho
1 = me disgusta levemente
2 = no me gusta ni me disgusta
3= me gusta levemente
4 = me gusta mucho.
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Nacional Mayor de San Marcos, Facultad de Química e Ingeniería Química, Escuela Profesional de Ingeniería Agroindustrial]. Repositorio institucional Cybertesis UNMSM.
CONCLUSIONES
Se aislaron ocho cepas de levaduras con características comúnmente observadas en
Saccharomyces tales como tolerancia al etanol (12%v/v) y al metabisultifo de sodio
(200 mg/L).
Todas las cepas aisladas (08) fueron capaces de fermentar glucosa mientras que
sólo tres (C6, C7 y C8) fueron capaces de fermentar además sacarosa y maltosa. Las
levaduras capaces de fermentar un mayor espectro de azúcares son deseadas.
La producción de etanol durante la fermentación de cerveza estuvo influenciada por
la temperatura, el extracto seco del mosto y la concentración inicial de inoculo. Así, al
incrementar la temperatura de fermentación, la cantidad de azúcares fermentables
y la densidad celular inicial se incrementa la producción de etanol.
El rendimiento de etanol en la fermentación del mosto con la cepa C8 estuvo
influenciado positivamente con la disminución de la temperatura y la concentración
inicial de inoculo.
REFERENCIAS
BIBLIOGRÁFICAS
REFERENCIAS
Siccha, R. (2021). Aislamiento de levaduras Saccharomyces spp a partir de bayas de uva
para su aplicación en procesos de fermentación de cerveza. [Tesis de pregrado,
Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Facultad de Química e Ingeniería Química,
Escuela Profesional de Ingeniería Agroindustrial]. Repositorio institucional Cybertesis
UNMSM.
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Briggs D., Boulton C., Brookes P. and Stevens R. (2004). Brewing: Science and practice.
Cambridge, England: Woodhead Publishing Limited
EUROPEAN BREWERY CONVENTION: yeast group estimation of yeast viability. Inst. Brew.
Vol. 68, 1962.
Gojkovic, Z., Knecht W., Zameitat, E., Warneboldt, B., Coutelis J-B., Pynyaha, Y.,
Neuveglise, C., Møller K., Lüffler, M. y Piskur, J. (2004). Horizontal gene transfer
promoted evolution of the ability to propagate under anaerobic conditions in yeasts. Mol
Gen Genomics 271: 387–393.
Kunze W. (2006). Tecnología para cerveceros y malteros. Alemania, Berlín:
WestkreuzDruckerei Ahrens KG.
REFERENCIAS
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ethylphenols in wine by yeasts of the genera Brettanomyces and Dekkera: A review.
Food Chemistry 102: 10–21.
Turc, X. (2018). diseño de una planta de fabricación de cerveza artesanal (tesis de
pregrado). Escuela Técnica Superior de Ingeniería Industrial de Barcelona, España.
Willaert, R. (2016). Section V. Beverages: The Beer Brewing Process: Wort Production
and Beer Fermentation. Department of Ultrastructure – Flanders Interuniversity
Institute for Biotechnology, Vrije Universiteit Brussel, Pleinlaan 2, B-1050 Brussel,
Belgium.
