INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL DIRECCION DE EDUCACION MEDIA SUPERIOR CENTRO DE ESTUDIOS CIENTIFICOS Y TECNOLOGICOS “DIODORO ANTUNEZ ECHEGARAY” DEPARTAMENTO DE MATERIAS TECNOLOGICAS ACADEMIA DE ALIMENTOS MANUAL DE PRACTICAS DE LABORATORIO MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS ACTUALIZO: LIC en EDUC. MARICELA ISABEL BLANCAS ALVA - AGOSTO - DICIEMBRE2012.WV. vi. INDICE Pag. Prefacio. .... sebeaeeeh pst lass esheets 3 Mision. . 5 in. . 5 Competencia. ... 5 Premisas basicas para el Trabajo en el laboratorio de Microbiologia de Alimentos Reglamento de laboratorio. 6 Informe de las Practicas de Laboratorio. 8 PRACTICAS. ... : Conocimiento del Material, Equipo y Manejo del Microscopic de Campo Claro en Microbiologia de Los Alimentos. Frotis y Tincién Simple. Tincién Diferencial de Gram. . Esterilizacién por Calor Himedo. Preparacién de Medios de Cultivo. ‘Técnicas de Sembrado y Aislamiento Microbiano, Morfologia Colonial. . Pruebas Bioquimicas. Recuento De Microorganisms Mesofiicos Recuento De Microorganismos Coliformes. . Cuantificacién de Hongos y Levaduras. Analisis Microbiolégico del Agua. 10 APENDICES Preparacién De Colorantes Y Reactivos. .. Preparacién De Soluciones Y Reactivos. ...PREFACIO, EI control microbiolégico de la produccién de alimentos tiene como finalidad titima, Suministrar productos seguros e inocuos, nutritivos y sabrosos con una vida fomercial adecuada y a un costo razonable para el consumidor. Tradicionalmente, la inocuidad, es decir, la ausencia de microorganismos patégenos y sus toxinas, se Miene considerando independientemente de la prevencién de la alteracién. La legistacién, que en gran parte existe para proteger al consumidor de las enfermedades trasmitidas por los alimentos, ha tendido a reforzar los aspectos de inocuidad o seguridad. A pesar de los grandes esfuerzos realizados, la garantia de inocuidad microbiana parece tan Iejana como siempre incluso en los paises avanzados. La muerte, el Sufrimiento, las pérdidas econémicas y las reclamaciones de los ciudadanos en nombre de las victimas de enfermedades trasmitidas por los alimentos van acompafiados de las pérdidas inmensas causadas por alteraciones de estos productos. En los paises del tercer mundo el perfeccionamiento de la conservacién de los alimentos podria salvar un 25-30% de la producci6n y de este modo inclinar la balanza desde el lado de la malnutricién, o realmente el hambre, hacia una dieta adecuada. Incluso en los paises ricos, la perdida de alimentos, debido a las alteraciones es cuantiosa y las reclamaciones legales iniciadas como consecuencia de las enfermedades trasmitidas por los alimentos Pasteur puso los cimientos de la Ecologia Microbiana cuando en 1887 estudié la suerte de un inéculo sino también la naturaleza del medio y las condiciones de cultivo influian para determinar qué microorganismos crecian, no es sélo la "semilla" sino también el “terreno” lo que determina qué microorganismos creceran en el interior 0 la superficie de un sustrato dado. Los microorganismos alterantes en las industrias especializadas, tales como la cervecera y de productos lacteos, ha sido estudiada durante muchos afios. Sin embargo, la aplicacién sistematica de los principios ecolégicos a la microbiolégia de los alimentos no empezé hasta la década de los afios 30.En Gran Bretafia, Haines estudié la flora alterante de los alimentos proteicos frescos, tales como la carne y los huevos, antes y durante la Segunda Guerra Mundial. Las investigaciones de Westerdijk en Holanda, al final de los afios 40, determin que los microorganismos que crecian sobre un alimento, dado eran determinados por tres factores: las caracteristicas del propio alimento, el medio ambiente en el que se conservaba o almacenaba y las interacciones entre los microorganismos que inicialmente lo colonizaban. Siguiendo a Haeckel, Westerdijik propuso el término “asociacién microbiana" para la flora de alteracién caracteristica de un determinado alimento. Para que un curso proporcione un aprendizaje significative, este debe estar sustentado sobre bases pragmaticas En Microbiologia de alimentos, el componente practico confiere capacidades, habilidades y destrezas en el desarrollo de una metodologia que les permita aplicar 6)las medidas de seguridad e higiene en el desarrollo de su trabajo, identificar a los microorganismos que alteran los alimentos, en el contexto de buenas practicas de manufactura de alimentos. De acuerdo con la OMS, el nivel de Bioseguridad 0 Contencién el Laboratorio de Microbiologia de Alimentos es BL2. El manual de practicas de microbiologia de alimentos se ha reestructurado bajo el principio “Aprendizaje Centrado en el Alumno", Esta integrado de cuatro secciones. La primera seccién considera las premisas basicas que debe considerar el estudiante para desarrollar sus actividades dentro del laboratorio; es decir el reglamento y la organizacién del laboratorio de microbiologia. La segunda seccién esta integrada por las técnicas microbiolégicas elementales que se aplican en la identificacién del microorganismo, tales como: forma, agrupacién, afinidad tintorial, técnicas de sembrado, la morfologia colonial, y pruebas bioquimicas, asi como, las técnicas de preparacién de medios de cultivo, esterilizacién. En la tercera seccién se realiza practicas para analizar la microbiota de los diferentes grupos de alimentos, las alteraciones que provocan y detectar la presencia de microorganismos patégenos. Los alumnos tendran la oportunidad de aplicar los conocimientos adquiridos en las dos primeras secciones; desarrollando proyectos de investigacién especificos o de interés particular. La Ultima seccion esté conformada por tres anexos; la preparacién de colorantes, preparacién de soluciones y reactivos, y la composicién y preparacién de medios de cultivos. Los contenidos del manual se presentan de tal forma que permitan al alumno, avanzar de manera sistematica; ya que la mayoria de las practicas se han realizado repetidas veces con el precepto de “Preparar a los estudiantes para que adquieran la capacidad de estimar la calidad y seguridad microbiolégica de un producto”. Cabe destacar que el trabajo aqui presentado, no pretende sustituir metodologias oficiales de analisis microbiolégicos; si no darle mayor objetividad a la consecucién del aprendizaje, ser una guia para el mejor desarrollo de las actividades académicas en el laboratorio por parte de docentes y alumnos. (4i MISION. La asignatura de Microbiologia de Alimentos, tiene la misién de preparar alumnos a través de la adquisicién de conocimientos teérico practicos, bajo la modalidad educativa presencial y a distancia; que le permitan continuar sus estudios de Nivel Medio Superior, titularse e incorporarse al Nivel Superior 0 Campo Laboral; Promoviendo actitudes, habilidades y valores, con responsabilidad, ética, y compromiso, contribuyan a su formacién profesional y desarrollo de su entorno social con un sentido humanistico y cuidado del medio ambiente. I, VISION. Los conocimientos de la asignatura de Microbiologia de los Alimentos son actualizados; contara con recursos modemos y adecuados, que permitan el aprovechamiento de los estudiantes en el marco del Modelo Educativo del Instituto Politécnico Nacional y, a través de los procesos de mejora continua responder a los constantes cambios de la globalizacién. IV. COMPETENCIA. El objetivo del manual de practicas del laboratorio de Microbiologia de Alimentos consiste en capacitar al alumno para e| manejo de procedimientos analiticos mas cominmente utilizados en el laboratorio de Microbiologia, la deteccién e identificacién de los microorganismos que alteran a los alimentos, aplicando normas de Seguridad e Higiene y estandares de calidad (5)V.PREMISAS BASICAS PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS. 1. REGLAMENTO DE LABORATORIO. Los microorganismos que se analizar son potencialmente patégenos, por lo que el contacto con ellos, su ingestién, el desarrollo de actos inapropiados y la presencia de condiciones inseguras en el area de trabajo, pueden provocar accidentes y diversos problemas de salud. Por ello se debe aplicar las normas de seguridad e higiene pertinentes, 1.1. Normas de cardcter Académico y Administrativo. Solo podran entrar a practica, los alumnos inscritos oficialmente. La entrada al laboratorio se realizara en forma puntual. Es responsabilidad exclusiva del alumno, contar con su manual de précticas. El alumno debera haber estudiado en su manual, la practica correspondiente antes de entrar al laboratorio y resolver el cuestionario. * Sise abandona el laboratorio sin autorizacién del profesor, aunque la practica se haya terminado, se considerara como falta. ° Las faltas al laboratorio se evalan con cero. * Cuando el grupo no asista al desarrollo de la practica, esta se dard por vista; se evaluara con cero y podra ser tema de examen. + La evaluacién del laboratorio constituye el 50% de la calificacién total. * Para tener derecho al tltimo examen, el alumno debe asistir y aprobar cuando menos el 80% de practicas realizadas. + El material o equipo que se deteriore, rompa o extravié; debera reponerse en 8 dias como maximo, si no se cumple con esta condicién, se suspendera al alumno. + El pago o reposicién lo hard el equipo de trabajo o en su defecto el grupo. * El alumno que adeude material al finalizar el curso, no tendra derecho a presentar el examen extraordinario y a titulo de suficiencia, 1.2, Normas de Seguridad. * Elalumno debe tener su bata puesta al momento de entrar al laboratorio, la sual debe de estar limpia y abotonada; sélo podran quitarsela al sali * Cuando se requiera debera portar cofia y cubreboca 10]1.3. El alumno debera presentarse al laboratorio con zapatos antiderrapantes y cerrados. Esta prohibido el uso de sandalias Nunca comience el trabajo de laboratorio sin el permiso previo del profesor Golocar los objetos personales en el lugar que se indique; quedarse exclusivamente con el material que se va a utilizar, Cada alumno trabajara en equipo en el lugar y mesa asignados, durante el tiempo que dure el curso. Hablar solo lo necesario con sus compafieros y maestros. El alumno no podra pasearse entre las mesas ni sentarse sobre ellas, el trabajo debe realizarse de pie, Es obligacién de los alumnos acatarlos lineamientos de orden y discipina, y poner maxima atencién durante su estancia en el laboratorio para prevenir accidentes 0 dafios al equipo; quienes no cumplan con esta disposicion tendran que abandonar las areas de trabajo, anulandose la practica. El alumno debe ser cuidadoso con el equipo, material y reactivos que se les Proporcionen, revisarlos cuidadosamente y reportar cualquier ruptura 0 deterioro que presente. Etiquete todo el material o reactivos que se van a incubar o almacenar, con los datos que se le indiquen, Informar inmediatamente al profesor de cualquier accidente o anomalia que ocurra durante la sesién, La puerta del laboratorio debe mantenerse siempre cerrada. Queda estrictamente prohibida la estancia de alumnos dentro del almacén. Normas de Higiene. Ser pulcros en su presentacién personal; ufias recortadas y sin barniz 0 pintura, cabello recogido, sin anillos, reloj, pulseras o pearcing. No consumir alimentos y/o bebidas, mascar chicle o fumar dentro del aboratorio; cualquier actividad restringida, puede proporcionar una oportunidad para que un patégeno infecte al discente. Todo el material que se va a incubar, refrigerar o desechar debera ser colocado en el sitio indicado por el profesor 0 encargado, Siga las instrucciones del profesor, cuando manipule cultivos. Es obligacién de cada equipo, limpiar o desinfectar el érea de trabajo al inicio y al final de la sesion Observara las indicaciones del profesor para eliminar los residuos biolégico infeccioso, de manejo especial y urbanos EI material y equipo utilizados en la realizacién de las practicas debera entregarse limpio, sin marcas de plumén o masking tape adherido. Lavarse las manos cuidadosamente después de terminar las actividades practicas. 72. INFORME DE LAS PRACTICAS DE LABORATORIO. La organizacién del informe capacita al estudiante en competencia de lecto- escritura e investigacién documental, éste reporte tiene que ser pertinente y relevante. Un informe de debe incluir los siguientes apartados: Portada. Competencia. Introduccién. Método 0 Desarrollo. Resultados. Analisis de Resultados. Conclusiones. . Cuestionario. 9. Referencias Bibliogréficas. OPNDAALENS Portada. En esta pagina se debe incluir: Nombre de la Institucién: Instituto Politécnico Nacional Nombre de la Unidad Académica: CECyT No. 15 "Diddoro Anttinez E". Nombre de la Asignatura Nombre del Alumno Nombre del profesor Fecha de Entrega * Titulo de la practica de laboratorio. Anotar de forma precisa el titulo de la practica de laboratorio que se desarrolla en cada sesién correspondiente. Competencia. La competencia debe ser breve y explicar en una frase porqué se va ha realizar la practica. Aunque en este manual se describen las competencias de cada una de las. practicas. Introduccién. En la introduccién se debe incluir la informacién relevante acerca del tema de la practica en cuestién. Debe contener también, breves comentarios sobre la importancia y su aplicacién en el campo de la industria o érea del conocimiento. (8)Desarrollo o Metodologia. Describe la forma en que se realizara el trabajo experimental dentro del laboratorio; el material, sustancias y reactivos a utilizar, los tiempos y parémetros considerados; asi como, las Normas de Higiene y Seguridad a aplicar. (Diagrama de Blocs) Resultados. En este apartado deberan incluirse todos los datos obtenidos. Presentarse en forma organizada en tablas y figuras 0 esquemas, incluyendo notas al pie de pagina para explicar cualquier abreviatura, anomalias o irregularidad. Todos los ejes de las graficas deben llevar una leyenda que las identifique y asignar unidades a todas las cantidades manejadas. Si ha sido necesario realizar célculos para obtener los resultados expuestos, ofrezca un ejemplo de cémo se ha hecho cada uno e incluya las unidades pertinentes. Anilisis de Resultados. En este apartado se explica el porque de los resultados obtenidos. Por ello se habra de hacer referencia a las tablas y datos ofrecidos en el apartado de resultados, Conclusiones. Afirma de manera categérica la relacién directa del resultado comparandose con la ‘Competencia Cuestionario. En esta seccién se incluyen cuestionamientos relevantes en los que se sustenta la parte experimental Referencias Bibliograficas. Los alumnos deben citar las fuentes de donde han tomado hechos o datos que incluyen en su informe y que no provengan de este manual de practicas, ni de las notas de clase,VLPRACTICAS PRACTICA No. 1 CONOCIMIENTO DEL MATERIAL, EQUIPO Y MANEJO DEL MICROSCOPIO DE CAMPO CLARO EN MICROBIOLOGIA DE LOS ALIMENTOS. COMPETENCIA Conocer el material y equipo del laboratorio de microbiologia de alimentos, para un mejor aprovechamiento. Aprender a manejar correctamente el microscopio, observando los frotis preparados. INTRODUCCION. El estudio de los microorganismos, implica la ejecucién de diversas pruebas instrumentales que conlleven a la identificacién de éstos; las técnicas de andlisis microbiolégico, requieren de condiciones especiales para su desarrollo, tales como la preparacién del area de trabajo y preparacién del material y equipo a utilizar. Por lo cual cada uno de los laboratorios de andlisis de alimentos cuenta con instrumentos que deben ser conocidos tanto en su funcién como en los cuidados. El microscopio es un instrumento util en el laboratorio de microbiologia, “ayuda a la amplificaci6n virtual permitiéndonos observar organismos y estructuras que no es posible observar a simple vista. MATERIAL Asa bacteriolégica Mecheros Autoclave Medios de cultivos Balanzas Microscopio Cajas de Petri Papel seda Centrifuga Pipetas Colorantes Pizeta Cubreobjetos Pinzas de diseccién Cuenta colonias Probetas Benzal Portaobjetos Espatula Puente de tincién Estufa bacteriolégica Refrigerador Frasco de reactivos Termémetro Gradilla Tubos de ensaye Hisopos Vasos de precipitados HornoEQUIPO Microscopio binocular de campo claro. Papel seda o tela suave. Porta objetos Cubre objetos . Vaso de precipitado de 50 mL Nota: Por equipo traer material para realizar frotis en fresco y lapices de colores ACTIVIDAD N° 1 Integrados en equipos de trabajo colaborativo, discuten la informacién recabada para organizar, describir y clasificar el material, equipo y aparatos a utilizar en el laboratorio de microbiologia de los alimentos. ACTIVIDAD N° 2 Integrados en equipos de trabajo colaborativo, discuten la informacién recabada a cerca del uso, cuidado y limpieza del microscopio de campo claro y verificar donde Se encuentran las partes que componen al sistema mecanico, éptico y de iluminacién ACTIVIDAD N°3 El alumno enfocara al microscopio las preparaciones realizadas a10X ,40X y 100X, RESULTADOS 1. Realizar gioser del material de microbiologia en mica de plastico. 2. Tomar fotografia del equipo utilizado y anotar los nombres de los sistemas y las partes que conforman a cada uno de estos. ANALISIS DE RESULTADOS Qi)CONCLUSIONES CUESTIONARIO. 1. N 2 os 2 ~ 2 © Anote los cuidados, limpieza y conservacién del material de vidrio utilizado en microbiologia. . Describa la diferencia entre la balanza analitica y granataria y su uso en microbiologia. . Explique brevemente la forma adecuada de utilizar las pipetas en microbiologia. . Explique que es la campana de flujo laminar. Defina el término poder de resolucién. Calcule la amplificacién de un objeto si se observa en: a) Ocular 10X y objetivo 40x. b) Ocular 5X y objetivo 10x. ©) Ocular 1X y objetivo 10x. - Anotar 5 medidas generales para utilizar y conservar en buen estado un microscopio. . Especifique que otros tipos de microscopios dpticos existen. . Mencione la funcién del aceite de inmersion. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS. fz)PRACTICA No. 2 FROTIS Y TINCION SIMPLE. COMPETENCIA. 1. E] alumno conocera y aplicara la técnica de preparacion de un frotis a partir de cultivos en diferentes medios. El alumno identificaré por microscopia, el tamajio, la forma y la agrupacién de las bacterias con una tincién simple. INTRODUCCION. EI microscopio de luz muestra dos formas principales de eubacterias; los organismos mas 0 menos esféricos llamados cocos (griego y latin granos) y la forma cilindrica denominados bacilos (latin bastones). Los cocos pueden presentarse en diversas formas, segtin los planos en que se dividan: cuando predominan en forma de pares se llaman diplococos, en cadenas estreptococos ( griego streptos, torcidos),y en racimos estafilococos (griego staphyle, racimos de uvas).Los cocos que permanecen adheridos después de una separacién sucesiva en dos o tres direcciones perpendiculares, dando tétradas cuadradas o aglomeraciones ctibicas se llaman sarcinas ( latinfardos). Cuando los bacilos son extremadamente cortos se denominan cocobacilos, cuando son mas delgados en sus extremidades, bacilos fusiformes; si crecen en forma de fibras, formas filamentosas y cuando 16 hacen en formas curvas, vibriones 0 espirilos Para la observacién de la morfologia microscépica de las bacterias, es necesario resuspender una parte de la colonia bacteriana en una gota de agua u otro liquido; esto es una preparacién en fresco. Si se parte de una suspensién de bacterias, se realiza una extensién o pelicula sobre un portaobjetos, fijandose por un método quimico 0 fisico, a esta pelicula microbiana se le conoce como un frotis. Para apreciar mejor la forma y tamafio de los microorganismos es necesario tratarlas con un colorante, los cuales son compuestos quimicos que tienen afinidad por ciertas estructuras bacterianas. Los colorantes son compuestos organicos que estan constituidos por un grupo croméforo y un auxécromo unidos a un anillo bencénico.- Dentro de los colorantes mas utilizados en el laboratorio de Microbiologia estan el cristal violeta, azul de metileno, safranina y fucsina. Estos colorantes se disuelven en agua o alcohol, dependiendo de su polaridad. Los métodos utilizados para tefiir a las bacterias se clasifican de la siguiente forma: 4. Tincién simple 2. Tincién diferencial 3. Tincién estructural o especial (13)Las tinciones simples utilizan un solo colorante y son utiles para observar la forma, agrupacién y tamafio de las bacterias. MATERIAL, COLORANTES CEPAS BACTERIANAS Asa bacteriolégica Safranina. Escherichia coli Microscopio. Azul de metileno. Staphvlococcus aureus Portaobjetos. Cristal violeta. Bacillus subtillis Mechero fisher. Puente de tin Vaso de precipitados Aceite de inmersién NOTA: Por equipé traer cerillos, papal higiénico y marcador para CD. ACTIVIDADES. Con la explicacién que se dio en clase, prepara los diferentes frotis bacterianos, utilizando el material solicitado. Método para preparar un frotis a partir de un medio de cultivo sélido. 1, Marcar en un extremo los portaobjetos limpios y desengrasados. 2. Colocar con la ayuda del asa bacteriolégica una pequefia gota de agua en el centro del portaobjetos. Tomar con el asa estéril un fragmento del crecimiento de la colonia y hacer una suspensién en la gota de agua, extendiéndola para formar una pelicula delgada de aproximadamente un centimetro cuadrado. . .Dejar secar a temperatura ambiente. >. Fijar el frotis al calor, para lo cual se calienta la parte posterior del portaobjetos con la flama del mechero (pasar el portaobjetos por la flama por lo menos tres veces), a una-temperatura que sea soportable al dorso de la mano 3. oe TECNICA DE TINCION SIMPLE: Colocar el frotis sobre el puente de tincion. 1 2. Cubrir el frotis con unas gotas de colorante y dejarlo actuar durante un minuto. 3. Tomar el portaobjetos por un extremo y escurrir el colorante al chorro de agua. 4, Dejar secar a temperatura ambiente. 5 . Observacién al microscopio con el abjetivo de 10X, 40X y 100x. (4)RESULTADOS. Después de haber realizado sus tinciones y la observaci6n de cada una de éstas, el alumno reportara: 1. Forma que presentan los microorganismos. 2. Agrupacién presente en estos microorganisms. 3. Un esquema de cada preparacién observada. ANALISSIS DE RESULTADOS, CONCLUSIONES CUESTIONARIO. Consultar la estructura molecular de 2 colorantes acidos y 2 basicos. z.Qué significa “fijar” el frotis y qué sucede durante este proceso? Menciona otros 2 métodos de fijacién. zCual es la importancia del aceite de inmersién? ~Qué importancia representa tefiir las extensiones? Anote las caracteristicas que debe reunir un frotis bien hecho. Método para preparar un frotis a partir de un medio de cultivo liquido. NOORONA Esquema de la preparaci6n de tin frotis y tincion simple. Sey Extender en forma Fina yueitorme. Secarai aie ‘Adicion coléronto Laver cin agua al) ease Footage suis ictmercen Yobsesaren st tie 100 liminar exceso de-agua REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS, [15]PRACTICA No.3 TINCION DIFERENCIAL DE GRAM. COMPETENCIA. Que el alumno aprenda a realizar la técnica de tincién de Gram. INTRODUCCION. La tincién diferencial es un método que permite clasificar y ubicar en un grupo particular las bacterias. La técnica de Gram, es la tincién diferencial mas empleada en bacteriologia. Este método fue desarrollado por el bacteridlogo danés Christian Gram en 1884, clasificando a las bacterias en dos grupos: Gram positivas y Gram negativas. FUNDAMENTO En las bacterias Gram negativas, el complejo del colorante cristal violeta y del yodo es liberado cuando una extencién-frotis- que ha secado, fijado y tefiido, es aclarada con un disolvente apropiado por ejemplo con alcohol-cetona En la tincién de Gram,el colorante es retenido por las bacterias Gram positivas, el colorante arrastrado por el disolvente se debe a diferencias en la estructura de la pared celular, las bacterias Gram positivas retienen el complejo y las Gram negativas no |o retienen. MATERIAL. COLORANTES Y CEPAS BACTERIANAS Porta objetos. Cristal violeta. Asa bacterioligica. Lugol. Mechero. Alcohol cetona Microscopi Safranina Aceite de inmersién. Cepa de bacteria gram negativa. Puente para tincién. Cepa de bacteria gram positiva, METODO. 1. Preparar el frotis. 2. Cubrir el frotis con cristal violeta durante 1 minuto. 3. Lavar el frotis con agua de la llave. 4, Cubrir el frotis con lugol durante 1 minuto. 5, Lavar el frotis con agua de la llave. 6. Decolorar con alcohol acetona de 5 a 10 segundos, 16)7. Lavar el frotis inmediatamente con agua de la llave. 8. Cubrir el frotis con safranina y dejarla durante 1 minuto. 8. Lavar el frotis con agua de la llave y dejar secar a temperatura ambiente. ACTIVIDADES. 1. Tefir por este método los frotis preparados. RESULTADOS, 1. Realizar esquemas de lo observado e iluminarlos. 2. Reportar las bacterias observadas: Gram positiva o Gram negativa. ANALISIS DE RESULTADOS CONCLUSIONES: CUESTIONARIO. 1. eCual és el fundamento de la tincién diferencial de Gram? 2. éCuadl es la funcién que desempefia el lugol en esta técnica 3. Con base a la técnica de tincién de Gram, como se llaman las bacterias que retienen el colorante primario. 4. Como se llaman las bacterias que se decoloran con alcohol-acetona y retienen el colorante de contraste. 5. Esoribir el nombre técnico (Género y especie), de 5 bacterias Gram positivas y 5 bacterias gram negativas. 6. Explicar: :Por qué algunos microorganismos Gram positivos, se hacen Gram negativos al envejecer? REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS, [7]PRACTICA No.4 ESTERILIZACION POR CALOR HUMEDO. COMPETENCIA El alumno conocerd y aplicara los diferentes métodos que se utilizan en el laboratorio para esterilizar diversos materiales. Ademas preparara adecuadamente materiales e instrumental para su esterilizacién y aprenderd a trabajar en ambiente aséptico. INTRODUCCION. En el contexto de la microbiologia, esterilizacién significa liberar el material de organismos contaminantes viables. Un requisito indispensable en los laboratorios de microbiologia, es que todo el material y los medios de cultivo, estén esterilizados y protegidos adecuadamente para conservar la esterilidad durante su uso y almacenamiento. Esto nos permite asegurar que se trabajara exclusivamente con los microorganismos en estudio o bien contenidos en la muestra alimenticia. Existen varios métodos de esterilizaci6n: METODOS QUIMICOS.- La destruccién de los microorganismos se lleva acabo por la aplicacion de un agente quimico. METODOS FISICOS.- La destruccién de los microorganismos se realiza a través de calor, radiacién y filtracién. METODOS BIOLOGICOS.- En los cuales la destruccién se lleva acabo por interferencia en los procesos vitales. La esterilizacién por calor es la mas frecuentemente usada en el laboratorio y esta puede realizarse por calor seco o calor htimedo. La esterilizacién por calor seco mata principalmente por oxidacién de las proteinas celulares y puede realizarse por: FLAMEO: La flama al rojo vivo de un mechero Fisher es adecuada para esterilizar asas y agujas. INCINERACION: Se recomienda para deshacerse de apésitos contaminados, papel y restos animales. En la actualidad éste método ya no se utiliza para evitar la contaminacién ambiental. HORNOS DE AIRE CALIENTE: La mayor parte del material de vidrio que puede resistir al calor se esterilizan mejor en el horno de aire caliente, por este método la temperatura mas usada es 160°C durante 60 minutos. (18)MATERIAL Y EQUIPO Autoclave, Hono. Mechero Fisher. Matraz erlenmeyer. Tubos de ensaye. Cajas de petri Asa bacteriolégica Pipetas de 1, 2 y 5m, Algodén, gasa, papel de estraza, masking tape. Cinta testigo, ACTIVIDADES: El alumno preparara el material para esterilizar, con base ala explicacién del profesor. CAJAS DE PETRIL- Después de lavadas y secadas se colocan con el cristalizador mas grande como base y se envuelven con papel, en grupos de 3 a 10 cajas. TUBOS DE ENSAYE.- Después de lavados y secos se coloca un tapén que puede ser de baquelita 0 algod6n. PIPET AS.- Ya limpias y secas se les hace un fitro de algodén (boquilla), quemar el exceso de algodén, se envuelve en papel de estraza y se le coloca cinta testigo. MATRACES.- Ya limpios y secos se les hace un tapén de algodén y gasa, el cual se cubre con papel (gorrito). ABATELENGUAS.- Se envuelven en papel. HISOPOS.- Se colocan dentro de un tubo de ensaye y se tapan con algodén. GASA y ALGODON.- Se cortan segtin el tamafio requerido y se envuelven con papel. Esteriliza el material siguiendo las instrucciones del profesor. Conectar un mechero y encenderlo; el area de seguridad que nos proporciona la flama del mismo, es de 30 cm, de diametro." Esterilizar por flameo el asa bacteriolégica, flamear la boca de los tubos después de destaparlos y antes de taparlos. (19)RESULTADOS. Realice los esquemas respectivos. ANALISIS DE RESULTADOS. CONCLUSIONES. CUESTIONARIO, 1. 10. zQué tipo de material se puede esterilizar en el Homo de calor seco y en el Autoclave? Citar ejemplos. Mencione qué gas se utiliza en la esterilizacion con gas. Investigue que es la tyndalizacién y la pasteurizacién. Elnvestigue cuales son los organismos que soportan temperaturas elevadas? Describe el método de esterilizacién por filtracién. En qué consiste la esterilizacién por radiacién? En qué se envuelven las pipetas que se van a esterilizar? Con qué fin se les coloca a las pipetas un filtro de algodén? £Como se verificaria que el material que se coloco en el autoclave esta estéril? zCual es la temperatura y tiempo que se requieren para lograr la esterilizacion en el horno de calor seco y el autoclave? REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS. (20)PRACTICA No.5 PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO. COMPETENCIA. EI alumno preparara los medios de cultivo y el material necesario para el andlisis microbiolégico de los alimentos. El alumno esterilizara los materiales antes mencionados en autoclave. INTRODUCCION. Los microbiélogos, pronto se dieron cuenta que podian hacer crecer numerosas bacterias en “caldos” obtenidos por coccién de tejidos animales o vegetales. En 1923 Mueller, intenta convertir estas necesidades nutritivas en una serie de compuestos especificos, llamados medios de cultivo. El cultivo de los microorganismos depende de sus requerimientos nutricionales, los cuales varian ampliamente; asi las bacterias autétrofas se pueden cultivar en medios sintéticos, en tanto que las heterétrofas para su crecimiento dptimo pueden necesitar nutrientes mas complejos como peptonas, extractos de carne y/ o levaduras que le Proporcionen vitaminas y otras sustancias promotoras del crecimiento. La calidad del trabajo microbiolégico en el andlisis de los alimentos se encuentra vinculada tanto con la idoneidad de los medios de cultivo que se utilizan, como de la limpieza del material de vidrio y/ 0 plastico que se requieren durante su preparacién yenvase. La preparacién de los materiales para su esterilizacién es fundamental para que después de este proceso se preserve su condicién de esterilidad hasta su uso. MATERIAL. Matraces erlenmeyer de 250 mi. Pizeta con benzal Tubos de ensayo de 16 x 150 ml. Cinta testigo Pipetas de 1 ml, Sml y 10 ml Franela Cajas de petri. Balanza granataria, Algod6n, gasa_y papel de estraza, Autoclave. Tijeras. Esponja Medios de cultivo Espatula (21)ACTIVIDAD PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO 1. Asegurarse de que el frasco que contiene el medio de cultivo este bien cerrado, no presente grumos y no esté hidratado. 2. Leer cuidadosamente las instrucciones del cultivo. 3. Calcular la cantidad del medio cultivo a preparar. Abrir el frasco y auxiliandose de una espatula, pesar la cantidad del medio. Transferir el medio de cultivo ya pesado a un matraz erlenmeyer de por lo menos el doble del volumen que se desea preparar. Adicionar el volumen de agua deseado, agitar vigorosamente y dejar reposar para iniciar su disoluci6n. (Usar agua destilada).. Calentar y agitar gradualmente hasta ebullicién de aproximadamente un minuto. (La solucién se hace mas translucida) 8. Distribuir el medio de cultivo de ser necesario en tubos de ensayo. 9. Esterilizar en autoclave 121°C, 15 libras de presién durante 15 minutos. 40.Siel medio de cultivo va ha ser transferido en cajas de petri, hacerlo en condiciones de esterilidad, colocar de 15 a 20 mL. a cada de estas evitando la formacién de burbujas. Tapar la caja inmediatamente. 11.Dejar solidificar a temperatura ambiente. 12.Los medios de cultivo preparados en placa, deben refrigerarse perfectamente en bolsas de polietileno, colocar etiqueta con el nombre del medio de cultivo y fecha de preparacién. (22)RESULTADOS ANALISIS DE RESULTADOS CONCLUSIONES CUESTIONARIO. 1. Anota la clasificacién de los medios de cultivo. 2. Anote la formula de tres medios de cultivo utilizados en microbiologia de los alimentos, 3. ePorque algunos medios de cultivo no requieren ser esterilizados? 4. gPorque los medios de cultivo se deben esterilizar en el autoclave? 5. Cudles son las ventajas de utilizar el agar como agente solidificante. 6. {Por qué se recomienda enfriar el medio de cultivo a 45°C antes de envasar en cajas petri? REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS. [23]PRACTICA No. 6 TECNICAS DE SEMBRADO Y AISLAMIENTO MICROBIANO. COMPETENCIA Que el alumno conozca, aprenda y realice las técnicas més utilizadas en los laboratorios de microbiologia de alimentos. INTRODUCCION. Cultivar un microorganismo significa promover intencionalmente el desarrollo de éste en _medios de cultivo, bajo condiciones controladas tales como: temperatura, anaerobiosis, aerobiosis y atmosfera parcial de co®, Para la siembra o aislamiento de bacterias se requiere preparar el area de trabajo aséptica, utilizando la técnica de sembrado segtin el propésito que se persiga. Técnicas de sembrado en tubo: Técnicas de sembrado en placa: 4. Picadura. 1. Estria masiva, 2. Estria recta. 2. Estria simple 3. Estria ondulada. 3. Estria cruzada. 4. Por contacto. 4. Inoculacién con pipeta. MATERIAL. Cajas de petri con medios de cultivo. Cepas bacterianas. Asa bacteriolégica. Mechero fisher. Pizeta con benzal. Esponja, Nota: Por equipo traer cerillos y marcador para CD (24)Ss Stieetar Semana] dL See . ACTIVIDADES. El alumno aplicaré el método de estria cruzada de acuerdo a la siguiente técnica. 1. 2 Marca la base de la caja de petri donde se depositara el inoculo y donde iniciara la serie de estrias. ‘Tomar una asada de la muestra y colocar en el medio de cultivo, haciendo estrias continuas hacia el centro de la placa. Esterilizar el asa nuevamente y enfriarla en la zona de enfriamiento. Hacer una segunda serie de estrias, tocando la porci6n final de la anterior estria. Esterilizar el asa nuévamente y enfriar en la zona de enfriamiento. Repetir los pasos 4 y 5 hasta que la placa quede totalmente cubierta. Esterilizar el asa e incubar las placas a la temperatura adecuada segti'el tipo de microorganismo. Anotar fecha, grupo y equipo en cada uno de los medios de cultivo. [25]RESULTADOS. En su reporte esquematice como se realizé la técnica de sembrado por estria cruzada. ANALISIS DE RESULTADOS. CONCLUSIONES. CUESTIONARIO. 1.- Describa la diferencia entre un cultivo puro y cultivo mixto. 2. Esquematice las distintas técnicas de sembrado en medios de cultivo en tubo. 3.- Esquematice las distintas técnicas de sembrado en medios de cultivo en placa. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS. (26]PRACTICA No.7 MORFOLOGIA COLONIAL. COMPETENCIA El alumno aprenderd a conocer las caracteristicas de crecimiento de algunos microorganismos en un medio de cultivo sélido; la morfologia colonial, ya que esta constituye una etapa muy Util en la identificacién de los principales grupos de microorganismos. INTRODUCCION: Los microorganismos tienden a formar agrupaciones en medios de cultivo sélido se denominan colonias. Las colonias desarrollan en forma muy caracteristicas de acuerdo con el medio de cultivo ensayado, la temperatura de incubacién y el microorganismo, por lo que su estudio es de gran utilidad en la clasificacién, como en la identificacin. Una colonia microbiana ésta constituida por individuos de la misma especie provenientes de una célula o un grupo de ellas llamados unidad formadora de colonias (UFC). Las caracteristicas consideradas para la descripcién de la morfologia colonial de las bacterias son: 4, Tamafio: se mide en milimetros y puede variar desde colonias extremadamente pequefias hasta aquellas que llegan a medir 10 mm. o mas. Algunas especies bacterianas pueden extenderse en toda la superficie del agar. 2. Color: pueden ser muy variados los colores. 3. Forma: puntiforme, circular o irregular. 4, Bordes: pueden ser enteros o mostrar lébulos, filamentos © proyecciones como dientes de sierra o enrollados. 5. Elevacién: Las colonias pueden ser planas, convexas, pulvinadas, embonadas y umbilicadas. 6. Superficie: Puede ser lisa, rugosa o granular. 7. Aspecto: Htimedo 0 seco. 8. Luz reflejada: Brillante o mate 9. Luz transmitida: Transparente, translucida u opaca. 27)10.Consistencia: Suave (butirosa, mucoide o friable) y dura. Esta caracteristica se determina tocando la colonia con el asa bacterioldgica, y por lo tanto debe ser la ultima en describirse. 41.Produccién de pigmento: Algunas bacterias que producen pigmento que pueden difundir en todo el medio. MATERIAL. Mechero. Asa bacteriolégica. Medios de cultivo con desarrollo bacteriano. Pizeta con benzal Esponja ACTIVIDADES. 1. Revisar bibliografia, y dibujar las diferentes caracteristicas morfolégicas de las colonias bacterianas. .. Describir la morfologia colonial anotando las caracteristicas de cada uno de los medios de cultivo que se sembraron. 3. Realizar técnica de Gram. RESULTADOS. En su cuademo de reporte de practicas, anota la morfologia colonial de cada uno de los microorganismos problema. ANALISIS DE RESULTADOS. CONCLUSIONES: (28]CUESTIONARIO. 1. élnvestigue en qué consiste el fenémeno de swarming? 2. {Por qué se incuba a 37°C la mayoria de los cultivos bacterianos? 3. zInvestigue algunas de las caracteristicas de la morfologia colonial de: Mvcobacterium_ tuberculosis y Haemophvlus influenzae. Morfologia colonial en placa Elevacion wea ayo. Convexa Elevada Puntiforme eX one SF Pulvinada Apianada Alargada irreguiar = ae oo Circular Filamentosa Umbondds 229]BORDE rN PSs Entero Ondulada f - Te | ea, Estreliada Festoneada Lobulada Filamentosa REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS. (30)PRACTICA No. 8 PRUEBAS BIOQUIMICAS. COMPETENCIA Qué el alumno conozea y utili identificacién microbiana, algunas de las pruebas bioquimicas _utilizadas en la INTRODUCCION: EI requisito mas importante para la identificacién de un microorganismo, es que el cultivo sea puro, no podemos realizar pruebas de identificacién de cultivos mixtos 0 mezclados. Ya que aun colonias tomadas o seleccionadas de medios altamente selectivos pueden no ser puros, el medio selectivo puede inhibir, pero no matar las bacterias subyacentes de un tipo diferente. Una vez que se obtiene un cultivo puro, la identificacién es un procedimiento relativamente simple que se basa en la determinacién de las caracteristicas mas tipicas y faciles de demostrar. El numero de caracteristicas que se identifique varia segtin el tipo de microorganismos. En algunas circunstancias algunas bacterias pueden identificarse en su género apropiado por algunas caracteristicas fundamentales (ejemplo: Una bacteria gram negativa con prueba de oxidasa positiva, pigmento verdoso, olor a nixtamal, es obviamente una Pseudomona ) El sistema idéneo pera clasificar un microorganismo es el siguiente: 1. Examinar su morfologia colonial y sus caracteristicas de crecimiento en los diferentes medios de cultivo, si producen algtin pigmento, si producen hemédlisis; que tipo. 2. Observar sus caracteristicas de morfologia celular y las tintoriales; si son cocos 0 bacilos. Gram positivos 0 negativos. 3. Utilizar pruebas bioquimicas, las cuales son caracteristicas de cada familia de bacterias. 4, Y finalmente cuando se consideré necesario realizar las pruebas serolégicas. BYMATERIAL Mechero fisher, Asa bacteriolégica. Pizeta con benzal. Esponja. Medios de cultivo con desarrollo bacteriano. Medios de cultivo para pruebas bioquimicas. . Agar de hierro y triple azticar o agar de kligler. Medios de SIM 0 Medios de MIO. Medios de MR-VP. Caldo urea. Agar citrato de Simmons, Fenilalanina. Medios de LIA. Lapices de colores Marcador para CD ACTIVIDADES. De los cultivos sembrados con anterioridad, seleccionar una colonia aislada, sembrarla (con el asa bacteriolégica) en las diferentes pruebas bioquimicas siguiendo las instrucciones del profesor. RESULTADOS. Realice esquemas de las pruebas bio tenian originalmente, Haga esquemas correspondientes de las diferentes pruebas después de haber sido sembradas e incubadas. Anote en forma de tabla los resultados de las. las tablas de identificacién, Anote que microorganismo identificé con las pruebas bioquimicas. Investigue y escriba en su cuaderno de reportes la formula de los diferentes medios de cultivo para pruebas bioquimicas. \quimicas utilizadas, indicando el color que pruebas bioquimicas y compérelas con (32)ANALISIS DE RESULTADOS, CONCLUSIONES. CUESTIONARIO: 1. Qué es un carbohidrato? 2. {De las pruebas bioquimicas utilizadas, cuales utilizan fundamentalmente carbohidratos? 3, gMencione cual es la razén de afiadir, indicadores acido-base a las pruebas bioquimicas? 4, Qué es una prueba enzimética? 5, Investigue Por qué en la prueba bioquimica de Agar de Hierro y Triple Azdcar la prueba de glucosa se lee en el fondo del tubo y la de la lactosa se lee en la superficie? REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS. 83)PRACTICA No. 9 RECUENTO DE MICROORGANISMOS MESOFILICOS COMPETENCIA. El alumno realizara el recuento de bacterias mesofilicas aerobias utilizando el método de extensi6n en placa, a partir de una muestra de alimento. INTRODUCCION. Se -designa como organismos mesofilicos aerobios, a todos aquellos microorganismos capaces de crecet entre 20 y 37 °C dentro de los que se encuentran bacilos, cocos gramnegativos y grampositivos, aislados o agrupados. El recuento de bacterias mesofilicas no pone en evidencia a todos los microorganismos presentes en el alimento estudiado ya que las diversas especies tienen necesidades nutricionales particulares y, por tanto el numero de colonias contadas constituyan una estimacién relativa de la cifra realmente presente, sin embargo puede llegar a proporcionar resultados relevantes. La presencia de estos microorganismos en alimento son indicadores de: 1. La probable presencia de microorganismos patégenos. 2. El posible valor comercial de un alimento. Las condiciones higiénicas en las que ha sido elaborado y manejado el producto. La eficiencia de un proceso de pasteurizacién, desinfeccién o preservacién. Para predecir la vida de anaquel de un producto alimenticio. BayMATERIAL, EQUIPO. 6 Placas con Agar Cuenta Standar Gradilla 1 Pipeta de 10 mL. Mechero Fisher 2 Pipetas de 5 mL Pizeta con benzal 3 Pipetas de 1 mL Esponja 4 Tubos con 9m de solucién salina Contador de colonias. 3 Varillas de vidrio, PROCEDIMIENTO: Para muestras liquidas. 1. Homogeneizar las muestras. 2. Transferir 10 ml de la muestra a un frasco con 90 ml de solucién salina estéril, con la ayuda de una pipeta de 10 ml estéril (dilucién 10-1 ) 3. Transferir de esta dilucién (10-1) {ml a otro tubo con 9 mi de solucién salina estéril y homogeneizar (dilucién 10-2) 4, Efectuar otra vez el paso anterior para obtener una tercera y cuarta dilucién. 5. Depositar de las tiltimas 3 diluciones 0.1 ml sobre la superficie de la placa por duplicado. 6. Extender con la varilla de vidrio el inoculo en toda la superficie de la placa. 7. Utilizar una varilla para cada dilucién. 8. Dejar las cajas a temperatura ambiente durante 15 minutos, e incubar en posicién invertida durante 48 horas a una temperatura de 35°C. 9. Seleccionar las placas para la cuenta de las colonias. 10.Multiplicar la cuenta obtenida por 10 y por la inversa de la dilucién correspondiente. D5]RESULTADOS: 1. Realice los esquemas correspondientes. 2. Anote los calculos y la forma en que obtiene sus resultados. ANALISIS DE RESULTADOS. CONCLUSIONES. CUESTIONARIO: 1. Porque es recomendable que la primera dilucién se lleve a cabo con 90ml de diluyente. 2, Porque hay que usar una pipeta diferente para cada dilucién. 3. Porque se deben reportar UFC/ml y no bacterias/mi. 4. Que desventajas encontré en la realizacin de esta técnica. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS, (36)PRACTICA No. 10 | RECUENTO DE MICROORGANISMOS COLIFORMES. COMPETENCIA Los alumnos realizaran el recuento de bacterias coliformes totales, utilizando el método de vaciado en placa a partir de una muestra de alimento y al término de la practica el alumno sera capaz de interpretar la presencia de estos microorganismos en los alimentos. INTRODUCCION Los organismos coliformes son bacilos gramnegativos, no esporulados, aerobios 0 anaerobios facultativos, que fermentan la lactosa con produccién de gas, dentro de las 48 horas de incubacién a una temperatura de 35°C. Las especies de microorganismos que pueden encontrarse con estas condiciones son Escherichia coli, Escherichia freundi_, Enterobacter aerogenes, Enterobater_clocae, Klebsiella pneumoniae y Citrobacter sp. El grupo de organismos coliformes es utilizado en la microbiologia de los alimentos como indicador de contaminacién fecal en agua, hielo, alimentos sometidos a procesos térmicos y eficiencia de practicas higiénicas entre otras. Para la cuenta de coliformes totales por la técnica de vaciado en placa, se requiere de una serie de diluciones de la muestra y de cada dilucién se depositan alicuotas en cajas de petri estériles, sobre estas se adiciona el medio de cultivo de agar bilis rojo violeta y se incuban a 35°C. La lectura en estas placas se lleva a cabo a las 24 horas y se cuentan las colonias rojas obscuras mayores de 0.5 mm. MATERIAL EQuiro 6 Cajas de petri estériles Gradilla 4 Pipeta de 10 mL Mechero 2 Pipetas de 5 mL Pizeta con benzal 3 Pipetas de 1 mL Agar bilis rojo violeta 4 Tubos con 9 mL. de solucién salina Esponja Contador de colonias Balanza granataria Espatula Estufa bacteriolégica B7PROCEDIMIENTO: Para muestras liquidas. 1 2 Homogeneizar las muestras: ‘Transferir 10 mL de la muestra a un frasco con 90 mL de solucién salina estéril, con la ayuda de una pipeta de 10 mL estéril (dilucién 10-1) Transferir de esta dilucién (10-1) 1 ml a otro tubo con 9 mL de soluci6n salina estéril y homogeneizar (dilucién 10-2 ) Efectuar otra vez el paso anterior para obtener una tercera dilucién. Depositar por duplicado 1 mL de las diluciones anteriores en cajas de petri estériles. Agregar a cada caja de petri de 15 a 20 mi de medio agar bilis rojo violeta fundida y mantenida a 45°C en bafio maria. Incorporar el inoculo al medio de cultivo por rotacién de la caja petri sobre una superficie lisa. Dejar solidificar y rotular. Incubar los medios a 37°C de 24 a 72hrs. Contar las colonias rojas y reportar. INFORME: . Realice los esquemas correspondientes. Anote los cailculos y la forma en que obtiene sus resultados Anote sus conclusiones con respecto a la presencia del total de microorganismos en cada una de las muestras de alimento analizadas. (38)CUESTIONARIO: 1. Aque se debe el color rojo de las colonias de los coliformes. 2. Que otros medios de cultivo existen para determinacién de coliformes. 3. Qué diferencia existe entre coliformes totales y fecales. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS. 9)PRACTICA No 11 CUANTIFICACION DE HONGOS y LEVADURAS COMPETENCIA Los alumnos realizaran el recuento de hongos y levaduras en alimentos asi como su interpretacién de la presencia de estos microorganismos. INTRODUCCION. Los hongos tienen caracteristicas que los hacen diferentes a las bacterias porque son organismos eucaridticos, entre los que se encuentran los mohos y levaduras, por esta razén la velocidad de crecimiento es més lenta, la necesidad de condiciones de aerobiosis, la temperatura de crecimiento es inferior a las de las -bacterias mesofilicas, la tolerancia notable para desarrollarse en medio Acido, la resistencia para desarrollarse en presencia de varios antibidticos, la formacién de colonias mayores a la de las bacterias y la tendencia de algunas especies de desarrollarse extensivamente. La importancia en la determinacién de hongos y levaduras en los alimentos radica, que un porcentaje elevado se asocia a practicas higiénicas deficientes del proceso 0 almacenamiento de alimentos ademas producen toxinas ( aflatoxinas) que afectar al hombre y animales. MATERIAL, EQUIPO 2 Placas con agar de dextrosa—_Estufa bacteriologica 1 Gradilla 1 Pipeta de 10 mL ‘1 Mechero 2 Pipetas de 5 mL 3 Pipetas de 1 mL 4 Tubos con 9 mL de solucién salina Pizeta con benzal Esponja (40)PROCEDIMIENTO: Para muestras liquidas. 1. ca Homogeneizar las muestras. Transferir 10 mL de la muestra a un frasco con 90 mL. de solucién salina estéril, con la ayuda de una pipeta de 10 mL estéril (dilucién 10-1). Transferir de esta dilucién (10-1) 1mL a otro tubo con 9 mL de solucién salina estéril y homogeneizar (dilucién 10-2) 4. Efectuar otra vez los pasos anteriores para obtener una tercera y cuarta dilucién, 5. Sembrar utilizando la técnica de extensién en placa en los medios de cultivo de agar papa y dextrosa. 6. Incubar las placas a una temperatura adecuada para el desarrollo de hongos. ACTIVIDADES: 41. Realice los esquemas correspondientes. 2. Anote los célculos y la forma en que obtiene sus resultados 3. Anote sus conclusiones con respecto a la presencia del total de hongos en cada una de las muestras de alimento analizadas. fay)CUESTIONARIO: 1. Anote tres medios de cultivo que se utilizan para el desarrollo de hongos. 2. Cuales son las temperaturas mas adecuadas para el desarrollo de mohos y levaduras. 3. Escriba el nombre de 3 alimentos a partir del los que se aisla mohos y levaduras. REFERENCIAS BIBILIOGRAFICAS. (42)PRACTICA No.12 ANALISIS MICROBIOLOGICO DEL AGUA COMPETENCIA INTRODUCCION: La importancia sanitaria del agua se determina por la presencia de microorganisms patégenos que potencialmente emplean el agua como vehioulo de diseminacién, principalmente bacterias intestinales, siendo utiizada como medio de eliminacion de excretas y otros desechos; pueden también contener microorganismos patégenos de asiento no intestinal como por ejemplo; flora de la piel. Ambos tipos de gérmenes son destruidos por el proceso ordinario de potabilizacién El control sanitario del agua se realiza en funcién de las bacterias intestinales, £2 investigacién de bacterias enteropatégenas como medio para establecer la potabilidad del agua consfituye la medida mas acertada, MATERIAL EQUIPO 6 Cajas de petri Canastilas metélicas Pipetas de imL., Smi. y 10m! Mechero fisher 7 Tubos de fermentacion Estufa bacteriol6gica 7Campanas de fermentacion Contador de colonias Tijeras Balanza granataria Frasco con benzal Esponja 6 Algodén Papel de estraza Medios de cultivo Agar triptona Caldo lactosado Cuenta esténdar Asa bacteriolégica Caldo verde brillante Maskin tape (43]PROCEDIMIENTO: A) RECUENTO DE BACTERIAS MESOFILICAS AEROBIAS. PENS 5, Inocular por duplicado 1 mL. De cada muestra de agua en las cajas de petri Adicionar de 12 a 15 mL. de Agar triptona extracto fundido a 44°C. ,Incorporar el inéculo al medio y homogenizar. Dejar solidificar e incubar a 37°C durante 24 horas. Contar las colonias desarroliadas y reportar en cada caso la media de las dos placas inoculadas. B) PRUEBA PRESUNTIVA, 1. Inocular 10 mL. de muestra en cada uno de 5 tubos de fermentacién con caldo lactosado de doble concentracién. Un tubo con tml. de muestra y uno con O.1mi. en tubos de concentracién sencilla, Incubar a 35°C -37°C durante 48:t 3 horas. Observar cuidadosamente en cada tubo la presencia de gas en cualquier cantidad dentro de la campana de fermentacién. El tubo posilivo mostraré ademas denso desarrollo bacteriano. La ausencia de gas en los tubos hace negativa la prueba, PRUEBA CONFIRMATIVA, i ‘Transferir individualmente de cada tubo positive de 2 a 3 asadas del cultivo @ un tubo de fermentacién con caldo verde brillante bilis 2% Incubar a 36°C -37°C durante 48+ 3 horas. La formacién de gas en cualquier cantidad dentro de la campana, hace positiva fa prueba. Determinar el NMP de organismos coliformes en la muestra de acuerdo con la tabla numero dos. (44)ACTIVIDADE! 1. Realice los esquemas correspondientes. 2. Anote los cdlculos y la forma en que obtiene sus resultados 3. Anote sus conclusiones con respecto a la presencia de microorganismos en cada una de las muestras analizadas. CUESTIONARIO: 4. El agua es un excelente vector de contaminacién, escriba el nombre de cinco microorganismos que pueden encontrarse en el agua y sean patégenos para el hombre. 2. Escriba la forma correcta de tomar una muestra de agua para el andlisis microbiolégico. REFERENCIAS BILIOGRAFICAS. [45]VILAPENDICES Obtencién de Cultivo Puro ~ Estoril 3 Tocar suavomonta 4, tnocalar la svportie do olseay, onl ac la calecia Soar hefnada tac ariba oj enar ‘soleclonada. Waraado exvia. Fuasoar eae tnesbt Otras Técnicas De Aislamiento En Placa ao SleMmErd DE SUPERFICIE "EN PLACA. => S&S 2 _@ itinn apelin anweyt we. aumssrgisen, amressree, © ag SIEMBRA POR cotrinase Cetrien mas Soe Se la i! race medio esér SS Se tae ompes eee acon! Ressadb Upcods slant [46]APENDICE “A” PREPARACION DE COLORANTES Y REACTIVOS |, TINCION SIMPLE. a) Safranina. Safranin: Agua destilada. Preparacién: Disolver el colorante en el agua. b) Cristal violeta. Cristal violeta, ‘Agua destilada. Preparacion: Disolver el colorante en el agua. c) Azul de metileno. Azul de metilen Etanol de 96%. Agua destilada, 3mL 20 mL. 100 mL Preparacion: * Disolver el colorante en alcohol. + Agregar el agua y filtrar. Il. TINCION DE GRAM. a) Cristal violeta y oxalato de amonio. (Reactivo de Hucker) Solucién A: Cristal violeta (bureza del colorante de por lo menos, el 90%). Etanol (95%).. b) Solucién de yodo yodurado. (Lugol) Yodo (quimicamente puro). Yoduro de potasio. Agua destilada...... (47Preparacién: * Combinar el yodo y el yoduro de potasio con la ayuda de un mortero. + Lavar el contenido de éste con pequefias alicuotas de agua destilada. + Agregar agua suficiente para obtener un total de 300 mL. + Agitar fuertemente. + Almacenar la solucién en una botella oscura y con tapén de vidrio. c) Alcohol acetona. . 500 mL .- 300 mL Mezclar los ingredientes respectivos de cada combinacién para su uso. d) Safranina. Safranina (pureza del colorante, 90%)....... 0.25 g Alcohol etilico (95%)... 410 mL Agua destilada... 1000 mL Preparacién: * Disolver el colorante en el alcohol. * Agregar el agua destilada. © Filtrar. * Almacenar en frasco con tapén de vidrio. Ill. TINCION DE ESPORAS. (Método de Schaeffer y Fulton) a) Verde de malaquita al 5%. Verde de malaquita 5g Agua destilada. . 100 mL. Preparacién: * Disolver el colorante en el agua y dejar en reposo durante una hora y media. + Filtrar. * Guardar en frasco oscuro, b) Safranina al 0.5%. Safranina..... Agua destilada. 0.59 100 mL Preparacién: + Disolver el colorante y filtrar. * Disolver el colorante en el agua [48]VI. LACTOFENOL AZUL DE ALGODON. Agua destilada... 20.0 mL Cristales de fenol Q. P.. 20.0 Acido lactico. 20.0 mL Glicerina.... 20.0 mL Azul de algodén.. .. 0.05 g Preparacién: * Disolver el fenol en el agua. * Agregar el acido y la glicerina. * Calentar a 70°C. * Adicionar el colorante, * Guardar en frasco de vidrio. APENDICE “B” PREPARACION DE SOLUCIONES Y REACTIVOS 1. AGUA DE DILUCION CON SOLUCION BUFFER. Solucién | * Disolver 34 g de fosfato monobdsico de potasio (KH20PO4) en 500 mL de agua destilada. + Ajustar el pH a 7.2 con NaOH 1N. + Aforar a un litro con agua destilada. Solucién Il Disolver 50 g de sulfato de magnesio (MgSOs.7Hz0) en 1000 mL de agua destilada. Preparacion: + Enun matraz volumétrico afiadir 1.25 mL de la solucién | y 5 mL de la Il, + Aforar a un litro con agua destilada. 2. VOGES PROSKAUER. A. Solucién de alfa naftol Alfa naftol Alcohol etilico (95%). ve 5.0.9 cbp 100 mL Preparacin: [49]Disolver el alfa naftol en el alcohol. B. KOH Hidréxido de potasio quimicamente puro. Creatina. Agua destilada, 40g 0.3g . cbp 100 mL Preparacion: + Agregar el hidréxido de potasio a 75 mL de agua destilada, agitando y enfriando constantemente. Cuando la solucién esta mas 6 menos a temperatura ambiente (25 °C) agregar la creatina y suficiente agua destilada para obtener un volumen final de 100 mL. 3. REACTIVO DE ROJO DE METILO. Rojo de metilo 01g Alcohol etilico (95%), 250 mL Agua destilada 250 mL Preparacion: Disolver el colorante en el alcohol. Agregar el agua destilada. Filtrar la preparacion. 4. REACTIVO DE KOVAC, Para-dimetil-amino-Benzaldehido...... Alcohol amilico 6 butilico. Acido clorhidrico quimicamente puro. Preparacion: © Disolver el para-dimetil-amino-benzaldehido en alcohol butilico 6 amilico. Afiadir el Acido clorhidrico. Conservar en un frasco ambar con tapon de vidrio, en sitio oscuro. También se sugiere que esta solucién se refrigere. NOTA: El reactivo debe tener una coloracién amarillo claro 6 café claro. 6. SOLUCION SALINA. Cloruro de Sodio... 8.59 Agua destilada... cbp 1000 mL Preparacién: * Disolver el componente en aproximadamente 950 mL. de agua. + Aforar a 1000 mL. con agua destilada. + _Distribuir en voltimenes convenientes. * Esterlizar en autoclave durante 15 minutos a 15 libras de presién (121 °C). (50)BIBLIOGRAFIA 1.-Frazier, W. L. (2003). MICROBIOLOGIA DE LOS ALIMENTOS. 4" ed Ed. Acribia. Zaragoza, Espafia 2.-Mac Faddin (1991). PRUEBAS BIOQUIMICAS PARA LA IDENTIFICACION DE BACTERIAS DE IMPORTANCIA CLINICA. Ed. Panamericana, México 3.-Pascual Anderson, M. R., y Calderén y Pascual V. 2000. Microbiologia Alimentaria. Metodologia Analitica para Alimentos y Bebidas. 2* Edicién. Editorial Diaz de Santos S.A. Madrid, Espafia. 4.-COLES, R.; McDOWELL, D.; KIRWAN, M.J. (2004). Manual del envasado de los alimentos y bebidas. 5.-Corrie Allaert Vandevenne,Martha Escala Rebes. Métodos de Analisis Microbioldgico de Alimentos. Editorial Diaz de Santos Afio 2002. 6.-D.A.A Mossel,Benito Moreno Garcia Microbiologia de los Alimentos Editorial: Acribia,S.A. 2002 Gy